Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Summary

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Abstract

Ionkanaaleiwitten zijn universele apparaten voor snelle communicatie over biologische membranen. De temporele ondertekening van de ionische flux zij genereren afhankelijk eigenschappen inherent aan elk kanaal eiwit en het mechanisme waardoor het wordt geproduceerd en gecontroleerd en vertegenwoordigt een belangrijk gebied van het huidige onderzoek. Informatie over de operationele dynamiek van ionkanaal eiwitten kunnen worden verkregen door het observeren langgerekte stroom door een enkel molecuul. Hier beschreven is een protocol voor het verkrijgen van een-kanaal-cel bevestigd patch-clamp huidige opnames voor een ligand-gated ionkanalen, de NMDA-receptor, heteroloog tot expressie in HEK293 cellen of native in corticale neuronen. Ook worden instructies over hoe de methode aan te passen aan andere ionkanalen van belang door de presentatie van het voorbeeld van de mechanisch-gevoelige kanaal Piezo1. Deze methode kan gegevens leveren met betrekking tot geleiding eigenschappen van het kanaal en de chronologische volgorde van open-gesloten conformaties die deel uitmaken van de activering mechanisme van het kanaal, hetgeen zal bijdragen tot hun functie in gezondheid en ziekte te begrijpen.

Introduction

Snelle communicatie over biologische membranen vrijwel uitsluitend een beroep op oligomere porievormende membraaneiwitten, meestal aangeduid als kanalen. Deze eiwitten verschillen sterk in activeringssignalen, gating mechanismen en geleiding eigenschappen. Kanaal eiwitten waarvan de poriën zijn selectief ionen worden geclassificeerd als ionkanalen; hun activering produceert ionenstromen over het membraan, en hun antwoorden kunnen worden opgenomen met een hoge resolutie in real time via elektrofysiologische technieken. De activering signalen bestrijken een breed scala aan chemische en fysische-ingangen, waaronder concentratiegradiënten, mechanische en elektrische krachten en temperatuur; dus, verdere indeling van ionkanalen in ligand gated, mechanosensitive, voltage gated, of warmte gevoelige types. In dit artikel worden de protocollen beschreven een-kanaal activiteit opnemen van een ligand-gated kanaal, de NMDA-receptor, en een mechanosensitive kanaal, Piezo1, met behulp van de patch-clamp techniek.0;

Patch-clamp elektrofysiologie is de eerste en meest gebruikte experimentele werkwijze voldoende gevoelig voor de waarneming van afzonderlijke moleculen ^{1, 2} mogelijk. Naast deze uitstekende gevoeligheid heeft enorm uitgebreid de biologische preparaten vatbaar voor elektrofysiologische opname en ook kon de waarneming van ionenkanalen in intacte membranen. Ten eerste, omdat zowel spanning klem en huidige opname wordt bereikt met dezelfde elektrode kan worden gebruikt om signalen op te nemen in kleine cellen of membranen patches. De techniek bleek dat ionkanalen niet beperkt blijven tot prikkelbaar membranen van kikker spieren, paling electroplaques of reuzeninktvis axonen ^{3, 4,} maar eerder dat zij vertegenwoordigen alomtegenwoordig armaturen van transmembraan signaleringsmechanismen en zijn inherent aan alle celmembraan vormen van uni-of meercellige organismen, alsmede intracellulaire membranen. Importantly, de mogelijkheid om transmembraan stromen opnemen door gewoon het aanbrengen van een glazen pipet om een ​​intacte cel op voorwaarde dat de ongekende kans om activiteiten te registreren van ionkanalen in hun eigen ongestoorde membranen. Aldus de cel verbonden patch-clamp techniek die wordt beschreven in dit protocol, maakt controle van de activiteit van ionenkanalen continu tientallen minuten of langer in hun eigen omgeving.

Onder normale thermische schommelingen, alle proteïnen, inclusief ionkanaaleiwitten, ondergaat structurele veranderingen over een breed tijdschaal, de snelste en meest voorkomende herschikkingen vertegenwoordigd waarschijnlijk door zijketen bewegingen en veel langzamer, minder frequente veranderingen voorgesteld door de herpositionering van de gehele domeinen of subeenheden, of in sommige gevallen door posttranslationele modificaties of eiwit-eiwit interacties ^{5, 6.} Observeren lange periodes van activiteit die door een molecuul kan helpen om de functie te begrijpennale dynamiek van ionenkanalen in intacte fysiologische membranen en waardevolle informatie over de operationele mechanisme van het molecuul waargenomen.

In tegenstelling tot het groeiende begrip van de diversiteit van ionenkanalen in celtypes en ontwikkelingsstadia, kennis over de moleculaire samenstelling van ionenkanalen in natieve membranen nog beperkt. Alle ionenkanalen multimere eiwitten en de meerderheid van inheemse ionenkanalen samenstellen uit verschillende soorten subeenheden produceren eiwitten brede moleculaire diversiteit, die vaak gepaard gaat met diverse geleiding en gating eigenschappen. Om deze reden, zijn ionkanalen van gedefinieerde moleculaire samenstelling bestudeerd na expressie in heterologe systemen. Vooral HEK293 cellen, die een klonale lijn van geïmmortaliseerde humane embryonale niercellen ⁷ zijn wijdverspreide acceptatie als het voorkeurssysteem voor heterologe expressie van recombinante ionenkanalen. Onder de many voordelen die HEK293 cellen verhoogd als de keuze voor ionkanalen elektrofysiologie zijn het gemak en betaalbaarheid kweken en onderhouden langlevende stabiele culturen hun bekwaamheid tot het post-translationele vouwen, verwerking en transport van zoogdiereiwitten, en in veel gevallen , hun lage of zelfs afwezigheid van endogene uitdrukking voor het kanaal van belang ^{7, 8.} Recombinant ionenkanalen en het bestuderen van hun functionele eigenschappen in HEK293 cellen blijft een waardevolle benadering voor informatie over de structuur-functie eigenschappen van ionenkanalen en de specifieke eigenschappen van ionkanaal isovormen en hun rol in natieve weefsel verkrijgen. De in dit artikel beschreven protocollen kunnen evengoed worden toegepast om recombinante ionkanalen tot expressie in HEK293 cellen en inheemse ionenkanalen.

Samengevat, de patch-clamp techniek, door zijn ongekende vermogen signaal lossens van het ene molecuul blijft tot op heden de meest directe methode voor het observeren van het gedrag van enkele moleculen. In zijn cel bevestigd mode, patch-clamp-opname maakt het mogelijk lange observatie periodes die, als je klaar bent voor een molecuul, kan uitzonderlijk inzicht geven in de werking van ionkanalen. Hieronder wordt voorgesteld een protocol voor het verkrijgen van de huidige opnamen van hoge resolutie van cel bevestigd pleisters met een ionkanaal eiwit.

Protocol

1. Celkweek en eiwitexpressie

1. Handhaaf HEK293 cellen (ATCC CRL-1573) tussen passages 22 en 40, welke passages uitgevoerd door ATCC, in monolaagkweek in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bevat en 1% penicilline / streptomycine mengsel bij 5% _CO2 en 37 ° C. Tussen experimenten werd passage cellen in T25 kolven 5-20 voudige verdunningen in een eindvolume van 10 ml. Opmerking: Het gebruik van cellen tijdens deze passages garandeert gunstige cel gezondheid, die zal zorgen voor een optimale vorming afdichting en patch stabiliteit.
2. Voor transfectie, plaat HEK293-cellen in 35 mm schalen bij een dichtheid van ~ 10 ⁵ cellen / schaal, wat overeenkomt met ~ 0,5-0,6 ml celsuspensie per schaal en groeien cellen in 2 ml medium voor 18-24 uur.
3. In een steriele 1,5 ml centrifugebuis, bereid de transfectie mengsel gedurende vier 35 mm schalen door toevoeging (in deze volgorde): (1) 1 ug van iedere cDNA (GluN1, GluN2A en GFP); (2) 315 pldubbel gedestilleerd water (DDH ₂ O); (3) 350 ul van 42 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), en (4) 35 pl van 2,5 M _CaCl2 druppelsgewijs, die wordt gebruikt om het neerslag te vormen.
4. Vortex buis gedurende 5 seconden en voeg 175 ul transfectie suspensie in elk van de vier 35 mm schalen uitgeplaat de dag ervoor, die nu cellen bevatten 50-60% confluentie, en incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
5. Zuig uit het transfectie medium, wassen met PBS en vervangen door 2 ml groeimedium aangevuld met 2 mM _MgCl2 voorkomen NMDA receptor gemedieerde excitotoxiciteit ^9. Opmerking: De cellen kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames 24-48 uur na transfectie.

2. Elektrode Voorbereiding

1. Genereer 2 symmetrische opname pipetten door te trekken op borosilicaat glazen buisjes met een verticale puller. Op basis van de grootte en geometrie van de resulterende tip, verder vorm pipettenmet behulp van een polijstmachine. Opmerking: De tip grootte kan visueel en elektrisch worden geëvalueerd. Visueel, moet de buitendiameter in het bereik 1,4-5,6 urn. Elektrisch, een optimale grootte tip, wanneer gevuld met extracellulaire oplossing, moeten weerstanden te produceren in de 12-24 MQ bereik (zie figuur 2B).
2. Gebruik een pipet oplossing, die voor cel bevestigd experimenten vertegenwoordigt de extracellulaire milieu dat de maximale activiteit op het kanaal en hoge stroom amplitudes zal produceren. Opmerking: NMDA receptoren, komt dit overeen met een oplossing die verzadigende concentraties agonisten (glutamaat en glycine), 1 mM EDTA, die tweewaardige kationen remmers en blokkers cheleert, en heeft fysiologische concentraties van natrium (150 mM) als enige doordringende ion ( in mM: 1 glutamaat, glycine 0,1, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA en 10 HEPBS, gebufferd bij pH 8,0 met 1 N NaOH).

3.-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

1. Open QUB data-acquisitie software;re (www.qub.buffalo.edu), en selecteer de overname venster onder 'layout'. Open een nieuw QUB gegevensbestand (QDF) door te klikken op 'Nieuwe gegevens' onder de drop down menu getiteld 'Bestand' en voer de volgende initiële parameters: bemonsteringsfrequentie, 40 kHz; A / D-scaling, 3000; uitgangskanaal, 1; en A / D data grootte, 2. Stel de amplitude scaling tot 0,1 V / pA door met de rechtermuisknop te klikken op het bestand, eigenschappen te selecteren, en te klikken op het tabblad 'data'. Opmerking: Deze parameters kunnen worden verfijnd voor elke instelling met een model-cel in de cel bevestigd modus. Extra instructie over data-acquisitie met QUB software en QDF eigenschappen zijn online op www.qub.buffalo.edu.
2. Selecteer een 35 mm schotel met ionkanaal tot expressie brengen en te vervangen groeimedium met 2 ml PBS met calcium en magnesium; monteer de schotel op de microscoop podium en concentreer je op het veld met behulp van cellulaire fasecontrastmicroscopie te evalueren dat cellen gezond zijn en goed op de schotelin monolaag mode (figuur 1A). Schakel over naar fluorescentie detectie te controleren of de transfectie succesvolle (Figuur 1B) was. Opmerking: Het bereik van fluorescentie intensiteiten kunnen worden gebruikt als een ruwe indicator van eiwitexpressie.
3. Voor alleenstaande kanaals opname, stelt de versterker uitgangsversterking naar x10, patch configuratie om β = 1, analoog filter tot 10 kHz, mode om voltage-clamp en aangelegde spanning tot +100 mV. Met de houdspanning commando in de UIT-stand, selecteert u de 'seal test' knop.
4. Op basis van fluorescentie en gezondheid van de cellen, kiest een cel te patchen. Controleer onder fasecontrast dat de cel goed bevestigd aan de schotel, een groot deel van het celoppervlak blootgestelde repareert en overigens gezonde ziet. Opmerking: Handhaaf fase-contrast-verlichting te voorkomen bleken van de cel tijdens de nadering en patch-klemmen.
5. Vul een vers gepolijste pipet met net genoeg oplossing zodat het contact met de electrod maakte en schud voorzichtig om luchtbellen die kan worden gevangen in de punt los. Beveilig de opname pipet op de versterker headstage vast door de afdichtschroef van de pipet houder en zorg ervoor dat de zilveren draad wordt ondergedompeld in de pipet oplossing.
6. Met een kleine (5 cc) plastic injectiespuit, die is verbonden met de pipet houder door buizen voorzichtig toepassing positieve druk om verontreinigingen voorkomen dat verstopping en de punt tijdens de nadering (Figuur 2A).
7. Met behulp van de micromanipulator, richt de pipet in het bad en plaats het direct over de gekozen voor het patchen (figuur 1C) cel, het sluiten van het elektrische circuit. Kennis te nemen van de oscilloscoop, met een rechthoekige golfvorm overeenstemt met de versterker dichtheidsbeproeving signaal (Figuur 2B) moeten aangeven. Opmerking: Bij binnenkomst in het bad, de pipet weerstand binnen het optimale bereik is 12-24 MQ. Voor een 5 mV testsignaal, de gemeten stroom range komt overeen met ~ 20-40 pA.
8. Terwijl bewaken pipet positie visueel door de microscoop en pipet weerstand elektrisch op de oscilloscoop verder de benadering in kleine stappen tot botst pipet zachtjes op de cel en het testsignaal enigszins af tot verhoogde resistentie (Figuur 2B) te geven.
9. Om een afdichting te vormen, pak de spuit en lichte onderdruk aanmelden via de laterale buis door te trekken de zuiger, die de celmembraan trekt in de punt van de opname pipet en initieert de vorming van een GQ weerstand afdichting ^10. Kennis te nemen van de test signaal golfvorm op de oscilloscoop, waarin afdichting vorming wordt aangegeven door zijn compleet afvlakken, met alleen capacitieve transiënten zichtbaar (Figuur 2B). Opmerking: Als het signaal niet helemaal plat of de basislijn wordt luidruchtig, dit duidt op een zwakke afdichting met aanzienlijke huidige lek rond de afdichting. Dit r voorkomenesolving een kanaal stromen. Als dit het geval is, trekt de pipet uit de cel en uit de buurt van het bad, haal hem uit het hoofd podium en gooi hem weg. Herhaal het proces met een fris gepoetste pipet tot het verkrijgen van een zeehond in het adequaat bereik (≥ 1 GQ).
10. Op de versterker, schakel de externe opdracht toggle van 'seal test' 'uit'; Schakel de spanning houden commando om positieve (die eerder was ingesteld op 'off'); en verhoging van de winst voor x100. Let op de oscilloscoop voor kanaal activiteit, die, indien aanwezig, wordt weergegeven als vierkante opwaartse doorbuigingen van de eerder vlakke basislijn (figuur 2C).
11. Als kanaal activiteit wordt weergegeven op de oscilloscoop, gegevens verwerven in de eerder geopende digitale bestand in QUB, door op de 'play' knop, gevolgd door de 'Record' knop. Om te stoppen met het verwerven van gegevens, druk op de stopknop in QUB, en sla het QDF bestand naar een eenvoudig gegevensbestand,staat locatie op de harde schijf van 'Data opslaan als ...' in het drop down menu getiteld 'Bestand' te selecteren.

4. Gegevens Preprocessing en idealisering

Opmerking: Belangrijke informatie kan van enkele kanalen opnamen worden gewonnen door statistische analyses die elk gegeven toekent aan een passende geleiding klasse (in het eenvoudigste geval, open of gesloten). Dit proces wordt aangeduid als data idealisering en een korte beschrijving van gegevens idealisering de segmentale k middelen (SKM) methode ¹¹ in QUB wordt hieronder beschreven.

1. Open het bestand in QUB, en bekijk de huidige sporen in de 'Pre' interface van onder 'layout'. Geef het opgenomen bestand ongefilterde (verwijder digitaal filter) door het vinkje in het vakje 'Fc.'
2. Visueel scannen het record om onregelmatigheden en artefacten (Figuur 4A) te spotten. Correct korte stroompieken dat bedrijfspensioenvoorzieningr binnen het trace (Figuur 4A) door het selecteren van een aangrenzend schoon gebied van dezelfde geleiding klasse, aandacht voor deze regio, met de rechtermuisknop te klikken en te kiezen voor 'ingesteld erase buffer.' Zoom in op de spike tot individuele meetpunten zichtbaar zijn, selecteert u de regio te worden vervangen en wissen door te wijzen op alleen deze regio en vervolgens met de rechtermuisknop op 'wissen'.
3. Definieer de nul huidige basislijn voor de hele record door het selecteren van een vroege gedeelte van de plaat waar de basislijn stabiel is, hoogtepunt, klik met de rechtermuisknop en kies 'set baseline'. Controleer of de richtlijn die nauwkeurig verschijnt vertegenwoordigt het basisniveau (paars in figuur 4B)
4. Identificeer punten in het record waar de ruwe data basislijn afwijkt zichtbaar vanaf de set basislijn. Corrigeer dit door een klein deel van de uitgangswaarde selecteren binnen de afwijkende regio, klik met de rechtermuisknop en selecteer de optie 'voeg een basislijn knooppunt' commando.
5. Identificeer gebieden van de thij opnemen met overmatig lawaai of artefacten die niet gemakkelijk kan worden gecorrigeerd (Figuur 4C). Markeer de regio moeten worden afgevoerd, klik met de rechtermuisknop en kies 'verwijderen.' Opmerking: In dit geval zal kinetische informatie verloren: de verwerkte record korter zijn en de punten die na de splice punt zal verschijnen continu met de pre-ruis regio.
6. Als u records idealiseren met de SKM-algoritme ^11, markeert een deel van het trace die zowel open als gesloten evenementen en vul de interface 'Mod' onder 'Lay-out.' In het "model" paneel, markeert een schoon gedeelte van het spoor dat representatief is voor de basislijn in het hele bestand met de rechtermuisknop op het zwarte vierkant (gesloten toestand) en selecteer "grijpen". Doe hetzelfde voor kanaal openingen door te wijzen op de open geleiding, klik met de rechtermuisknop op de rode plein in het "model" paneel en selecteer "grijpen".
7. Voer de idealizatie voor het hele record door op de knop 'Bestand' onder 'Data Source.' Klik met de rechtermuisknop op de tab 'Idealize' onder de sectie 'Modeling' om te controleren of de gewenste parameters voor analyse juist zijn en klik vervolgens op 'Uitvoeren'. Het resultaat van de idealisering, samen met amplitude histogram voor het gehele bestand, wordt bedekt met de gegevens om voor visuele inspectie van de idealisering (Figuur 5). Opmerking: Onvoldoende idealisering kan leiden tot de generatie van 'valse gebeurtenissen,' waarin QUB detecteert kanaal openingen en sluitingen die niet echt gebeuren. Binnen de opname resolutie, die door de versterker analoge filter en de sampling rate is ingesteld, kan de resolutie waarmee SKM detecteert open en gesloten evenementen gecontroleerd worden door het instellen van een dode tijd voor de analyses. Optimale dode tijden moet proefondervindelijk worden geselecteerd en zal afhangen van sampling rate, echter, een goede vuistregel iseen dode tijd die 2-3 monsters ¹² selecteren.
8. Om te controleren of de idealisering nauwkeurig de ruwe data vertegenwoordigt, handmatig scannen de geïdealiseerde trace. Bij de identificatie van fouten in de idealisering, markeert het spoor over de valse evenement, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Join IDL.' Opmerking: Voor meer opties en een uitgebreide uitleg van de verschillende opdrachten en functies in QUB, raadpleeg de QUB Manual online (www.qub.buffalo.edu).

Results

Recombinant NMDA receptoren

NMDA-receptoren binden en te reageren op de gelijktijdige werking van twee co-agonisten: glutamaat en glycine. Ze assembleren als heterotetrameren van twee glycine binden GluN1 subeenheden en twee glutamaat bindend GluN2 subeenheden. GluN2 subeenheden worden gecodeerd door vier genen (AD) en van deze de meest getranscribeerd vormen in de hersenen zijn GluN2A bij volwassen en GluN2B bij jonge dieren. Vanwege de diversiteit van NMDA receptor subtype...

Discussion

In het veld ionkanaal, is een belangrijk gebied van onderzoek gewijd aan het begrijpen van de opeenvolging van gebeurtenissen die leidt tot het openen of gating mechanisme van het kanaal kanaal. Voor de meeste kanalen, dit proces is complex en omvat verschillende kinetische stappen die niet kunnen worden afgeleid uit een macroscopische multikanaals signaal. In tegenstelling, kunnen experimenten worden opgezet waar het observeren van de opeenvolging van open / gesloten gebeurtenissen in single channel record kan meer ged...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon heeft ook vergelijkbare microscopen
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	Voor HSPC-1