Statische adhesietest is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om het model van interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypes. Interacties worden gegenereerd door het injecteren gelabelde T-cellen in putjes bekleed met adhesiemoleculen, terwijl een plaatlezer wordt gebruikt om het aantal hechtende cellen te kwantificeren na seriële wasbeurten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
T lymfocyt adhesie vereist voor meerdere T-celfuncties, waaronder migratie naar plaatsen van ontsteking en vorming van immunologische synapsen met antigen presenterende cellen. T-cellen bereiken gereguleerde hechting door het regelen van de hechting van integrinen, een klasse van celadhesie moleculen die bestaan uit paren van heterodimere transmembraan eiwitten die interageren met doelmoleculen op partner cellen of extracellulaire matrix. De meest prominente T-cel integrine is lymfocytfunctie geassocieerd antigeen (LFA) -1, bestaande uit subeenheden aL en β2, waarvan het doel is de intracellulaire adhesie molecuul (ICAM) -1. Het vermogen van een T-cel adhesie controle afgeleid van de mogelijkheid om de affiniteit status van afzonderlijke integrines regelen. Inside-out signalering beschrijft het proces waarbij signalen binnen een cel ertoe leiden dat de externe domeinen van integrines aan een geactiveerde toestand aannemen. Veel van onze kennis van deze complexe fenomenen is gebaseerd op mechanistischestudies uitgevoerd in vereenvoudigde in vitro modelsystemen. T lymfocyten adhesieanalyse hier beschreven is een uitstekende tool waarmee T-cellen zich te houden aan doelwitmoleculen, onder statische omstandigheden, en vervolgens maakt gebruik van een fluorescerende plaat lezer om hechting te kwantificeren. Deze test is nuttig geweest bij het bepalen adhesie-stimulerende of remmende stoffen die op lymfocyten, en karakterisering van de signalerende gebeurtenissen betrokken. Hoewel de hier beschreven LFA-1 - ICAM-1 gemedieerde adhesie; Deze bepaling kan gemakkelijk worden aangepast om voor de studie van andere bindingsinteracties (bijvoorbeeld VLA-4 - fibronectine).
Inleiding
T lymfocyt adhesie is een fundamenteel proces in de immuunrespons 1. Het is noodzakelijk voor T-cel interactie met endotheelcellen versieren de capillaire wanden, scannen antigeen presenterende cellen (APC) in lymfklieren, en voor de vorming van immunologische synapsen (IS) met doelcellen 2. Deze eisen zijn functioneel en kinetisch onderscheiden. Het proces van lymfocyten extravasatie bestaat uit chemoattractie, rollende, stevige adhesie en transmigratie. De overgang van rollen om de hechting stevig vereist T-cellen om snel te reageren op een G-eiwit gekoppelde receptor signaal. Deze reactie levert een integrine ligand interactie die vertraagt ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Coating de Microplaat Wells
Opmerking: Het doel van deze stap is het bekleden van polystyreen oppervlakken ICAM-1 om te dienen als liganden voor T-cel LFA-1.
- Bereid de volgende oplossingen:
- Bereid de bekledingsoplossing door resuspenderen recombinant ICAM-1 met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, pH 7,4) verrijkt met calcium (1 mM CaCl2) en magnesium (2 nM MgCl2). Zorg ervoor dat de eindconcentratie van ICAM-1 is 10 ug / ml, gemaakt van een 0,7 mg / ml voorraadoplossing en in een -80 ° C vri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hieronder is een voorbeeld van adhesietest gebruik van primaire T-cellen gestimuleerd met verschillende concentraties anti-CD3 antilichamen. Het is nuttig om de fluorescentie van ongewassen cellen (dwz totale belading) kennen. Niet-gestimuleerde cellen dienen als een negatieve controle en PMA behandelde cellen zijn de positieve controle voor anti-CD3 antilichamen. Cellen uitgeplaat in putjes onbeklede dienen als controle voor ICAM-1. In een typisch experiment het percentage hechtende PMA behandelde cellen tusse.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende assays om signalen te bestuderen LFA-1 activatie en T celadhesie 12. Flowcytometrie wordt gebruikt voor LFA-1 affiniteit staten meten levende cellen met monoklonale antilichamen die selectief binden aan hetzij gebogen of uitgebreide LFA-1. Een van de beperkingen van deze methode is dat het geen rekening met de aviditeit integrinen. Migratie assays zijn nuttige hulpmiddelen, maar ze meten migratie, en niet miezerig hechting op een specifiek tijdstip. Muismodellen voor T-lymfocyten migrati.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Research Scholars fondsen, en de NYU Whitehead fellowship dit werk ondersteund.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate met optische bodem | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antilichamen | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS met calcium en magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Perifere lymfocyten | bijv. muis of mens | ||
| Magnesiumchloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calciumchloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Versie 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 en 50 ml centrifugebuizen | Fisher | 352099, 352070 | |
| Weggeef plastic Pasteur pipetten | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 kweekkolven | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T-cel verrijkingskit | StemCell Technologies | 15061 |
Referenties
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
