Een Ex vivo Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de dissectie van embryonale schildklier aanleg bij muizen en de kweek van explantaten op semiporeuze filters of op plastic dia's voor microscopie. Dit systeem is ideaal om morfogenetische of differentiatiegebeurtenissen te bestuderen die plaatsvinden tijdens de schildklierontwikkeling van wildtype of knockout embryo's, en is geschikt voor gain- en loss-of-function experimenten.

Samenvatting

De schildklier is een endocriene klier bilobated gelokaliseerd aan de basis van de hals, waardoor de schildklierhormonen T3, T4 en calcitonine. T3 en T4 worden geproduceerd door gedifferentieerde thyrocytes georganiseerd in gesloten gebieden genoemd follikels, terwijl calcitonine wordt gesynthetiseerd door C-cellen afgewisseld tussen de follikels en een dicht netwerk van bloedvaten. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn uitvoerig beschreven en bestudeerd, de vorming van de "angio-folliculaire" eenheden, de verdeling van C-cellen in het parenchym en paracriene communicatie tussen epitheel-en endotheelcellen is verre van duidelijk.

Deze methode beschrijft de opeenvolgende stappen van muis embryonale schildklier anlagen dissectie en haar cultuur op semiporous filters of op microscopie plastic dia's. Binnen een periode van vier dagen, deze cultuur systeem trouw recapituleert in vivo schildklier ontwikkeling. Namelijk (i) bilobation van het orgel plaatsvindt (bij E12.5 explantaten), (ii) thyrocytes voorlopers ordenen in follikels en polariseert, (III) thyrocytes en C-cellen differentiëren, en (iv) endotheelcellen in de gemicrodissecteerde weefsel prolifereren, migreren in de schildklier lobben, en nauw te betrekken bij de epitheelcellen, zoals ze doen in vivo.

Schildklier weefsel kan worden verkregen bij wild type, knockout of fluorescerende transgene embryo's. Bovendien explantaten cultuur kan worden gemanipuleerd door toevoeging van inhibitoren, blokkerende antilichamen, groeifactoren, of cellen of geconditioneerd medium. Ex vivo ontwikkeling kan in real time worden geanalyseerd, of op elk moment van de cultuur door immunokleuring en RT-qPCR.

Tot slot, de schildklier explantaatkweek gecombineerd met downstream hele-mount of op de afdelingen beeldvorming en profilering van genexpressie biedt een krachtig systeem voor het manipuleren en bestuderen van morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen van de schildklier organogenesis.

Inleiding

De schildklier is een verzameling van onafhankelijke epitheliale bolletjes, de zogenaamde follikels, omgeven door een dicht netwerk van endotheel haarvaten. Deze organisatie maakt schildklierfunctie: endotheliale capillairen voorzien thyrocytes met jodium, vereist voor T3 en T4 hormoonsynthese en deze laatste op het hele lichaam verspreiden. Verspreid tussen de follikels en haarvaten, C-cellen produceren het hormoon calcitonine hypocalcemieperioden ^1. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn bekend, de cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de schildklier embryonale ontwikkeling (follikel vorming en differentiatie) z....

Protocol

Muizen werden opgevoed en behandeld volgens de principes van proefdier verzorging van de Universiteit Animal Welfare Committee. Alle procedures en protocollen werden goedgekeurd door deze commissie.

1. Coating van Microscopie Plastic Cultuur Chambers

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. De twee soorten coating functioneel gelijkwaardig.

1. Coat plastic cultuur kamers met fibronectine een dag voorafgaand aan de isolatie van de schildklier weefsels:
   1. Verdun steriele fibronectine tot 50 ug / ml eindconcentratie in M199 medium aangevul....

Resultaten

Schildklier anlages (middellijn en UB, samen met omliggende weefsels) en schildklier lobben ontleed uit muizenembryo's op E12.5 en e13.5/e14.5 respectievelijk (figuur 1). Na een dag in kweek op filterpapier, de middellijn Anlage zichtbaar (Figuur 2A) als langwerpig weefsel verspreid bovenop de luchtpijp. Het vormt steeds twee lobben aan weerszijden van de luchtpijp. Als geïsoleerd schildklier lobben (E13.5 of E14.5) worden gekweekt, zullen ze uitbreiden, ondergaan morfogenese en epi.......

Discussie

Dit document beschrijft een werkwijze voor het ontleden en kweken schildklier explantaten (E12.5) of lobben (E14.5) teneinde te bestuderen en beter inzicht in de complexe gebeurtenissen die leiden tot de vorming schildklier. Door de dubbele oorsprong van de schildklier Anlagen (de middellijn anlage en twee laterale ultimobranchial organen), en hun geringe omvang, een fragment van E12.5 weefsel gelokaliseerd rostraal van de kieuwboogarteriën en met de luchtpijp, maar niet de slokdarm wordt gemicrodissecteerde. Zoals geïl.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, steriele	proxylab	80826
Collageen type I, rattenstaart	Millipore	08-115
Fibronectin uit humaan plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Wolfraamdraad	Goodfellow	LS237450
cultuurplaatje-inzet (12 mm diameter)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherine	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261