Een methode van permeabilisatie van Drosophila Embryo's voor Testen van Small Molecule Activiteit

Samenvatting

Introductie van kleine moleculen de ontwikkeling Drosophila embryo grote mogelijkheden voor het karakteriseren van biologische activiteit van nieuwe verbindingen, geneesmiddelen en toxinen en het tasten fundamentele ontwikkelingspaden. Werkwijzen hierin beschreven schetsen stappen natuurlijke barrières deze benadering overwonnen, het uitbreiden van de bruikbaarheid van de Drosophila embryo model.

Samenvatting

De Drosophila embryo is al lange tijd een krachtige laboratorium model voor het ophelderen van de moleculaire en genetische mechanismen die ontwikkeling te bepalen. Het gemak van genetische manipulatie met dit model farmacologische benaderingen die gemeengoed zijn in andere diermodellen en cel-gebaseerde testen verdrongen. Hier beschrijven we de recente ontwikkelingen in een protocol dat de toepassing van kleine moleculen in staat stelt om de zich ontwikkelende fruitvlieg embryo. De methode Gegevens stappen om de ondoordringbaarheid van de eierschaal weg te werken en levensvatbaarheid van het embryo. Eierschaal permeabilisatie in een breed scala van ontwikkelingsstadia wordt bereikt door toepassing van een eerder beschreven d-limoneen embryo permeabilisatie oplosmiddel (EPS ¹⁾ en door veroudering embryo's bij verlaagde temperatuur (18 ° C) voorafgaand aan behandelingen. Bovendien wordt het gebruik van een ver-rode kleurstof (CY5) als indicator permeabilisatie beschreven die geschikt downstream toepassingen waarbij standaard rode en groene grieporescent kleurstoffen in levende en vaste preparaten. Dit protocol is van toepassing op studies met bioactieve verbindingen ontwikkelingsmechanismen sonde en voor studies ter evaluatie teratogene of farmacologische activiteit van ongekarakteriseerde kleine moleculen.

Inleiding

De Drosophila embryo blijft een van de beste model voor onderzoek naar de fundamentele mechanismen van ontwikkeling ² zijn. Deze krachtige model wordt ondersteund door een breed scala van moleculair genetische tools die manipulaties van in wezen elk gen toestaan ​​op elk tijdstip en op elke ontwikkelen orgel. Het kleine formaat, snelle ontwikkeling, en uitgebreide karakterisering van morfogenese van de Drosophila embryo maken het een model van de keuze voor genetische screens, waarvan vele hebben blootgelegd fundamentele ontwikkelingstrajecten ^3,4. Talrijke fenotypen in de Drosophila embryo zijn gekarakteriseerd en zijn gemakkelijk te interpreteren, vaak een middel om onderliggende moleculaire genetische mechanismen verantwoordelijk voor een abnormale eigenschap te identificeren.

Historisch gezien is een tekortkoming van de vlieg embryo model de moeilijkheid van de invoering van kleine moleculen om embryoweefsel geweest. Deze hindernis heeft beperkingen gesteld op: 1) using bekende bioactieve kleine moleculen als probes voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen ondervragen en 2) het gebruik van dit model vastgesteld op teratogene of farmacologische activiteit van ongekarakteriseerde kleine moleculen te evalueren. Bijgevolg heeft de screening mogelijk van de vlieg embryo onvoldoende benut in de karakterisering van moleculen activiteit.

Levering van kleine moleculen aan de vlieg embryo kan worden bereikt met twee methoden: 1) permeabilisatie van de eierschaal en 2) micro-injectie. Dit artikel presenteert voorschotten aan de methode van permeabilization die eenvoudig uit te voeren in de setting van een conventionele Drosophila laboratorium zijn. Opgemerkt zij dat de recente ontwikkelingen in micro-injectie methoden microfluïdische technologie ook bij aan werkwijzen voor het inbrengen verbindingen om de embryo ^5,6. Introductie van moleculen aan het embryo wordt verhinderd door een waslaag van de eierschaal ^7. De Drosophila eierschaal bestaat uit vijf lagen. Vanbinnen naar buiten zijn ze: de vitelline membraan, de waslaag, de binnenste laag chorion, de endochorion en de exochorion ^8. De drie buitenste chorion lagen kunnen worden verwijderd door korte emersion van het embryo in verdund bleekwater, genoemde stap als dechorionation. De blootgestelde wasachtige laag kan vervolgens worden aangetast door blootstelling aan organische oplosmiddelen, zoals heptaan en octaan ^7,9, waardoor de dechorionated embryo permeabel, maar blijft ingekapseld in de onderliggende vitelline membraan. Echter, het gebruik van deze oplosmiddelen introduceert complicaties vanwege hun toxiciteit en de moeilijkheid bij het ​​reguleren van hun sterke permeabilisatie actie die beide sterk negatieve gevolgen embryouitvoerbaarheid ^9,10.

Werkwijze voor permeabilisatie met een samenstelling genoemd embryo permeabilisatie oplosmiddel (EPS) is eerder beschreven ^1. Dit oplosmiddel bestaat uit d-limoneen en planten-afgeleide oppervlakteactieve stoffen die het oplosmiddel in staat miscibl te zijne met waterige buffers. De lage toxiciteit van d-limoneen en het vermogen om het oplosmiddel te verdunnen tot de gewenste concentratie is een effectieve methode om permeabel embryo's met hoge levensvatbaarheid ¹ genereren opgeleverd. Evenwel twee endogene factoren blijven beperkingen aan de toepassing brengen. Eerste, embryo's tonen heterogeniteit in permeabiliteit na een EPS-behandeling, zelfs wanneer zorg is genomen om dicht ontwikkelingsstoornissen enscenering te handhaven. Ten tweede, embryo ouder dan ongeveer acht uren zijn moeilijk te permeabiliseren, consistent met een verharding van de eierschaal die optreedt na eierleggende ¹¹ bewezen.

Hier beschreven zijn vooruitgang in de EPS methode: 1) helpen bij het identificeren en analyseren van bijna identiek gepermeabiliseerde embryo, zelfs na fixatie en immunokleuring stappen zijn uitgevoerd en 2) mogelijk permeabilisatie van embryo's in de late ontwikkelings tijdstippen (> 8 uur, stadium 12 jaar en ouder). Met name de toepassing van een ver-rode kleurstof,CY5 carbonzuur, wordt beschreven dat dient als een indicator permeabiliteit, die blijft in het embryo tijdens de ontwikkeling en na formaldehyde fixatie. Bovendien wordt aangetoond dat opvoeding embryo bij 18 ° C houdt de schalen per EPS gevoelige toestand, waardoor permeabilisatie laat stadium embryo (stappen 12-16).

Deze vooruitgang overwinnen van de eerder genoemde beperkingen van de EPS methode. Deze toepassing zal daarom voorzien de onderzoekers een middel om kleine moleculen van belang kennismaken met de embryo in verschillende ontwikkelings tijdstippen behoud levensvatbaarheid.

Protocol

1. Voorbereiding van Fly Culturen, Solutions, en Embryo Handling Devices

1. Bereid een kooi cultuur van Drosophila. Plaats 500 + paring vliegen van de gewenste spanning in een populatie kooi voorzien van een 10 cm druif-agar plaat en een plek van gistpasta. Handhaaf cultuur in een 25 ° C vochtigheid incubator. OPMERKING:   Cage culturen vereisen een dag of twee van conditionering om consistente embryo legpatronen verkrijgen. Druif platen met gistpasta worden een keer veranderd in de ochtend en een keer 's avonds tijdens het conditioneren.
2. Bereid EPS. Warme oplossingen van oppervlakteactieve stoffen (cocamide DEA en geëthoxyleerde alcohol) bij 37 ° C. Pipetteer 18 ml van d-limoneen een glazen scintillatieflesje met een kleine roerstaaf. Pipetteer 1 ml elk van beide oppervlakteactieve stoffen (5% eindconcentratie van elk) op de d-limoneen. Meng goed en verwijder roerstaafje. Opmerking: Deze voorraadoplossing van EPS is goed voor ongeveer 2 maanden bij kamertemperatuur. De oplossingworden opgewarmd tot 37 ° C en gewerveld volledig oplosbaar oppervlakteactieve vóór gebruik. EPS en d-limoneen worden bewaard in een glazen container die sommige kunststoffen oplossen tijd.
3. Bereid embryo dechorionation oplossing, incubatie mediums, kleurstof en drugs oplossingen. Meng 25 ml bleekwater met 25 ml H ₂ O en plaats in ondiepe schaal. Bereid gemodificeerd uitgangsmateriaal incubatiemedium (MBIM) en MBIM-T volgens de bekende recept ^1,12. Bereid Shields en Sang M3 celcultuurmedium en PBS volgens protocol van de fabrikant (zie Materials List). Bereid voorraad oplossing van permeabilization kleurstof bij 10 mM concentratie in DMSO.
4. Monteer embryo-handling apparatuur en benodigdheden:
   1. Bereid dechorionation en EPS behandeling mand (zie figuur 1A). Snijd een 3 cm doorsnede van een wegwerp 50 ml polypropyleen centrifuge / cultuur buis met een zaag met fijne tanden. Maak het oppervlak lassen flush door de afdeling buis op schuurpapier gehandeld wrijveneen benchtop oppervlak. Las de sectie buis Nitex nylon mesh door het smelten van de rand van de buissectie op een vlam en drukken op het gaas op een glasplaat. Laat afkoelen en snijd eenmalige extra mesh. OPMERKING: De pure zijkanten en de bodem zorgen voor een snelle en volledige afspoelen van de resterende bleekmiddel en EPS bij de respectieve stappen. De lassen stappen moeten onder een zuurkast worden uitgevoerd.
   2. Bereid een ontwikkeling mand. Snijd bovenste gedeelte van een 50 ml centrifuge / kweekbuis gelijk met de rand van de dop. Verwijder de dop wijzigen door snijden een centrale opening en inkepingen langs de rand zoals getoond in figuur 1B. Schroef de kap over de maas en op de schroefdraad van de afgesneden buis sectie en trim extra mesh. OPMERKING: De kap bevat uitsparingen in de rand die diffusie toestaan ​​de bulk medium wanneer het zich in het reservoir 60 mm schaal (figuur 1B).
   3. Bereid onderdelen van een dia kamer. Snij een vierkant van DO membraan dat groter is dande dia kamer opening. Breng een zeer dunne laag vacuüm vet aan de binnenzijde rand van de opening. Bevestig de DO membraan in de opening te dichten tegen het vet met de borgring. Knip extra DO membraan door te snijden terug dicht bij de ring. OPMERKING:. Specificaties voor de dia kamer kan worden gevonden in Kiehart et al. ¹³ Deze kamer is niet commercieel beschikbaar en vereist aangepaste fabricage door een machine winkel.

2. Staging, Dechorionation en EPS Behandeling van embryo's

1. Staging embryo's door getimede collectie. Stel een verse druiven / gist plaat om de fly cultuur kooi in de AM. Laat embryo's worden vastgesteld gedurende 1 uur bij 25 ° C. Gooi deze plaat en vervangen door een verse druiven / gist plaat voor een volgende embryo leggen van 2 uur bij 25 ° C. Verzamelen deze plaat en plaats in 18 ° C incubator voor verdere ontwikkeling enscenering. Opmerking: 1 uur van ontwikkeling bij 25 ° C gelijk aan 2 uur van ontwikkelingbij 18 ° C. Het effect van veroudering bij 18 ° C versus 25 ° C op behoud EPS permeabilisatie in een vergevorderd stadium embryo's te zien in figuur 2.
2. Dechorionation. Voorzichtig afspoelen embryo off van druif plaat in gaasmand gebruik 25 ° C kraanwater en een penseel. Spoel overtollige gist weg van de embryo's in de mand onder een zachte stroom van kraanwater. Dompel de mand in 50% bleekwater gedurende 2 minuten. Was de embryo's grondig onder een stroom van kraanwater. OPMERKING: voorzichtig spuiten bleekwater oplossing op de embryo's met tussenpozen met een plastic pipet. Terwijl 2 min is meestal voldoende voor een volledige dechorionation, dient deze incubatietijd worden gecontroleerd door rechtstreeks onderzoek en dienovereenkomstig aangepast. Handhaaf dechorionated embryo's in de mand ondergedompeld in kraanwater en meteen doorgaan naar de EPS stap.
3. EPS Behandeling
   1. Neem zes 60 mm gerechten met ongeveer 10 ml PBS in elk. Bereid EPS verwatering door het oplossen van 75 ul EPS in 2,925 ml MBIM (01:40) in een 50 ml bekerglas met wervelende. Opmerking: Een witte emulsie vormen van dit mengsel.
   2. Dep het overtollige water uit de onderkant van het gaas mand met een lab te vegen. Dompel mand verdunde EPS in beker en onmiddellijk wervelen om embryo dispergeren in de EPS oplossing in de bodem van de mand. Doorgaan wervelende beweging gedurende 30 sec. OPMERKING: EPS verdunningen en blootstellingstijden kunnen worden gevarieerd om permeabiliteit controleren. Aanbevolen wordt optimaal EPS verdunningen en behandeltijden empirisch worden vastgesteld met de stammen van vliegen gebruikt. Toenemende blootstelling tijd om 60-90 sec is gunstig voor fase 12 en ouder embryo's.
   3. Verwijder mand, dep overtollige EPS weg met een lab te vegen. Ga door zes opeenvolgende wassingen in 10 ml PBS in 60 mm schalen. Gebruik een plastic pipet zachtjes spuiten embryo's met PBS in elk van de zes wasbeurten. Ga verder met verven en stappen behandeling met geneesmiddelen. OPMERKING: EPS kan worden afgevoerd door de gootsteen.

3. Dye and Drug Behandeling van gepermeabiliseerde embryo

1. Dye Behandeling
   1. Voeg 5 ui 10 mM CY5 carbonzuur kleurstof * 1 ml MBIM-T (50 uM eindconcentratie) in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vortex mengen. OPMERKING: * Keuze uit kleurstof afhankelijk van downstream analyse. CY5 carbonzuur is effectief voor de daaropvolgende analyses met behulp van fixatie en immunokleuring. Rhodamine B is bruikbaar voor de analyse van levende embryo. De rode emissie van Rhodamine B, en de groene emissie van zijn metabolieten ^1, kan een aantal complicaties met downstream-toepassingen met behulp van fluorescentie presenteren. Geneesmiddel of toxine kunnen worden toegevoegd aan de kleurstofoplossing behandeling initiëren in dit stadium of drug / toxine behandeling beperken tot een impuls in dit stadium. Zorg moeten worden genomen om te verwerken en afvoeren van drugs en toxinen volgens VIB en milieuveiligheidsnormen.
   2. Transfer embryo's uit het gaas mand om de kleurstof oplossing met behulp van een penseel. Doe het buisje dicht en herhaaldelijk omkeren om ervoor te zorgen deembryo's zweven vrij in suspensie in de kleurstof oplossing. Plaats buis op een schudder wip voor 15 min bij kamertemperatuur geroerd.
   3. Verwijder buis uit nutator en laat embryo's te regelen. Verwijder kleurstofoplossing met een fijne pipet en vervangen door 1 ml MBIM-T te wassen. Omkeren buis om opnieuw te schorten embryo's volledig. Laat embryo's te regelen en te herhalen met drie meer MBIM-T wasbeurten. Verwijder alle MBIM-T uit laatste spoeling en ga verder met incubatie stap.
2. Incubatie voor embryo-ontwikkeling
   1. Transfer embryo tot een van de twee kamers: De ontwikkeling mand of de dia kamer. OPMERKING: De ontwikkeling mand heeft de voorkeur voor een periode langer ontwikkelingsstoornissen, en is nodig als de daaropvolgende vaststelling en immunostaining stappen moeten worden uitgevoerd. De dia kamer is optimaal voor hogere resolutie time-lapse imaging en is het meest effectief voor korte ontwikkelings periodes (bv. de vroege embryonale gebeurtenissen). Geneesmiddel of toxine kan aan het medium worden toegevoegd in verschillende concentraties en embryo dNTWIKKELING kunnen in real-time met levende embryo of een eindpunt met standaard fixatie en immunokleuring protocollen.
   2. Ontwikkeling in Manden
      1. Reinig een ontwikkeling mand door te spuiten met 70% ethanol, goed naspoelen met demi water en dep droog met lab vegen. Bereid 6 ml incubatiemedium met de gewenste concentratie geneesmiddel of toxine. Plaats de ontwikkeling mand in medium in 60 mm schaal en zorg ervoor dat niet val luchtbellen onder de spiraalbodem. OPMERKING: twee media worden vaak gebruikt: MBIM alleen of MBIM/M3 in een 50:50 mengsel, waarbij de laatste effectiever langer ontwikkeling.
      2. Transfer gepermeabiliseerde embryo oppervlakte maas in de basis van de mand met een penseel. Zachtjes spuiten de embryo's met media uit de omliggende reservoir. Dispergeer de embryo's met de verfkwast, zodat ze in een monolaag op het gaas. OPMERKING: Ga verder met microscopie beeldvorming en evalueren permeabilisatie en levensvatbaarheid kenmerken van de preparation (zie stap 4).
   3. Ontwikkeling in de Slide Kamer
      1. Omkeren dia kamer en breng een kleine kraal van vacuüm vet aan de rand van de opening. Breng 150 pi medium met de gewenste hoeveelheid geneesmiddel of toxine op het oppervlak van DO membraan in de opening. OPMERKING: twee media worden vaak gebruikt: MBIM alleen of MBIM/M3 in een 50:50 mengsel, waarbij de laatste effectiever langer ontwikkeling.
      2. Transfer gepermeabiliseerd's naar de daling van de media met een penseel. De verspreiding van de embryo's waardoor ze zich te vestigen op het membraan in de drop.
      3. Een verlaging van 25 mm rond dekglaasje voorzichtig over de opening waardoor het medium afvlakken. Zachtjes druk langs de omtrek van het dekglaasje om een ​​afdichting met het vet vormen. OPMERKING: Ga verder met beeldvorming microscopie om permeabilisatie en levensvatbaarheid kenmerken van het preparaat te evalueren (zie stap 4).

4. Identicatie van gepermeabiliseerde levensvatbare embryo

1. Identificeer gepermeabiliseerd embryo's. Let op embryo's onder epifluorescentie met een microscoop uitgerust met een digitale camera. Acquire beelden van verschillende gebieden met behulp van vaste microscoop en camera-instellingen (in de blauwe golflengte om het gebruikersprofiel dooier autofluorescentie bepalen).
2. Bepaal permeabilisatie van embryo's op basis van relatieve fluorescentie-intensiteit. Gebruik een stereomicroscoop met een grote werkafstand aan de mand te vangen en manipulaties van de embryo's mogelijk te maken. De microscoop moet worden uitgerust met een programmeerbare XYZ fase epifluorescentie verlichting en een digitale camera. Het imago van de embryo's en zorg ervoor dat de belichting en podium positie parameters van elke afbeelding embryo opnemen herevaluatie van dezelfde embryo's mogelijk te maken op een later tijdstip (zie representatief resultaat in figuur 3). OPMERKING: Patronen van kleurstofopname zal variëren naargelang de gebruikte kleurstof, de blootstellingsduur en embryo leeftijd. Een breed scalaopname van kleurstof in een preparaat is typisch en weerspiegelt de variatie in de mate van permeabilisatie.
3. Identificeer levensvatbare embryo's. Na markeren positie van gepermeabiliseerde embryo verder met embryonale ontwikkeling bij kamertemperatuur of 25 ° C. Terug mand of dia kamer naar microscoop. Controleer onder blauwe kanaal fluorescentie en het verwerven beeld van dooier autofluorescence in eerder geïdentificeerde gepermeabiliseerde embryo's. Beoordelen levensvatbaarheid volgens de normale progressie van de dooier distributie (zie Rand et al.. ¹ en representatief resultaat in figuur 3). OPMERKING: Andere morfologische kenmerken van het embryo waargenomen met helderveld microscopie kan worden gebruikt om levensvatbaar zal zijn. Het wordt aanbevolen dat de vaststelling van het niveau van de permeabiliteit die compatibel zijn met de levensvatbaarheid is empirisch bepaald worden met elke kleurstof en spanning van het vliegen gebruikt.
4. Evalueer geneesmiddel of toxine effecten in gepermeabiliseerde levensvatbare embryo's.
5. Embryo's processed met het bovenstaande protocol zijn klaar voor een aantal conventionele analyses volgend op drugs of blootstelling toxine. Verscheidene verschillende soorten analyses worden beschouwd in onderstaande discussie en omvatten directe waarneming van morfogenese in levende embryo's alsmede post-fixatie immunokleuring analyses. Beide benaderingen worden verbeterd door toepassing van vitale kleurstoffen (bijvoorbeeld GFP) dat genexpressiepatronen en cellijn en morfologie profielen onthullen.

Resultaten

Embryo handling apparaten worden afgebeeld in figuur 1 om te helpen bij het ​​visualiseren van de "home-made" inrichtingen voor manipulatie in de bovenstaande protocollen. Resultaten getoond in figuur 2 illustreren de sterke effect van het houden embryo's bij 18 ° C op hun vermogen om te worden permeabel gemaakt door EPS in de late stadia van ontwikkeling. Deze voorwaarde wordt toegepast in het protocol stap 2.1. Werkzaamheid van de CY5 carbonzuur kleurstof de verschillend...

Discussie

De bovenstaande methode schetst een middel tot het verkrijgen van levensvatbare Drosophila embryo's die toegankelijk is voor kleine molecule behandelingen in een breed scala ontwikkelingsstoornissen zijn. Deze methode introduceert de nieuwe en eenvoudige vaststelling dat veroudering embryo's bij 18 ° C maakt permeabilization van laat stadium embryo's met dezelfde werkzaamheid zoals eerder alleen gezien in een vroeg stadium embryo's. Bovendien is het gebruik van de ver-rode kleurstof CY5 carbonzu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fly Cage	Flystuff.com	59-101	http://flystuff.com/general.php
Cocamide DEA [Ninol 11-CM]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
d-limonene (Ultra high purity grade)	Florida Chemical Co.	call for special order	http://www.floridachemical.com/
Sodium hypochlorite	Fisher	SS290-4	http://www.fishersci.com/
Tween-20	Fisher	BP337	http://www.fishersci.com/
PBS poeder	Sigma	56064C	http://www.sigmaaldrich.com/
Rhodamine B	Sigma	R6626	http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 carbonzuur	Lumiprobe	#23090	http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSO	Sigma	472310-100	http://www.sigmaaldrich.com/
Shields en Sang M3 medium	Sigma	S8398	http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex Nylon mesh	Flystuff.com	57-102	http://flystuff.com/misc.php
Opgeloste zuurstof (DO) membraan	YSI	#5793	http://www.ysireagents.com/search.php
25 mm circulair no.1 dekglas	VWR	48380-080	https://us.vwr.com/
Grape-agar plaatmix	Flystuff.com	47-102	http://flystuff.com/media.php
Nutator	VWR	82007-202	https://us.vwr.com/