Er wordt een methode gepresenteerd om de snelheid van de microcirculatoire bloedstroom te meten in longkankermetastasen van het pleuraoppervlak bij ratten op een geautomatiseerde manier, met behulp van gesloten-borst intravitale longmicroscopie. Dit model heeft het potentieel om als een wijdverbreid hulpmiddel te worden gebruikt om fysiologisch onderzoek uit te voeren naar longmetastasen bij knaagdieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde Meting van Microcirculatoire snelheid van de bloedstroom in longmetastasen van Rats
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Omdat de long een belangrijk doelorgaan is voor metastaserende ziekten, zijn diermodellen om de fysiologie van pulmonale metastasen te bestuderen van groot belang. Er bestaan echter tot op heden maar zeer weinig methoden om longmetastasen op dynamische wijze op microcirculair niveau te onderzoeken, vanwege de moeilijkheid om de long met een microscoop te benaderen. Hier wordt een intravitale microscopiemethode gepresenteerd om de microcirculatie van oppervlakkige pulmonale metastasen bij ratten functioneel af te beelden en te kwantificeren, met behulp van een gesloten borstvliesvenster en geautomatiseerde analyse van bloedstroomsnelheid en -richting. De bruikbaarheid van deze methode wordt gedemonstreerd om toenames in bloedstroomsnelheid te meten als reactie op farmacologische interventie, en om de bekende bochtige vasculaire structuur van vaste tumoren af te beelden. Dit is de eerste demonstratie van intravitale microscopie op pulmonale metastasen in een model met gesloten borst. Vanwege de geminimaliseerde invasiviteit, evenals vanwege de relatieve eenvoud en praktische toepasbaarheid, heeft deze technologie het potentieel om wijdverspreid te worden gebruikt in laboratoria die gespecialiseerd zijn in longtumoronderzoek.
Inleiding
De long is een van de belangrijkste doelorganen van metastatische ziekten, en omdat deze aandoening moeilijk te behandelen is met chemo- en stralingstherapie, is een genezing nog steeds zeldzaam1,2. Specifieke pathofysiologische en microcirculatoire kenmerken van solide primaire en metastatische tumoren, zoals microregionale hypoxie, diffusiebeperking en inefficiënte tumorvaten, dragen in grote mate bij aan hun weerstand tegen antikankerbehandelingen3,4. Vanwege de microscopische schaal en dynamische aard van parameters zoals microvasculair bloedvolume, is intravitale microscopie van de tumor in het levende dier een zeer belangrijk onderzoeksinstrument in het veld geworden5. Hoewel intravitale microscopiemodellen zijn toegepast op tumoren op verschillende plaatsen in het lichaam, inclusief de metastatische long binnen een open ribbenkast, is er nog geen protocol ontwikkeld voor het onderzoek naar pulmonaire metastasen in een fysiologisch behoudende, gesloten-borstkas omgeving6,7. Een dergelijke onderneming wordt met name gehinderd door de noodzaak om chirurgisch toegang te krijgen tot de ribbenkast zonder de algehele functie van de long te beïnvloeden7-9. Onlangs is een methode geïntroduceerd om pulmonaire microcirculatoire bloedstroom te beeldvormen in een gesloten-borstkas omgeving bij levende ratten, met behulp van fluorescente intravitale microscopie10. Dit protocol maakt de systematische kwantificering van bloedstroomsnelheid van geïnjecteerde, fluorescerend gelabelde rode bloedcellen mogelijk, met behulp van geautomatiseerde analyse, terwijl het dier fysiologisch stabiel blijft en de integriteit van de long behouden blijft11. In deze studie wordt getoond hoe deze technologie kan worden aangepast om microcirculatoire bloedstroom in staartvene-geïnfecteerde pulmonaire metastasen op het pleuraoppervlak in de immuungecompromitteerde rat te beeldvormen en te kwantificeren. Dit model is ook het eerste om metastatische longtumoren te bestuderen in een gesloten-borstkas intravitale microscopie omgeving.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle diergerelateerde procedures beschreven in dit protocol zijn eerder door de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite (DUIACUC) goedgekeurd.
1. Cancer Cell Cultuur en Injection
- Cultiveren fluorescent gelabelde uitgezaaide kankercellen (bijv mens MDAMB231-GFP borstkankercellen, gift van Dr. Patricia Steeg, NCI, en YFP-gelabeld muis sarcoom cellen, gift van Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, afdeling Radiation Oncology) in geschikt kweekmedium (bijvoorbeeld Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptavidine) bij 37 ° C tot ongeveer 90% confluent.
- Trypsinize cellen, was ze dan 2 keer met PBS, tellen, en dan injecteren ze in de staart aderen van-isofluraan verdoofd 10 weken oud vrouwelijk naakt ratten op 5 miljoen cellen per dier, met behulp van een spuit met een 27 G naald. Chirurgische niveau verdoia wordt gecontroleerd door het gebrek aan reactie op teen knijpen.
2. Toezicht van Metastases behulp MicroCT
- Onderzoek ratten wekelijks behulp van een micro-CT / micro-bestraler, de aanwezigheid van metastasen boven ongeveer 2 mm diameter detecteren. De micro-CT wordt in opdracht zoals eerder beschreven 12.
- Onder ratten 3% isofluraan anesthesie voor beeldvorming. Bevestig diepe narcose door teen knijpen.
- Na het begin van de anesthesie, snel overbrengen ratten naar de beeldvorming wieg in de beeldvorming kamer en sluit via een neus-cone om een isofluraan-luchtmengsel bij 2,5-3%. Pas de positie van de rat in de houder zodanig dat de thorax is gepositioneerd in de fotonenbundel van de MicroCT scanner via de externe positie controles en laser scheidingsteken op de beeldvorming houder. Controleer de deur naar de beeldvorming kamer gesloten, de onderzoeker te beschermen tegen de gammastralen.
- Controleer de positie van het dier opnieuw metde kleur videocamera. Voer een lage resolutie CT-beeldvorming proefdraaien, en gebruik het resulterende beeld om het gezichtsveld te passen aan de xyz afmetingen van de borstholte.
- Afbeelding van de rat thorax met behulp van een 2 mm Al filter op 40 kVp, 2,5 mA, en 0,008 voxel op 7 FPS en terug te keren het dier naar zijn kooi. Beeldvorming van één dier niet meer dan 15 of 20 minuten duren. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug. Heeft een dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden.
- Bevestig metastasen door de verschijning van relatief radiopaak objecten die niet kunnen worden verklaard door intrathoracale bloedvaten (Figuur 1A)
3. Window Kamer Chirurgie
- Anesthesie, vitale functies en de staart ader catheterisatie
- Selecteer dieren met aanwezigheid van metastatische ziekte. Injecteer dier met een intraperitoneale dose van 50 mg / kg pentobarbital. Bevestig chirurgische niveau anesthesie door teen knijpen voordat u verder gaat.
Opmerking: Anesthesie protocollen te worden afgestemd op de respectieve experimentele opstelling. Pentobarbital is hier gekozen als langwerkende anesthesie, teneinde diepe anesthesie voor langdurige procedures induceren, terwijl het de mogelijkheid van gemakkelijke Herdosering. Echter, verlies van dieren overdosering is een veelvoorkomend probleem met pentobarbital verdoving. Een andere optie die autonome reflexen bewaart tot een grotere mate dan pentobarbital is ketamine in combinatie met sedativa zoals xylazine of medetomidine, die echter slechts toelaat voor een single-re dosiscyclus. - Scheer dieren op de zijkant van het lichaam die de metastatische ziekte heeft, en in de nek, met een clipper. Veeg alle losse resterende haren uit de huid. Na losse haren verwijderd is, gelden veterinaire zalf voor de ogen, om te voorkomen dat ze uitdrogen.
OPMERKING: Athymische naakt ratten mogen resterende haren die buite hebbenres verwijderen alvorens verder te gaan met chirurgische procedures. Het is zeer belangrijk om alle haar grondig te verwijderen, omdat het kan interfereren met chirurgische procedures en beeldvorming. - Fix het dier in rugligging op een metalen plaat die op een temperatuur van 37 ° C water gecirculeerd verwarming pad wordt geplaatst. De voorste en achterste ledematen zijn bevestigd op de plaat met tape.
Opmerking: Het is nuttig te controleren en opnemen vitale functies zoals hartslag en arteriële oxygenatie door een pulse oximeter gedurende chirurgische en experimentele procedures.
- Selecteer dieren met aanwezigheid van metastatische ziekte. Injecteer dier met een intraperitoneale dose van 50 mg / kg pentobarbital. Bevestig chirurgische niveau anesthesie door teen knijpen voordat u verder gaat.
- Tracheaalintubatie
- Om een katheter plaatsen ventilatie van het dier eerst een transversale cervicale incisie, gevolgd door de mediaan scheiding van de longitudinale spieren ventrale naar de luchtpijp.
- Gebruik herhaald openen te sluiten actie met een scherpe tang om een doorgang voor de hechting te creëren via de dorsale zijde van de luchtpijp.
- Voeg een kleine incisie in de trachea op tHij buikzijde niet meer dan halfcirkelvormig, ongeveer tussen de tweede en derde trachea ring. Laat een voldoende lang gedeelte van de trachea blootgesteld op het dorsale oppervlak fixatie van de tracheale katheter mogelijk.
- Plaats een 2,5-3,0 mm "Y" tracheacanule in de luchtpijp, en draai met een 4-0 monofilament hechtdraad. Controleer de canule is verbonden met een druk gefietst ventilator met een fles verbonden afloop buis die gevuld is met 6 cm water, positieve pulmonaire druk te handhaven. Instromende gas moet 100% zuurstof, tenzij experimenteel anders gewenst.
- Plaats een katheter met een 25-27 G naald, en gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing in een van de staart aderen van de rat, en zet vast met tape.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de doorgankelijkheid van de staart ader katheter tijdens de gehele procedure door herhaaldelijk injecteren van een kleine hoeveelheid heparine zoutoplossing in de staartader. Ook oro-tracheale intubatie, dwz de begeleiding van een trachealebuis via de mond van het verdoofde dier en langs de larynx in de trachea, is een mogelijk alternatief voor de tracheotomie procedure die hier wordt beschreven. Deze werkwijze vereist een speciale opleiding en ervaring, om schade aan de luchtpijp te voorkomen en ook om de toevallige cannulatie van de slokdarm voorkomen.
- Toepassing van pulmonale venster
- Verwijder het vel van de zijkant van de borst waarbij de metastasen zich, door het creëren van een incisie, en vervolgens verwijderen van de huid met behulp van stompe dissectie.
Opmerking: De huid kan worden uitgesneden en verwijderd na onthechting - Ga verder met het ontleden van de twee lagen over elkaar spieren (pectoralis, serratus, en latissimus dorsi), maar het verlaten van de intercostale spieren intact. Een perforatie in de borstholte van ongeveer 1,5 cm in diameter, door het verwijderen van gedeelten van typisch twee aangrenzende ribben. In het ideale geval, zoek de perforatie in de regio van de zesde en zevende ribs.
- Osteotomie:
- Om bloeden en beschadiging van de longen oppervlak minimaliseren, stevig vasthouden van de rib met een getande chirurgische forceps te snijden tijdens het snijden. Met chirurgische schaar, knip de mediale zijde van de eerste rib, onder een hoek van ongeveer 45 °, waardoor de puntige zijde van de resterende rib wijst buiten.
- Vervolgens stuurde de zijkant van de rib op een soortgelijke wijze weer waardoor de puntige zijde van de rib naar buiten stekende, om schade aan de longen oppervlak te voorkomen.
- Herhaal de procedure voor de aangrenzende rib, knip dan de intercostale spieren en verwijder het weggesneden stuk. Tijdens deze procedure handhaven long druk op een wijze die mechanische interactie tussen de long oppervlak en de ribbenkast geminimaliseerd. Doe dit door het adequaat regelen van inspiratie druk op de ventilator.
- Bevestiging van het paneel:
- Plaats een maat long raam, bestaande uit een dekglaasje dateen Plexiglas socket (Figuur 1B) bevestigd. Bevestig het venster naar de socket door lijmen of door een kleine hoeveelheid vacuüm vet. Plaats het venster zodanig dat oppervlak metastasen zijn dicht bij het midden van het venster. Indien nodig de geplaatste gat om de micrometastasen naar het midden van het venster meenemen vergroten het gat enigszins aan de respectievelijke zijde.
OPMERKING: gemetastaseerde ziekte op de pleura oppervlak kan worden geïdentificeerd als duidelijk herkenbare witte stippen of gebieden binnen de anders roze-to-zalmkleurige gezonde delen van de long oppervlakte die voornamelijk langs de scheuren verschijnen. Terwijl micrometastasen kunnen voordoen op andere gebieden van de pleurale buitenkant, de onderzochte cellijnen bijna altijd weer opduiken micrometastasen in het geperforeerde gebied, eenmaal metastasen radiologisch kunnen worden gedetecteerd. - Nadat de fitting in de perforatie en maken direct contact met de viscerale pleura van de lung, hechten de randen van het raamkozijn aan de omringende intercostale spieren, met 4,0 monofilament hechting (figuur 1C). Gebruik een lichte stijging van inspiratie druk op de ventilator om restlucht helpen te ontsnappen en een afdichting.
Opmerking: De ademhalingssnelheid van ratten kan sterk variëren, afhankelijk van de status van anesthesie, de status van opwinding of angst, zuurstofconcentratie van ingeademde lucht (FiO 2), etc. Het verdient aanbeveling de ademhalingsfrequentie tussen 70 en 90 slagen passen. De inspiratie druk dient te worden aangepast met de nodige voorzichtigheid en niet worden ingesteld op meer dan ong. 8 cm H2O (0,6 mmHg) om schade aan de longen oppervlak beschadigt.
- Plaats een maat long raam, bestaande uit een dekglaasje dateen Plexiglas socket (Figuur 1B) bevestigd. Bevestig het venster naar de socket door lijmen of door een kleine hoeveelheid vacuüm vet. Plaats het venster zodanig dat oppervlak metastasen zijn dicht bij het midden van het venster. Indien nodig de geplaatste gat om de micrometastasen naar het midden van het venster meenemen vergroten het gat enigszins aan de respectievelijke zijde.
- Plaats het dier in een speciaal ontworpen restrainer die ontworpen Z-gerichte beweging (figuur 1D) op een stalen plaat die is geplaatst op een thermostatisch (elektrisch) verwarmingsdeken elimineren onder een fluorescentie microscoop. Controle lichaam van het diertemperatuur met behulp van een rectaal thermistor. Stel de schroeven van het dier weerhouder en de inspiratie druk op de ventilator om optimale controle van zijwaartse beweging te bereiken.
Opmerking: Natuurlijke ademhaling bij zoogdieren heeft betrekking op alle drie de richtingen van de long beweging en borst uitbreiding: bilateraal, dorso-ventrale en cranio-caudale. Om de natuurlijke ademhaling beweging zoveel mogelijk behouden, is het belangrijk om z-richting compressie voor zover noodzakelijk minimaliseren. Omdat de Z-dimensionale beperking heeft het potentieel artefacten die van invloed bloedstroom en andere parameters invoeren, is het raadzaam om condities constant te houden tijdens aantal herhaalde metingen in hetzelfde dier.
- Verwijder het vel van de zijkant van de borst waarbij de metastasen zich, door het creëren van een incisie, en vervolgens verwijderen van de huid met behulp van stompe dissectie.
4. Imaging en waardering van Microcirculatoire Blood Flow
- Verzamel rode bloedcellen via hartpunctie en labelen met Dil (1,1 = -dioctadecyl 3,3,3 = 3 = tetramethyl-indocarbocyanine perchloraat), zoals eerder beschreven 10.
- Injecteer 300 ui gelabelde rode bloedcellen in de staartader van de rat voor het raam kamer operatie wordt uitgevoerd, eerst door hechting effecten op het glasraam voorkomen. Verwijder luchtbellen in de spuit of katheter, zoals inbrengen van lucht in de ader zal verdere injecties remmen.
- Afbeelding bloedstroom met een microscoop CCD camera bij -40 ° C chip koeltemperatuur en ongeveer 100X algemeen resolutie (dwz met een 10x microscoop objectief en 10X pre-camera oculair). Gebruik standaard Rhodamine / TRITC filter sets (excitatie 450-490 nm, emissie> 515 nm). Noteer de werkelijke framesnelheid en pixel resolutie van het resulterende beeld sequenties. Record minstens 200 (idealiter rond 300) beelden per stapel, om een succesvolle analyse van de stroomsnelheid te garanderen.
- Vul vochtverlies in het dier door het injecteren ongeveer 1 ml zoutoplossing ip elk uur.
OPMERKING: Experimentele instellingen die een interventie te betrekken, bijvoorbeeldeen geneesmiddel dat de bloedstroomsnelheid in een longkanker metastase wijzigt, dat meerdere metingen van de bloedstroomsnelheid in pulmonaire metastatische kanker. Voor deze uitgebreide experimenten is het belangrijk om het dier voldoende vloeistof vullen. - Euthanaseren de dieren door infusie van 3 ml 3 N KCl in de staartader
- Evalueer het beeld stapels met behulp van een gepubliceerde, publiekelijk beschikbare Matlab-computer-algoritme, dat zal leiden tot stroomsnelheid grijswaarden en kleur gecodeerde kaarten voor alle bloedstroom sporen 10,11. De resulterende beelden in grijstinten met behulp van commerciële of openbare beeldanalyse software, zoals Image J, vervolgens evalueren na drempelen off waarden die aangeven geen beweging van bloedcellen, dwz geen actieve vaatstelsel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het vaatstelsel in solide tumoren is bekend dat het aanzienlijk afwijken van de normale bloedvoorziening, tonen een grotere mate van tortuositeit, en hogere INTERVASCULAR afstanden 13. Dienovereenkomstig bloedstroom tracks in experimentele pulmonaire borstkanker en sarcoom metastasen onregelmatige vormen en grote INTERVASCULAR gaten (figuur 2A, onderste twee panelen) vergeleken met de normale pulmonaire microcirculatie (Figuur 2A, bovenste paneel). In een eerdere studie, het ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een model wordt gepresenteerd dat haalbaar is om beeld verandert in de microcirculatie bloedstroom en andere dynamische processen in longmetastasen van ratten, met behulp opklaren en computationele bloedstroom analyse. Terwijl andere methoden bestaan om microscopie voeren op blootgestelde longen in de open borstkas van knaagdieren, dit model is ook de eerste die afbeelding longmetastasen door een borstwand perforatie in een gesloten kist setting. Met behulp van deze methode wordt de haalbaarheid aangetoond dat farmaco...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De wetenschappelijke adviezen van Drs. Timothy McMahon en Siqing Shan worden gewaardeerd. De presentatoren danken Drs. David Kirsch en Patricia Steeg voor de genereuze gift van de fluorescent gelabelde muissarcoom en metastaserende MDAMB-231 cellen, respectievelijk. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de U.S. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Prime Award Nummer N66001-10-C-2134, en gedeeltelijk door het Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Gebruik MicroCT om metastasen te detecteren |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Meng 100 ul verpakte rode bloedcellen met 100 ul van 0,5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml van 5% dextrose-oplossing in water, en vul op tot een eindvolume van 10 ml met zoutoplossing |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Apparaat is belangrijk om de positieve longdruk na toepassing van pneumothorax te handhaven |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscoop voor intravitale beeldvorming |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD-camera voor live beeldvorming van bloedstroom |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulsoximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescentiemicroscoop |
Referenties
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis. J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).
- Mayer, A., Vaupel, P. Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy. Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).
- Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. Tumor oxygen measurements and personalized medicine. Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Palmer, G. M., et al. Optical imaging of tumor hypoxia dynamics. Journal of biomedical optics. 15, (2010).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).
- Fontanella, A. N., et al. Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm. Microcirculation. , (2013).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, 385-393 (1994).
- Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free. The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).
- Evans, S. M., et al. Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiation research. 170, 677-690 (2008).
- Radiloff, D. R., et al. The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude. Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
