Een techniek om cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van neonatale muizen wordt beschreven. De kanalen zijn zorgvuldig ontleed en vervolgens cellen worden geïsoleerd door uitgroei in dikke collageen gels. Deze methode biedt een nuttig instrument voor het bestuderen van extrahepatische galwegen ontwikkeling en pathologie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van Neonatale Extrahepatisch cholangiocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De intra-en extrahepatische galwegen van de lever zijn ontwikkelingsgebied onderscheiden, en kan verschillend worden beïnvloed door bepaalde ziekten. De verschillen tussen intra-en extrahepatische cholangiocyten en tussen neonatale en volwassen cellen, zijn niet goed begrepen.
Methoden voor de isolatie van cholangiocyten van intrahepatische galwegen zijn goed ingeburgerd 1-4. Isolatie van extrahepatische ductale cellen, vooral van de pasgeborene, nog niet beschreven, hoewel dit van groot nut zou zijn in het begrijpen van de verschillen tussen verschillende populaties cholangiocyte en bestuderen ziekten zoals biliaire atresie die lijken de extrahepatische kanalen richten. Hier beschreven is een geoptimaliseerde techniek om zowel neonatale en volwassen muis extrahepatische galwegen cellen te isoleren. Deze techniek levert een zuivere celpopulatie met minimale verontreiniging van mesenchymale cellen zoals fibroblasten.
Deze methodiekd is gebaseerd op de verwijdering van de extrahepatische leidingen en galblaas, gevolgd door zorgvuldige dissectie en schrapen om vet en fibroblast lagen te verwijderen. Structuren zijn ingebed in dikke lagen collageen en gekweekt gedurende ongeveer 3 weken tot uitgroei van cholangiocyten in monolagen, die vervolgens kunnen worden getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat voor experimenteel gebruik mogelijk.
Inleiding
De oorsprong en de ontwikkeling van intra-en extrahepatische cholangiocyten aanzienlijk verschillen. De lever ontwikkelt uit een divertikel van de ventrale foregut endoderm 5. De caudale regio van de divertikel vormt de extrahepatische galwegen, terwijl de craniale regio genereert de intrahepatische galwegen 5. Intrahepatic kanaal cholangiocyten zijn afgeleid van stamcellen rond de ductale plaat in de peri portal regio 6. Deze cellen hebben het vermogen om te differentiëren in ofwel hepatocyten of cholangiocyten 6. Dit heeft belangrijke klinische implicaties aangezien cholangiopathies specifiek kan richten op een categorie ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De gehele procedure wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. Alle dierlijke werkzaamheden moeten onder menswaardige omstandigheden onder een protocol door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) zijn goedgekeurd.
1. Voorbereiding van apparatuur en oplossingen
- Stel de muis operatietafel dicht bij de weefselkweek kap en incubator (figuur 1A). Opmerking: Vereist apparatuur omvat een dissectie microscoop, een lichtbron, 12,5 cm lange rechte iris schaar, 6 inch niet gekartelde gebogen pincet met fijne tips, en 4 inch gekarteld pincet met gebogen tips (Figuur 1B).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gebruik van dit protocol resulteert in de isolatie van een populatie van neonatale muis extrahepatische cholangiocyten met uitstekende zuiverheid, zoals aangetoond door K19 immunofluorescentiekleuring (Figuren 2A en 2B); we vergelijkbare resultaten isoleren van cellen van volwassen muizen te bereiken. We hebben waargenomen dat het duurt 3 weken voor de cellen van vers geïsoleerde galwegen om monolagen op dikke collageen gels te vormen. De cholangiocyten groeien lineair hele dikke collageen, die vell.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschreven is een techniek om zuivere cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van muizen muizen van elke leeftijd, inclusief pasgeborenen. De techniek biedt het voordeel dat extrahepatische cholangiocyten afzonderlijk kunnen worden bestudeerd vanuit intrahepatische cholangiocyten en kan studies belangrijkste verschillen tussen deze populaties van cellen te identificeren vergemakkelijken. We hebben onlangs een studie gepubliceerd demonstreren afgenomen cilia in extrahepatic cholangiocyten geïsoleerd .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn dankbaar voor de Moleculaire Pathologie en Imaging Core van de UPenn NIDDK Center for Molecular Studies in Digestive en Leverziekten (P30 DK50306) voor hulp bij beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 DK-092111) en uit de Fred en Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (tot RGW) en door een beurs van de Childhood Liver Disease Research and Education Network (SK).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, gebruikt in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, gebruikt in BEC media |
| MEM met niet-essentiële aminozuren | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, gebruikt in BEC media |
| Insulin-transferrine-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, gebruikt in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, gebruikt in BEC media |
| Chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, gebruikt in BEC media |
| Penicilline-Streptomycine | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, gebruikt in BEC media en 500 μl in de isolatie |
| Gentamicine | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, gebruikt in BEC media en 500 μl in de isolatie |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, gebruikt in BEC media |
| MEM-vitamineoplossing | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, gebruikt in BEC media |
| Sojaboon trypsine-remmer | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, gebruikt in BEC media. Oplosmiddel is PBS, meng tot 5 mg/ml stockconcentratie |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, gebruikt in BEC media |
| Runderpituitair extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, gebruikt in BEC media |
| Dexamethason | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, gebruikt in BEC media, stock conc 393 μg/ml verdunnen met ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, gebruikt in BEC media, stock conc 3.4 mg/ml verdunnen met ethanol |
| Epidermale groeifactor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, gebruikt in BEC media, 25 μg/ml verdunnen met DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, gebruikt in BEC media, gebruik bij stockconcentratie van 0.411 mg/ml en verdun met DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, gebruikt in BEC media en 500 μl in de isolatie |
| Rattenstaart collageen | BD Biosciences | 354236 | variabel afhankelijk van de collageenconcentratie |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | gebruik bij 10x, steriele, gebruikt om collageen te maken, gebruikte hoeveelheid hangt af van de collageenconcentratie |
| dH2O | N/A | N/A | steriele, gebruikt om collageen te maken, gebruikte hoeveelheid hangt af van de collageenconcentratie |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Verdun tot 1 N, steriele, gebruikt om collageen te maken, gebruikte hoeveelheid hangt af van de collageenconcentratie |
| collageenase type XI van Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | verdun in DMEM en steriele filter voor gebruik |
| trypsine-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubeer max 10 min |
| trypsine-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubeer max 10 min |
| Dissectiemicroscoop | Nikon | SMZ645 | Andere modellen acceptabel |
| Lichtbron (fiberoptische verlichter) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Andere modellen acceptabel |
| 12.5 cm rechte irisschaar | Kent Scientific | Andere modellen acceptabel | |
| 6" niet-gekartelde gebogen pincetten met fijne uiteinden | Electron Microscopy Sciences | Andere modellen acceptabel | |
| 4" gekartelde roestvrijstalen pincetten met fijne uiteinden | Electron Microscopy Sciences | Andere modellen acceptabel |
Referenties
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
