Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de dissectie van embryonale schildklier aanleg bij muizen en de kweek van explantaten op semiporeuze filters of op plastic dia's voor microscopie. Dit systeem is ideaal om morfogenetische of differentiatiegebeurtenissen te bestuderen die plaatsvinden tijdens de schildklierontwikkeling van wildtype of knockout embryo's, en is geschikt voor gain- en loss-of-function experimenten.

Samenvatting

De schildklier is een endocriene klier bilobated gelokaliseerd aan de basis van de hals, waardoor de schildklierhormonen T3, T4 en calcitonine. T3 en T4 worden geproduceerd door gedifferentieerde thyrocytes georganiseerd in gesloten gebieden genoemd follikels, terwijl calcitonine wordt gesynthetiseerd door C-cellen afgewisseld tussen de follikels en een dicht netwerk van bloedvaten. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn uitvoerig beschreven en bestudeerd, de vorming van de "angio-folliculaire" eenheden, de verdeling van C-cellen in het parenchym en paracriene communicatie tussen epitheel-en endotheelcellen is verre van duidelijk.

Deze methode beschrijft de opeenvolgende stappen van muis embryonale schildklier anlagen dissectie en haar cultuur op semiporous filters of op microscopie plastic dia's. Binnen een periode van vier dagen, deze cultuur systeem trouw recapituleert in vivo schildklier ontwikkeling. Namelijk (i) bilobation van het orgel plaatsvindt (bij E12.5 explantaten), (ii) thyrocytes voorlopers ordenen in follikels en polariseert, (III) thyrocytes en C-cellen differentiëren, en (iv) endotheelcellen in de gemicrodissecteerde weefsel prolifereren, migreren in de schildklier lobben, en nauw te betrekken bij de epitheelcellen, zoals ze doen in vivo.

Schildklier weefsel kan worden verkregen bij wild type, knockout of fluorescerende transgene embryo's. Bovendien explantaten cultuur kan worden gemanipuleerd door toevoeging van inhibitoren, blokkerende antilichamen, groeifactoren, of cellen of geconditioneerd medium. Ex vivo ontwikkeling kan in real time worden geanalyseerd, of op elk moment van de cultuur door immunokleuring en RT-qPCR.

Tot slot, de schildklier explantaatkweek gecombineerd met downstream hele-mount of op de afdelingen beeldvorming en profilering van genexpressie biedt een krachtig systeem voor het manipuleren en bestuderen van morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen van de schildklier organogenesis.

Inleiding

De schildklier is een verzameling van onafhankelijke epitheliale bolletjes, de zogenaamde follikels, omgeven door een dicht netwerk van endotheel haarvaten. Deze organisatie maakt schildklierfunctie: endotheliale capillairen voorzien thyrocytes met jodium, vereist voor T3 en T4 hormoonsynthese en deze laatste op het hele lichaam verspreiden. Verspreid tussen de follikels en haarvaten, C-cellen produceren het hormoon calcitonine hypocalcemieperioden ^1. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn bekend, de cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de schildklier embryonale ontwikkeling (follikel vorming en differentiatie) zijn verre van begrepen.

Tijdens de embryogenese, thyrocytes voorlopercellen afkomstig is als een verdikking (de middellijn anlage) van de ventrale wand van de voordarm endoderm op embryonale dag (e) 8.5 in de muis embryo, terwijl de C-cellen voorlopercellen ontstaan ​​bij E11.5 als druppel-vormige uitsteeksels ( de ultimobranchial bodies) van het vierde faryngeale zakjes ^2-6. De middellijn knop los dan van het endoderm, breidt bilateraal fuseren op E13.5 de ultimobranchial organen aan elke kant van de luchtpijp. Tenslotte thyrocytes organiseren in follikels en C-cellen differentiëren.

Huidige kennis over schildklier vorming komt vooral van histologische analyse van vaste weefsels, maar de morfogenetische gebeurtenissen betrokken bij de vorming van de schildklier zijn zeer dynamisch en communicatie en interacties tussen verschillende celtypen en met de extracellulaire matrix te betrekken. Recent onderzoek toonde aan dat thyrocyte voorlopers van hoge niveaus van VEGF in endotheelcellen de ontwikkeling schildklier, en, beurtelings, gerekruteerd endotheelcellen bevorderen follikel vorming en C-cellen differentiatie ^7.

De meeste ex vivo studies over de schildklier zijn uitgevoerd op geïsoleerde volwassen schildklier-afgeleide cellen, geteeld op 2D weefselkweek plastic dishes of in 3D matrices. Gebruik van dit soort culturen, gedifferentieerde folliculaire cellen ofwel blijven gepolariseerd en georganiseerd als follikels of opnieuw op te pakken van een 3D-organisatie ^8-10. Echter, deze zuivere epitheelcellen, geëxplanteerd van de fysiologische omgeving, en gekweekt in 2D, negeren interacties met de extracellulaire matrix, cytokinen, groeifactoren en andere celtypes zoals endotheliale of zenuwen cellen die zij normaal tegenkomen in vivo. Een zeer mooie studie die onlangs beschreef een differentiatie protocol van ES-cellen in de schildklier follikels met behulp van een laatste cultuur stap in 3D matrigel ^11. Echter, deze 3D culturen missen contact met andere celtypen.

Op basis van eerdere kennis over pancreas en speekselklieren orgelcultuur ^12-14 is een werkwijze voor het ontleden muis embryonale schildklier Anlagen en kweken van de explantaten op semiporous filters of microscopie plastic objectglaasjes ontwikkeld.

Wanneerwerken met E12.5 embryo's, de dubbele oorsprong van de schildklier Anlagen (de middellijn anlage en de twee zijdelingse ultimobranchial lichamen) opgelegd de microdissection van een groot fragment van weefsel. Dit bevatte de luchtpijp, maar niet de slokdarm en uitgebreid van de kieuwboogarteriën tot de arytenoid zwelling. Wanneer gekweekt op filters, de middellijn Anlage zich lateraal aan weerszijden van de luchtpijp, waar fuseren met de ultimobranchial lichamen de twee lobben schildklier, nog verbonden door een smalle landengte vormen.

In cultuur epitheelcellen prolifereren, organiseren in follikels en differentiëren in thyrocytes en C-cellen, afhankelijk van hun oorsprong. Endotheelcellen in de gemicrodissecteerde weefsel ook vermenigvuldigen en binnenvallen de schildklier lobben om eindelijk nauw te betrekken bij de epitheliale folliculaire structuur, onafhankelijk van de bloedstroom of circulerende factoren. Aangezien ontwikkeling van de explantaten trouw recapituleert in vivo ontwikkelingment, deze cultuur systeem optimaal te morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen tijdens schildklier ontwikkeling te bestuderen.

Schildklier weefsels kunnen worden verkregen bij wild type, knockout of fluorescerende transgene embryo's, en de cultuur systeem vatbaar is voor verlies-en winst-of-function experimenten. Ten slotte kan time-lapse imaging van fluorescent gelabelde schildklier explantaten op microscopie plastic schaaltjes worden benut om de kinetiek en de continuïteit van morfogenetische bewegingen die zich voordoen in vivo beter te onderzoeken. Time-lapse imaging is al gebruikt om vertakking morfogenese van de alvleesklier ^15,16 of de ureterknop ¹⁷ bestuderen.

Protocol

Muizen werden opgevoed en behandeld volgens de principes van proefdier verzorging van de Universiteit Animal Welfare Committee. Alle procedures en protocollen werden goedgekeurd door deze commissie.

1. Coating van Microscopie Plastic Cultuur Chambers

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. De twee soorten coating functioneel gelijkwaardig.

1. Coat plastic cultuur kamers met fibronectine een dag voorafgaand aan de isolatie van de schildklier weefsels:
   1. Verdun steriele fibronectine tot 50 ug / ml eindconcentratie in M199 medium aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 0,25 ug / ml fungizon en 2 mM glutamine ^12.
   2. Bedek de putten met 200 pi van verdunde fibronectine en incubeer overnacht in een 4 ° C koelkast.
   3. Op de dag van de dissectie, zuig het fibronectine, spoel de putten eenmaal met M199 en voeg een minimaal volume van 200 gl M199 aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalfsserum.
   4. Laat de gecoate kamers in de incubator totdat klaar om de explantaten bord.
2. Coat plastic cultuur kamers met type I collageen 2 uur voor de isolatie van de schildklier weefsels:
   1. Verdun steriele type I collageen in een 50 ug / ml eindconcentratie van 10 mM HCI. LET OP: Houd collageen stamoplossing op ijs.
   2. Bedek de putjes met 200 ui verdund type I collageen en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT).
   3. Zuig het type I collageen, spoel de wells eenmaal met M199 en voeg een minimaal volume van 200 gl M199 aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalfsserum.
   4. Laat de gecoate kamers in de incubator totdat klaar om de explantaten plaat.

2. Dissectie van Schildklier Anlagen-bevattende weefsels (E12.5) of schildklier Kwabben (E13.5-e14.5)

OPMERKING: Gebruik schoon ontleden gereedschappen en Petri / cultuur platen. De algemene stappen en insnijdingen hieronder beschreven zijn dezelfde voor E12.5 en E14.5 embryo.

1. Sacrifice getimed-zwangere vrouwelijke muizen op de gewenste embryonale (e) dag (van E12.5 tot E14.5) en verwijder de baarmoeder met behulp ontleden instrumenten.
2. Plaats de ontleed baarmoeder in een 10 cm plaat met HBSS.
3. Houd een uiteinde van de baarmoeder met een tang en open de baarmoeder met een klein schaartje geleidelijk bevrijden alle embryo's.
4. Scheid de embryo's van de placenta met een schaar en de overdracht van de embryo's met hun extra-embryonale membranen in een nieuwe 10 cm plaat met HBSS.
5. Haal de dooierzak en het amnion. LET OP: Vanaf dit punt, werken onder een stereomicroscoop met transillumination van onderen; toenemende vergroting met dissectie stappen. Gebruik wolfraam naalden in glazen capillairen als ontleden gereedschap.
6. Met behulp van de naalden alseen mes en vork, verwijder het bovenste deel van de dieren, waarvan de bovenkaak en de oren (Figuur 1A, gesneden langs een).
7. Houd de embryo op zijn rug en verwijder eerst een extra stuk van de neurale buis (figuur 1A, gesneden langs b), dan het onderste deel van het embryo, net onder de voorste ledematen en boven het hart (Figuur 1B).
8. Breng de embryo slice met de tong (om het weefsel te oriënteren) en halsgebied in een nieuwe 10 cm plaat met HBSS.
9. Verwijder de neurale buis en weefsels van na de slokdarm / luchtpijp (figuur 1C, gesneden langs een).
10. Voorzichtig gedeelte weefselplak langs beide zijden van de tong (figuur 1C, gesneden langs b en b ').
11. Zoek de slokdarm-en luchtpijp, in het verlengde van de tong, en ontleden weg de tong, waardoor de arytenoid zwelling (figuur 1D, snijden langs een), en het weefsel aan both zijden van de slokdarm / luchtpijp (figuur 1D, snijd langs b en b ').
12. Verwijder de slokdarm, en plaats de luchtpijp met zijn ventrale zijde naar boven.
13. Ontleden weg de ongewenste weefsels zoals thymus (figuur 1E) en alle weefsels lateraal gelegen ten kieuwboogarteriën. Bij E13.5 en E14.5 embryo, visualiseren de schildklier lobben aan weerszijden van de luchtpijp (Figuur 1F; rode stippellijnen) en verder ontleden de lobben van de luchtpijp.
14. Breng de geïsoleerde E12.5 luchtpijp regio, of de E13.5-E14.5 schildklier lobben in een 35 mm cultuur plaat met voorverwarmde M199 medium aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalf serum. Transfer explantaten met een voorbevochtigd filter tip over een P-200 micropipet. Voor E12.5 explantaten, snijd het uiteinde van de tip om de opening te verbreden. OPMERKING: Routinematig, en als embryo hetzelfde genotype, stap 6 en 7 uitvoeren op alle embryo, den 9-11, en tenslotte 12 & 13.

3. Plating en cultuur van de Schildklier Explantaten

1. Was de explantaten achtereenvolgens overschrijving in drie putjes van een plaat met 24 putjes bevattende 1 ml voorverwarmde kweekmedium (= M199 aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalfsserum).
2. Plating van de schildklier lobben op gecoat microscopie plastic cultuur kamers:
   1. Zuig M199 kweekmedium van de gecoate kamers.
   2. Zorgvuldig, overdracht van de schildklier explants in de cultuur kamers met een micropipet en filter tips. Plaats een explant in het midden van elke kamer.
   3. Verwijder overtollig medium en plaats de kweekkamer in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% _CO2) gedurende 2 uur te laten de explantaten hechten aan de matrix.
   4. Voeg voorzichtig 200 tot 300 ul voorverwarmde kweekmedium aan elke well.
   5. Incubeer langetermijnkweek in weefselkweek incubator.
3. Plating of luchtpijp regio of schildklier lobben op semiporous filters:
   1. Vul het aantal putjes van een 24-wells plaat vereist met 330 ul voorverwarmde kweekmedium.
   2. Plaats filters (bv. 0,4 micrometer Millipore filter) op het medium, en zorg dat het opsluiten van luchtbellen onder de cultuur filter te voorkomen.
   3. Zorgvuldig met een micropipet en tipjes dragen de schildklier explantaten met een minimaal volume van medium naar het midden van de filters (maximum 4/filter).
   4. Verwijder de overmaat aan middelgrote en ruimte uit de explantaten met een wolfraam naald.
   5. Incubeer langetermijnkweek in weefselkweek incubator. OPMERKING: Verander kweekmedium om de andere dag onder de laminaire stroming kap. Cultuur de explantaten tot 7 dagen.

4. Whole-mount immunofluorescentiekleuring Protocol voor Schildklier Explantaten

Verjagen explantaten gekweekt op filters (na stap 2 hieronder) met behulp van wolfraam naalden offijn pincet en overdracht in een 24-wells plaat voor alle stappen, met uitzondering van primair (stap 5) en voortgezet (stap 7) antilichaam incubatie (96-well plaat). Voor hechtende explantaten gekweekt op microscopie plastic kamers, voeren alle stappen in de cultuur kamers.

1. Zuig M199 kweekmedium en zet de explantatie met ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten (500 pi in 24-putjes en 300 ul in microscoopglaasjes).
2. Was 2x 10 minuten in Tris gebufferde zoutoplossing met Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) bij KT.
3. Verwerk de explantaten onmiddellijk of bewaar bij -20 ° C. OPMERKING: Voor langdurige opslag bij -20 ° C, dehydrateren de explantaten in methanol met geleidelijk toenemende methanolconcentratie in TBST 100% methanol bereiken. Als u klaar bent om verder te gaan met de immunokleuring (stap 4), hydrateren de explantaten door geleidelijk toevoegen van TBST aan methanol.
4. Vervang TBST met blokkerende oplossing (10% normaal geit serum in TBST) En incubeer op een zee-zaag rocker gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
5. Verdun primaire antilichaam in het blokkeren van oplossing (100-200 ul per conditie). Breng de "filter" explantaten van een 24-wells plaat om een ​​96-well plaat. Incubeer explantaten met de primaire antilichamen op een zee-zaag rocker overnacht bij 4 ° C.
6. De volgende dag, gooi het primaire antilichaam oplossing, de overdracht van de "filter" explantaten terug in een 24-well plaat, en was ten minste vijf keer met TBST op een zee-zaag rocker 45-60 minuten elk bij RT.
7. Verdun secundair antilichaam (bijv. geit anti-X-Alexa Fluor bij 1:2000 verdunning) in TBST met 1% normaal geit serum en incubeer de explantaten met deze verdunning nachts op zee zaag rocker bij 4 ° C en in het donker. Voor nucleaire tegenkleuring bevatten 1 ug / ml bis-Benzimide (Hoechst) met het secundaire antilichaam oplossing.
8. De volgende dag, gooi het secundaire antilichaam oplossing en was 5x met TBST op een zee-zaagrocker 45-60 minuten elk bij RT. Tijdens het wast, houd de explantaten in het donker.
9. Voer een extra wassen in TBST voorzichtig schudden overnacht bij 4 ° C in het donker.
10. Postfix het immunologisch explantaten in 4% PFA bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
11. Wassen 2x 10 min. met TBST.
12. Breng de explantaten hetzij geleidelijk methanol 100% voor langdurige opslag bij -20 ° C, of ​​onmiddellijk geanalyseerd. Voor explantaten gekweekt op filters en immunostained in een 24-well plaat, overdracht in een microscopie kamer (bv. LabTek of Ibidi) met TBST of beter fluorescerende montage medium voorafgaand aan de analyse met een Multiphoton of confocale microscoop.

Extractie van RNA uit Schildklier 5.

Werken in een RNase-vrije omgeving. Gebruik daarom nucleïnezuur en nuclease gratis pipet tips en reinig zowel bank en apparatuur van contaminanten en RNases. Dit protocol is gebaseerd op fenol / chloroform, voeren de eerste staps (1 tot 7) onder een chemische kap.

1. Homogeniseren een schildklier explant of twee schildklier lobben met 300 ul van RNA-extractie-oplossing met behulp van een disposable stamper voor 1,5 ml tube. In tussen de monsters, was de stamper in 2% SDS, dan water, dan ethanol.
2. Voeg nog eens 100 ul RNA extractieoplossing, 10 seconden vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
3. Vortex gedurende 30 seconden en voeg 20 ng tRNA aan elk monster.
4. Vortex gedurende 1 minuut en voeg 80 ul van chloroform.
5. Vortex krachtig gedurende 30 seconden en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
6. Centrifugeren gedurende 15 minuten bij 19.000 xg in een gekoelde (4 ° C) gecentrifugeerd.
7. Transfer zorgvuldig de kleurloze bovenste waterige fase in een nieuwe buis met 20 ug van glycogeen als coprecipitatiemiddel.
8. Vortex en voeg 200 ul 100% isopropanol.
9. Vortex krachtig gedurende 15-30 seconden en laat RNA neerslag bij -20 ° C gedurende 2-3 uur of bij -80 ° C gedurende 1 uur.
10. Spin gedurende 30 minuten bij 19.000xg bij 4 ° C en elimineren supernatant.
11. Was de pellet met 450 ul koude 75% ethanol en vortex om de pellet los te maken.
12. Centrifugeren gedurende 10 minuten bij 19.000 xg bij 4 ° C en elimineren supernatant.
13. Droog de pellet onder de kap 5 minuten.
14. Resuspendeer de pellet met 10 ul van RNase-vrij water en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
15. Test RNA-concentratie, bewaar bij -80 ° C of achteruit transcriberen voor de analyse van genexpressie.

Resultaten

Schildklier anlages (middellijn en UB, samen met omliggende weefsels) en schildklier lobben ontleed uit muizenembryo's op E12.5 en e13.5/e14.5 respectievelijk (figuur 1). Na een dag in kweek op filterpapier, de middellijn Anlage zichtbaar (Figuur 2A) als langwerpig weefsel verspreid bovenop de luchtpijp. Het vormt steeds twee lobben aan weerszijden van de luchtpijp. Als geïsoleerd schildklier lobben (E13.5 of E14.5) worden gekweekt, zullen ze uitbreiden, ondergaan morfogenese en epi...

Discussie

Dit document beschrijft een werkwijze voor het ontleden en kweken schildklier explantaten (E12.5) of lobben (E14.5) teneinde te bestuderen en beter inzicht in de complexe gebeurtenissen die leiden tot de vorming schildklier. Door de dubbele oorsprong van de schildklier Anlagen (de middellijn anlage en twee laterale ultimobranchial organen), en hun geringe omvang, een fragment van E12.5 weefsel gelokaliseerd rostraal van de kieuwboogarteriën en met de luchtpijp, maar niet de slokdarm wordt gemicrodissecteerde. Zoals geïl...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, steriele	proxylab	80826
Collageen type I, rattenstaart	Millipore	08-115
Fibronectin uit humaan plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Wolfraamdraad	Goodfellow	LS237450
cultuurplaatje-inzet (12 mm diameter)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherine	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261