Het doel van dit protocol is om middels door middel van elektronenparamagnetische resonantie (EPR) begeleide redox titraties verschillende cofactoren van Saccharomyces cerevisiae Nar1 te identificeren. Redox titraties bieden een zeer robuuste manier om midpoint potentials van verschillende redox actieve cofactoren in enzymen en eiwitten te verkrijgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
EPR Bewaakte redoxtitratie van de Cofactoren van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Elektronen paramagnetische resonantie (EPR) bewaakt redoxtitraties een krachtige methode om het middelpunt potentieel van cofactoren bepalen eiwitten en de cofactoren in hun detecteerbare redoxtoestand identificeren en te kwantificeren.
De techniek is complementair aan direct elektrochemie (voltammetrie) benaderingen, aangezien het geen informatie over elektronoverdrachtsnelheden bieden, maar de identiteit en redox toestand van de cofactoren vestigen in het eiwit onder studie. De techniek is algemeen toepasbaar op elk eiwit dat een elektron paramagnetische resonantie (EPR) detecteerbaar cofactor.
Een typische titratie vereist 2 ml eiwit met een cofactor concentratie in het gebied van 1-100 uM. Het eiwit wordt getitreerd met een chemisch reductiemiddel (natriumdithioniet) of oxidatiemiddel (kaliumferricyanide) om het monster op een bepaalde potentiële poise. Een platina draad en een Ag / AgCl referentie-elektrode verbonden met een voltmeter om het potentieel van de eiwitoplossing te meten. Een set van 13 verschillende redox mediatoren wordt gebruikt in evenwicht tussen de redox cofactoren van het eiwit en de elektroden. Monsters worden getrokken op verschillende potentialen en Electron Paramagnetische Resonantie spectra, kenmerkend voor de verschillende redox cofactoren in het eiwit worden bepaald. De plot van de signaalintensiteit versus monster potentiaal geanalyseerd met de Nernst-vergelijking om het middelpunt potentieel van de cofactor bepalen.
Inleiding
Opvallend is dat de meest fundamentele chemische processen instandhouding van het leven op deze planeet, fotosynthese, stikstoffixatie en ademhaling, worden gekatalyseerd door grote eiwitcomplexen met een breed scala van organische en anorganische redox co-factoren. Er wordt geschat dat ongeveer 30% van alle eiwitten één of meer metalen cofactoren. 1,2 identificeren en karakteriseren van de redox cofactoren kan worden vastgesteld met directe elektrochemie (bijvoorbeeld proteïne film voltammetrie) of redoxtitraties. De twee technieken zijn complementair in hun aard en toepasbaarheid. Voltammetrie biedt een snelle bepaling van middelpunt potentialen en elektronoverdracht kinetiek van cofactoren die kunnen reageren met een elektrodeoppervlak. 3,4 Gewoonlijk werkt dit goed voor elektronen transporterende eiwitten zoals cytochroom c of ferredoxine. En het werkt soms meer complexe eiwitten die zijn geïmmobiliseerd aan een elektrodeoppervlak. Gedetailleerde kennis van deaard van cofactoren in het eiwit beschikbaar zijn, aangezien de voltammogram directe informatie over de identiteit van de cofactor niet geven. Redoxtitraties zijn meer bewerkelijk om uit te voeren en vereisen mg hoeveelheden eiwit. Echter, ze bieden informatie over het middelpunt potentieel en de identiteit van de cofactor. 5 Voorts in één titratie meerdere cofactoren in een eiwit kan worden gemeten.
Het principe van een redox titratie dat de redox actief eiwit of enzym chemisch wordt gereduceerd of geoxideerd. Om ervoor te zorgen dat de co-factoren reageren met de reductor of oxidator redox bemiddelaars worden gebruikt. Deze redox mediatoren ook reageren met een elektrode, zodat de potentiaal van de oplossing kan worden gemeten. De bemiddelaars als een redox buffer en evenwicht tussen de cofactoren in het proteïne en de elektrode. Na chemisch poising het potentieel om de gewenste waarde wordt een monster getrokken en snel in vloeibare stikstof ingevroren await verdere analyse met spectroscopische technieken. EPR spectroscopie is bijzonder nuttig in dit opzicht kan worden gebruikt om kwantitatief meten paramagnetische metaal centra of organische radicalen.
De redox-titratie kan worden uitgevoerd in twee richtingen: van laag naar hoog of van hoog naar laag middelpunt potentieel. De keuze is afhankelijk van de stabiliteit van de cofactoren onder studie. Vaak is het verstandig om te beginnen op een laag potentieel en voeg oxidant stapsgewijs verhogen van het potentieel. Dit wordt een oxidatief titratie en wordt hier beschreven. Hier laten we de redox-titratie van de ijzer-zwavel cluster bevatten eiwit Nar1 uit Saccharomyces cerevisiae. Dit eiwit is betrokken, waarschijnlijk als een scaffold eiwit, in het cytosol ijzer-zwavel cluster biosynthetische machines (CIA-route). 6,7
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de Setup en oplossingen
- Bereid bufferoplossing met 100 mM Tris, 250 mM NaCl en 10% glycerol bij pH 8,5. Ontluchten van de buffer door te spoelen met argon. Introduceren de buffer in een anaërobe kamer.
- Verdeel de buffer in twee porties. Om één portie (buffer A) voeg 1 mM DL-dithiothreitol (DTT, M r 154,25 g / mol) en 1 mM L-cysteïne. Het andere deel (buffer B) niet bevat reducerende middelen.
- Bereid oxidant en reductant oplossingen. Voeg 1 ml oplossing van 2, 20 en 200 mM kaliumferricyanide (FIC, M r 329,26 g / mol) en natriumdithioniet (SD, M r 174,11 g / mol) in anaërobe buffer B.
- Bereid mediator mix als volgt:
- Voeg 160 uM van elk van de volgende redox mediatoren en 50 mM NaCl buffer B: N, N, N ', N'-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD, M r 237,17 g / mol, E' 0 0,276 V) , 2,6-dichloorfenol indofenol-(DCIP, M r 290,08 g / mol, E '0 0,217 V), fenazine ethosulfaat (PES, M r 334,4 g / mol, E' 0 0,055 V), Methyleenblauw (M r 319,85 g / mol, E ' 0 0,011 V), Resorufin (Mr 235,17 g / mol, E '0 -0,051 V), Indigodisulphonate (Mr 466,35 g / mol, E' 0 -0,125 V), 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone ( Mr 174,15 g / mol, E '0 -0,145 V), anthrachinon-2-sulfonaat (Mr 328,28 g / mol, E' 0 -0,225 V), Phenosafranin (Mr 322,8 g / mol, E '0 -0,252 V), safranine O (Mr 350,84 g / mol, E '0 -0,280 V), neutraal rood (Mr 288,8 g / mol, E' 0 -0,340 V), benzyl viologen (Mr 409,4 g / mol, E '0 -0,350 V) en methylviologeen (M r 257,16 g / mol, E' 0 -0,440 V).
- Wikkel de fles in aluminiumfolie om de mediator te beschermens tegen licht.
- Bereid 10 mg / ml S. cerevisiae-Strep tag Nar1 eiwit (181 uM, M r 55,2 kDa) in buffer A. Express S. cerevisiae Nar1 in E. coli als een strep-gelabeld eiwit met een pET24a expressievector. Zuiveren van het eiwit in een anaërobe kamer met behulp van Strep-Tactin chromatografiemedia (IBA) en zuiveren met behulp van een eiwit zuivering systeem zoals Akta zuiveraar (GE Healthcare).
- Bereid de redox titratie opstelling in een anaërobe kamer als volgt:
- Sluit een Ag / AgCl referentie-elektrode en een platina draad elektrode naar de titreervat. Sluit beide elektroden aan een voltmeter die kan meten van mV tot V.
- Steek een kleine roerstaaf.
- Plaats de titratie vat boven een magnetische roerder.
- Vul het titreervat met buffer B, mediator mix oplossing en eiwitoplossing tot 2 ml, dwz eindconcentraties van 72 uM eiwit en 38 uM van elkmediator. Opmerking: Afhankelijk van de eiwitconcentratie en de vereiste mediator concentraties de hoeveelheden van de drie oplossingen worden aangepast.
- Roer gedurende 30 minuten en schakel de voltmeter.
- Bereid 10 schone kwartsglas EPR buizen. Introduceer de buizen in de anaërobe kamer.
- Vul een kleine (ongeveer 200 ml) vloeibare stikstof dewarvat met vloeibare stikstof.
2. Voer redoxtitratie
- Wacht tot de potentiaal van de oplossing stabiel. Opmerking: In de praktijk betekent dit dat de potentiële afwijkingen kleiner dan 1 mV per minuut.
- Noteer de mogelijkheden die door de voltmeter.
- Trek het eerste monster van 200 ul en injecteer in een EPR buis.
- Dop op de buis met een rubberen stop en verwijder de buis uit de anaërobe kamer.
- Bevries de buis in vloeibare stikstof als volgt: Let op! Dit moet langzaam gebeuren, anders wordt de buis zal breken.
- Steek eerst de tip van de buis in de vloeibare stikstof.
- Wacht tot er een sissend geluid te horen is. Opmerking: Dit kan tot 10 sec.
- Langzaam steek de rest van de buis, zodat het monster deel volledig is ondergedompeld.
- Voeg een kleine hoeveelheid 1-2 pl van 2 mM SD-oplossing aan de oplossing in het titreervat het potentieel van de oplossing te verlagen tot -0,6 V.
Opmerking: Als er meer dan 10 gl toegevoegd te worden, overschakelen naar de 20 mM oplossing. Omdat het moeilijk om poise tot een bepaalde potentiële waarde, worden de werkelijke waarden die op de voltmeter opgeschreven en gebruikt om de titratiecurve construeren. - Teken een monster zoals beschreven in stap 2,3-2,5.
- Noteer de werkelijke potentieel gegeven door de voltmeter.
- Oxidant toe te voegen totdat het potentieel is toegenomen met circa 50 mV. Begin met het toevoegen van een kleine hoeveelheid 1-2 pl van 2 mM FIC oplossing. Indien meer dan 10 gl toegevoegd te worden, overschakelen naar de 20 mM oplossing.
- Noteer how veel van de oplossingen toegevoegd. Opmerking: Dit is nodig om te corrigeren voor verdunning monster tijdens de titratie.
- Teken een monster zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
- Noteer de werkelijke potentieel gegeven door de voltmeter.
- Herhaal de stappen 2.9 en 2.12 tot en met het potentieel bereik van -0,6 V tot 0,2 V is bedekt en alle 10 EPR buizen worden gevuld met elk 200 pi.
Opmerking: Als het volume bij elke onttrekking verminderde de plaatsing van de elektroden moeten worden aangepast goed contact met de oplossing zonder tussenkomst van het roeren. Het kan moeilijk zijn om het potentieel na terugtrekking van het laatste monster en dus het potentieel van dit monster kan minder nauwkeurig meten. - Eventueel slaan de bevroren EPR monsters in vloeibare stikstof tot de EPR metingen kan plaatsvinden.
3. Meet Titratie monsters met behulp van EPR spectroscopie en Data-analyse
- Record EPR spectra van de verschillendetitratie monsters als volgt:
- Gebruik een high-vacuümpomp om een quartz cryostaat tot <10 -5 bar evacueren.
- Schakel de waterkoeling van de EPR magneet. Open de stroom droge lucht door de EPR holte.
- Schakel de stroomtoevoer naar de magneet en de computer van de EPR.
- Voer een frequentie kalibratieprogramma. Stel de meting parameters EPR. Sluit de cryostaat aan de vloeibaar helium Dewar. Koel de holte 16/09 K.
- Introduceer de EPR monster in de holte. Noteer de EPR spectrum.
- Identificeer de verschillende EPR soorten en gebruiken de beste spectra om de signalen te kwantificeren. Bereiken EPR kwantificering door dubbele integratie van de spectra en vergelijking met het spectrum van een externe koper standaardoplossing 10 mM CuSO 4/10 mM HCl / 2 M NaClO 4. 8
- Maak de titratiecurve als volgt:
- Zet de EPR signaalamplitude bij een g-waarde die kenmerkend is voor de paramagnetische soorten van belang tegen de potentieel.
- Wijzig de EPR signaal amplitude schaal om een spins / molecuul schaal met behulp van de EPR kwantificering van stap 3.2.
- Corrigeer de signaalamplitude van elk monster voor de verdunning die is ontstaan door de toevoeging van oxidatiemiddel of reductiemiddel.
- Corrigeer het potentieel voor het middelpunt potentieel van de Ag / AgCl referentie-elektrode.
Opmerking: De Ag / AgCl referentie-elektrode (met verzadigde KCl) een middelpunt potentiaal van 0,194 V versus de standaard waterstof elektrode (SHE) bij 25 ° C. Als dus de potentiaal op de voltmeter circa -0.6 V, de potentiaal verwijzing naar de SHE -0,4 V.
- Breng het signaal naar de Nernst-vergelijking:
Voor een soort die paramagnetische in gereduceerde toestand:
Voor een soort die paramagnetische in het oxidized staat:
Voor een soort die paramagnetische in een tussenstadium:
Deze vergelijkingen zijn geldig voor redox reacties waarbij een elektron wordt overgedragen, dus n = 1.
E = potentieel in Volt
E m = middelpunt potentieel in Volt
F = Faradayconstante = 96.480 C · mol -1
R = gasconstante = 8,314 J · K -1 · mol -1
T = temperatuur in Kelvin
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De redox titratie van de ijzer-zwavel cluster bevattend eiwit Nar1 uit Saccharomyces cerevisiae leidde tot de identificatie van drie verschillende cofactoren: Nar1: a [3FE-4S] cluster, een [4Fe-4S] cluster en mononucleaire Fe (Figuur 1) . De EPR signalen worden gekenmerkt door hun G-waarden: voor de [3FE-4S] + Gz 2,01 g crossover 2.00 (Figuur 1B); voor [4Fe-4S] +, Gz 2,02 g y 1,93 g 1,82 (afbee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De reeks 13 redox mediatoren kan een redox evenwicht in de oplossing in het bereik van -0,45 tot +0,3 V tegen SHE (Tabel 1 en Figuur 3). Goed boven en onder deze potentialen alle mediatoren zijn ofwel volledig gereduceerd of volledig geoxideerd en derhalve geen verdere equilibratie met de redox actieve centra van het eiwit kan optreden. Dit is een belangrijk begrip, zoals in de literatuur soms redox titraties worden uitgevoerd met slechts twee of drie mediators, die slechts een smal ber...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door een onderzoek subsidie van de Nederlandse National Research School Combinatie, Katalyse Gecontroleerd door Chemical Design (NRSC-Catalysis). Dr. HY Steensma en Dr. GPH van Heusden van de Universiteit Leiden worden bedankt voor hun steun aan de recombinante expressie van S. cerevisiae Nar1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Referentie-elektrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicaliën | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-fenyleendiamine (TMPD) · (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichloorfenol indofenol (DCIP), natriumzout | 620-45-1 | ||
| Fenazine ethosulfaat (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methyleenblauw | 122965-43-9 | ||
| Resorufine, natriumzout | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonaat (indigokarmijn) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naftachinon | 83-72-7 | ||
| Antrachinon-2-sulfonaat Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Fenosafranine | 81-93-6 | ||
| Safranine O | 477-73-6 | ||
| Neutraal rood | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
Referenties
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms. Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).
- Hagen, W. R. Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode. Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).
- Pierik, A. J., et al. Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).
- Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins. EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).
- Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation. J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).
- Aasa, R., Vänngård, T. EPR Signal Intensity and Powder Shapes. A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).
- Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz,, J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis. Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).
- Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron. Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).
- Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme. Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).
- Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch,, Landa, I., Hagen, W. R. Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation. FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).
- Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
