Methodenartikel

Methoden te karakteriseren Spontane en Schrik-geïnduceerde Locomotion in een-Rotenon geïnduceerde Parkinson's Disease Model van

DOI:

10.3791/51625

⸱

17 augustus 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Colby College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die resulteert uit de degeneratie van dopaminerge neuronen in het centrale zenuwstelsel, waardoor voortbeweging defecten. Rotenone modellen ziekte van Parkinson in Drosophila. In dit document worden twee testen die zowel spontaan en schrikken geïnduceerde motoriek gebreken veroorzaakt door rotenon karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die resulteert uit de degeneratie van dopaminerge neuronen in het centrale zenuwstelsel, vooral in de substantia nigra. De ziekte veroorzaakt motorische gebreken, die presenteren als stijfheid, trillingen en dementie bij mensen. Rotenone is een insecticide dat oxidatieve schade veroorzaakt door remming van de functie van de elektronen transportketen in mitochondria. Het wordt ook gebruikt voor het modelleren ziekte van Parkinson bij de Drosophila. Vliegen hebben een inherent negatieve geotactic reactie, die dwingt hen om naar boven te klimmen na te zijn geschrokken. Vastgesteld is dat rotenon veroorzaakt vroegtijdige sterfte en motoriek gebreken die de vliegen "klimvermogen nadat ze neerwaarts afgetapt verstoren. Echter, het effect van rotenon op spontane beweging niet goed gedocumenteerd. Deze studie schetst twee gevoelige, reproduceerbare en high throughput assays om-rotenone geïnduceerde deficiënties karakteriserenkortlopende schrikreacties-geïnduceerde motoriek en langdurige spontane motoriek in Drosophila. Deze testen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere Drosophila modellen van beweging gebreken en efficiëntie van therapeutische middelen te karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Locomotion gebreken een belangrijk symptoom van de ziekte van Parkinson en worden grotendeels veroorzaakt door aantasting van dopaminerge neuronen van de substantia nigra 1. Rotenon is een ketonradicaal insecticide dat is uitgebreid onderzocht aan motorische stoornissen Parkinson modelleren in Drosophila 2-6. Rotenone oxidatieve schade veroorzaakt door het blokkeren van de oxidatieve fosforylering route, die uiteindelijk leidt tot celdood 7. Dopaminerge neuronen zijn meer vatbaar voor toxiciteit rotenon, waardoor de effecten van de chemische voornamelijk motor gebaseerd 2,7. Door het induceren van symptomen van de ziekte van Parkinson in vliegt, kunnen we beter begrijpen van de ziekte en op te lossen zijn symptomen 6,8-11. Drosophila biedt een goed model voor het bestuderen van dit effect, omdat ze genetisch handelbaar, gemakkelijk te onderhouden, en hebben een snelle levenscyclus.

Verschillende studies hebben aangetoond dat rotenon veroorzaakt korte schrik geïnduceerdemotoriek defecten in Drosophila -wanneer vliegen worden bijgehouden op-rotenon aangevuld voedsel, ze tonen een langzamere negatieve geotactic respons na schrikreacties 2-6. Hun niet zo snel omhoog klimmen in een injectieflacon Inrichting trials controle is indicatief voor schrikreacties geïnduceerde voortbeweging defecten.

Het effect van rotenon langdurig is spontane beweging niet goed beschreven. Drosophila activiteitsmonitoren (DAM) zijn met succes gebruikt om beweging in Drosophila circadiane ritme volgen bestudeert 12,13. Vliegen worden geplaatst in afzonderlijke buizen, die in de DAM geladen. Deze inrichting is voorzien van een infrarood sensor, die het aantal malen een vlieg breekt de infraroodstraal telt. Deze tellingen kunnen worden gebruikt als een maat voor ongestoorde voortbeweging activiteit 12,13. Door vliegen in een DAM, kan het effect van rotenon op hun lange-termijn voortbeweging worden gekarakteriseerd. Deze studie beschrijft de methoden om MMO'sUre korte schrikreactie geïnduceerde motoriek en langdurige spontane motoriek om de effecten van rotenon gemedieerde motorische defecten beter te begrijpen. Karakterisering van voortbewegen tekortkomingen nabootsen van de ziekte van Parkinson zijn belangrijk omdat ze zorgen voor de studie van andere verbindingen die deze motoriek gebreken kunnen omkeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Drosophila Startle-geïnduceerde Locomotion Assay

  1. Drug Treatment
    1. Bezadigde om gewenste nummer te immobiliseren (ongeveer 8-12) van 1-3 dagen oude man vliegt met behulp van CO 2 en het transporteren naar flesjes die de drug aangevuld voedsel. Opmerking: ander anestheticum bijvoorbeeld ether of ijs kan worden gebruikt om vliegen te tellen verdoven en behandeling mogelijk.
    2. Laten vliegen om te herstellen van sedatie gedurende 20 minuten (of tot herstel) met de flacon in een horizontale positie (om vliegen te voorkomen dat vast komen te zitten op levensmiddelen) en leg dan de flacon rechtop in een 12 uur donker, 12 uur licht incubator bij 25 ° C voor de rest van het experiment.
  2. De opstelling:
    1. Verdeel deze dubbele flacon setup in drie gelijke delen van 6,33 cm door het markeren van cirkels rond de flacons met een permanent marker.
    2. Na 3 dagen van blootstelling aan het geneesmiddel, overdracht vliegen zonder verlamming in de bodem flacon wordt snel boven flaconover de opening. Tape de twee flacons samen met doorzichtige tape.
    3. Laat vliegen te acclimatiseren aan de nieuwe omgeving gedurende 15 minuten.
    4. Plaats flacons op een witte achtergrond en het opzetten van een digitale camera op een geschikte afstand van de dubbele flacon apparatuur met een timer in zicht. Zorg ervoor dat de gehele inrichting is zichtbaar in een enkele foto frame en dat alle vliegen zijn in focus. Consistente frames tussen trials houden, markeren de locatie van de camera en de flacon.
  3. Mobility Assay
    1. Duidelijk weer de proef nummer, medicamenteuze behandeling, en de timer in camerabeeld.
    2. Tik stevig dubbele flacon apparaat tegen het aanrecht 3 keer en ervoor te zorgen dat alle vliegen vallen op de bodem van de flacon. Tegelijkertijd start de timer.
    3. Elke 5 sec voor 1 min, neem een ​​foto van het apparaat. Opmerking: Als alternatief kan een video worden opgenomen en gepauzeerd op geschikte tijdstippen voor metingen.
    4. Laten vliegen om ongestoord te herstellen gedurende 1 minuut.
    5. Herhaal dit nog 2 keer met 1 min herstel tijd tussen elke proef. Opmerking: Elk apparaat moet 5 minuten duren om het verzamelen van gegevens te voltooien. Zorgen voor vergelijkbare kracht van tikken tussen studies. Multiple (3 minimum) inrichting gemakkelijk gelijktijdig worden behandeld.
  4. Data Analysis
    1. Bekijk foto's en opnemen van het aantal vliegen in elke sectie in de tijd. Bereken het percentage vliegen in elke sectie in de tijd. Opmerkingen: Herhaal deze gehele procedure dezelfde vliegen 2 of 3 tijdstippen plaats, bijvoorbeeld, dag 3, 5, en 7 Als er te veel vliegen dood gedurende het experiment is het mogelijk te schalen het oorspronkelijke proces nummer te compenseren voor de sterfte. Gebruik de juiste statistische analyse om de gegevens te vergelijken.

2 Drosophila spontane motoriek Assay

  1. Eten bereiden
    1. Reconstitueren 3 g instant Drosophila medium met 15 ml gedeïoniseerd water en de gewenste rotenon(Of een ander geneesmiddel van belang) dosering.
    2. Zodra het voedsel mengsel stevig (ongeveer 5 min) is geworden, zorgvuldig laden van het eten op ongeveer 1 cm hoog naar fabrikant transparante buizen (5 mm x 65 mm). Voeg de drug geur zich aan de buizen door voorzichtig plaatsen van de buizen verticaal in het voedsel en draaien totdat ze kunnen worden verwijderd met het voedsel in de buis. Opmerking: Het is handig om een ​​vinger op de opening van de buis om een ​​vacuüm te creëren. Eten mag geen luchtbellen bevatten of hebben een oneffen oppervlak zoals de vliegen geplakt kan worden.
  2. Experimentele opstelling
    1. Plaats een plastic dop op het uiteinde van buis dichtst bij het eten. Duw de plastic dop op de tube zo weinig mogelijk, omdat het een luchtbel kan creëren in de flacon als krachtig geduwd.
    2. Bezadigde 1 dag oude mannelijke vliegt met behulp van CO 2 en plaats voorzichtig 1 man vliegt in elke buis met een penseel. Herhaal afhankelijk van het aantal gewenste proeven.
    3. Steek deuiteinde van de buis die het verst van het voedsel met een klein katoenen bal, die de hand kan worden uitgerold vanaf grotere winkel gekocht watjes.
    4. Laten vliegen om te herstellen met de buizen in een horizontale positie voor 15 min en ervoor zorgen dat alle vliegen zijn levend en actief. Plaats de buizen in DAM en zorg ervoor dat alle buizen zijn in dezelfde positie ten opzichte van de dam. Opmerking: Het is mogelijk om ze met het gebied van toezicht op het midden van de flacon of alle flesjes duwen naar de zijkant, zodat het uiteinde van de buis wordt gecontroleerd. Opmerking: Zie de bespreking voor variaties op deze methode.
  3. Data Collection
    1. Plaats de DAM in een 12 uur donker, 12 uur licht incubator ingesteld op 25 ° C. Sluit de DAM aan het systeem van gegevensverzameling. Open de DAM software en onder voorkeuren selecteren bin lengte tot 10 minuten. Start het verzamelen van gegevens en laat het programma om gegevens te verzamelen voor 7 dagen. Opmerking: Bin lengte kan worden aangepast indien nodig.
    2. Data Analysis
      Opmerking: ProcesGegevens tellingen per min verkrijgen als maat voor langdurige spontane motoriek.
      1. Open DAM bestand scan programma en toegang tot de monitor gegevens door te klikken selecteert u ingevoerde gegevens.
      2. Selecteer de juiste monitorenserie en selecteer bin lengte tot 10 min intervallen.
      3. In uitgang bestandstype kiezen kanaal bestanden. Laat alle andere opties als standaard.
      4. Klik scangegevens en opslaan in een opgegeven map.
      5. Gegevens importeren in een circadiaan data-analyse software om tellingen per minuut te verkrijgen. Opmerking: Voor data-analyse software Clocklab wordt algemeen gebruikt. Andere opties zijn ook beschikbaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila Startle-geïnduceerde Locomotion Assay

Wildtype Canton-S, vliegen toonde een sterke negatieve geotactic reactie slechts ongeveer 88% en 5% van de vliegen in de bovenste en onderste gedeelten respectievelijk van een dubbele-injectieflacon inrichting na 30 seconden (Figuur 1). Vliegen blootgesteld aan 125 pM en 250 pM rotenon gedurende 3 dagen een lichte daling van het aantal vliegen in het bovenste gedeelte en een lichte toename va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie beschrijven we twee procedures voor het meten van zowel de lange-termijn spontane motoriek en korte-termijn-schrik veroorzaakte motoriek in een-rotenone geïnduceerde Drosophila model van de ziekte van Parkinson. Men kan ook maatregel die locomotie kenmerken vliegen blootstelling aan andere farmacologische middelen bekend model Parkinson bijvoorbeeld paraquat 14, genetische modellen van de ziekte van Parkinson bijvoorbeeld alfa-synucleine mutanten 15 en ande...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag Qiuli Wang, Taal Resource Center, Colby College bedanken voor technische bijstand met videoverwerking en Eric Thomas, afdeling muziek, Colby College, voor het verstrekken van de achtergrondmuziek. Dit project werd ondersteund door subsidies van het National Center for Research Resources, INBRE (P20RR016463-12), het Nationaal Instituut voor de General Medical Sciences (P20 GM103423-12), Nationals Institutes of Health and Science Division Grant, Colby College (STA). JL en LWM werden ondersteund door subsidies van de Zomer Scholar Fonds, Colby College.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Standard narrow vialsGenesee Scientific32-120
RotenoneSigmaR8875Bewaar in de vriezer, maak vers voor elk experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)SigmaD8418Solvent voor rotenone
Instant Drosophila mediumCarolina Biological Formule 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)TrikineticsDAM2trikinetics.com
DAM tubesTrikineticsTubes 5 X 65 mm
Recept voor Rotenone + voedsel (125 mM dosis)Maak 62,5 mM rotenone stamoplossing in DMSO door 25 mg rotenone op te lossen in 1 ml DMSO; Voor 125 mM dosis, voeg 10 mM rotenone stam in DMSO toe aan 5 ml water.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
  2. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
  3. Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
  4. Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
  5. Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
  6. St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  7. Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
  8. Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640(2011).
  9. Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  10. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  11. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
  12. Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
  13. Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
  14. Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
  15. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  16. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
  17. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  19. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Locomotie bij DrosophilaRotenonmodelSchrikreactie assaySpontane LocomotieDubbelbuisapparaatDrosophila activiteitsmonitorKoolstofdioxidesedatieRotenon gesupplementeerd voederGeotactische ResponsLocomotiedefecten

Gerelateerde artikelen