Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten

Summary

Statische adhesietest is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om het model van interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypes. Interacties worden gegenereerd door het injecteren gelabelde T-cellen in putjes bekleed met adhesiemoleculen, terwijl een plaatlezer wordt gebruikt om het aantal hechtende cellen te kwantificeren na seriële wasbeurten.

Abstract

T lymfocyt adhesie vereist voor meerdere T-celfuncties, waaronder migratie naar plaatsen van ontsteking en vorming van immunologische synapsen met antigen presenterende cellen. T-cellen bereiken gereguleerde hechting door het regelen van de hechting van integrinen, een klasse van celadhesie moleculen die bestaan ​​uit paren van heterodimere transmembraan eiwitten die interageren met doelmoleculen op partner cellen of extracellulaire matrix. De meest prominente T-cel integrine is lymfocytfunctie geassocieerd antigeen (LFA) -1, bestaande uit subeenheden aL en β2, waarvan het doel is de intracellulaire adhesie molecuul (ICAM) -1. Het vermogen van een T-cel adhesie controle afgeleid van de mogelijkheid om de affiniteit status van afzonderlijke integrines regelen. Inside-out signalering beschrijft het proces waarbij signalen binnen een cel ertoe leiden dat de externe domeinen van integrines aan een geactiveerde toestand aannemen. Veel van onze kennis van deze complexe fenomenen is gebaseerd op mechanistischestudies uitgevoerd in vereenvoudigde in vitro modelsystemen. T lymfocyten adhesieanalyse hier beschreven is een uitstekende tool waarmee T-cellen zich te houden aan doelwitmoleculen, onder statische omstandigheden, en vervolgens maakt gebruik van een fluorescerende plaat lezer om hechting te kwantificeren. Deze test is nuttig geweest bij het bepalen adhesie-stimulerende of remmende stoffen die op lymfocyten, en karakterisering van de signalerende gebeurtenissen betrokken. Hoewel de hier beschreven LFA-1 - ICAM-1 gemedieerde adhesie; Deze bepaling kan gemakkelijk worden aangepast om voor de studie van andere bindingsinteracties (bijvoorbeeld VLA-4 - fibronectine).

Introduction

T lymfocyt adhesie is een fundamenteel proces in de immuunrespons ^1. Het is noodzakelijk voor T-cel interactie met endotheelcellen versieren de capillaire wanden, scannen antigeen presenterende cellen (APC) in lymfklieren, en voor de vorming van immunologische synapsen (IS) met doelcellen ^2. Deze eisen zijn functioneel en kinetisch onderscheiden. Het proces van lymfocyten extravasatie bestaat uit chemoattractie, rollende, stevige adhesie en transmigratie. De overgang van rollen om de hechting stevig vereist T-cellen om snel te reageren op een G-eiwit gekoppelde receptor signaal. Deze reactie levert een integrine ligand interactie die vertraagt ​​en arrestaties de glooiende cel ^3. Een onmiddellijke wijziging van integrine aviditeit bemiddelt dit proces. Migratie vereist dynamische interacties betweenTcells en endotheelcellen met de vorming van verklevingen bij de 'voorkant' en breuk van verklevingen aan de 'achterkant'met een interval van een minuut tussen vormen en breken ^4. De IS vormt inminutes, maar moet intact blijven voor uren ^6.

Interessant, een adhesiemolecuul, het integrine familielid lymfocytfunctie geassocieerd antigeen (LFA) - 1, is essentieel voor al deze processen ^5. LFA-1 bemiddelt adhesie door interactie met diverse leden van de immunoglobuline superfamilie. De meest uitgebreid bestudeerde ligand met de hoogste affiniteit voor LFA-1 is de intercellulaire adhesiemolecuul (ICAM) -1. Niet-geactiveerde circulerende lymfocyten lage affiniteit LFA-1 aan het celoppervlak, en daarom niet houden aan ICAM-1-gecoate oppervlakken. LFA-1 affiniteit is variabel en wordt gereguleerd door verschillende signalering evenementen zoals G-eiwit gekoppelde receptor activering, cytokinestimulatie en signalen gemedieerd door T-cel-receptoren (TCR). De resulterende hoge affiniteit vorm van LFA-1 brengt intracellulaire activering naar de extracellulaire ruimte through interactie met ICAM-1. Deze route wordt genoemd inside-out signalering ^7. Ook signaleren door LFA-1 uit de extracellulaire ruimte wordt outside-in signalering genoemd.

De intracellulaire signalering cascades betrokken bij inside-out en outside-in signalering zijn een belangrijke focus van het huidige onderzoek. De kleine GTPase Rap1 is onlangs naar voren gekomen als de belangrijkste component van inside-out te geven dat gemeenschappelijk is voor zowel TCR ligatie en cytokine signalering ^8. De cruciale rol van Rap1 in integrine activering wordt benadrukt door de ontdekking dat overexpressie van Rap1 stimuleert integrine-afhankelijke adhesie van T-cellen, terwijl T-cel adhesie wordt geblokkeerd door expressie van dominant negatieve Rap1 ^9. Deze vooruitgang in ons begrip van integrine regulering door Rap1 zijn bereikt middels in vitro gereedschap. Onder hen is de statische adhesietest beschreven.

Het algemene doel van deze methode is om T studerencel hechting aan ICAM-1 gecoate oppervlakken. Meer in het bijzonder, wordt het gebruikt om objectief te meten en te kwantificeren LFA-1 affiniteit naar zijn teller liganden in levende cellen in real-time, onder verschillende omstandigheden. Deze techniek maakt gebruik van polystyreen wells gecoat met ICAM-1 de cellulaire oppervlakken die de T-cellen interageren met nabootsen. Veel eerder beschreven statische T cel adhesie assays experimenteel complex. Deze vaak nodig voor T-cellen assays radioactief worden gelabeld, gebruikt gekweekte runder corneale cellen een extracellulaire matrix te maken als substraat voor T celadhesie of opgevraagd voor niet-fysiologische T-cel stimulatie over een langere periode T-cel adhesie ¹⁰ bevorderen. Het gebruik van fluorometrische meting om T-cellen te kwantificeren na de hechting incubatie is een meer gevoelige en nauwkeurige werkwijze voor kwantificering opzichte cytometrie microscopie en stroom, zoals worden gebruikt in vele andere testsystemen ^11. Daarnaast enkele cel microscoopic analyse van integrine lokalisatie niet mogelijk voor de brede populatie gebaseerde analyse op dezelfde manier als de fluorometrische meting. Terwijl activeringstoestand specifieke LFA-1-antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar, deze antilichamen bieden lage gevoeligheid ten opzichte van de hier beschreven methode. Het voordeel boven alternatieve techniek is zijn eenvoud en de mogelijkheid om meerdere proefomstandigheden parallel onderzoek. Bij het overwegen van deze methode voor een specifieke toepassing, moet men rekening houden dat T-cellen negatief worden gekozen, vers geïsoleerd en gelabeld met een fluorescente merker.

Protocol

1. Coating de Microplaat Wells

Opmerking: Het doel van deze stap is het bekleden van polystyreen oppervlakken ICAM-1 om te dienen als liganden voor T-cel LFA-1.

1. Bereid de volgende oplossingen:
   1. Bereid de bekledingsoplossing door resuspenderen recombinant ICAM-1 met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH _{2PO 4,} pH 7,4) verrijkt met calcium (1 mM _CaCl2) en magnesium (2 nM _MgCl2). Zorg ervoor dat de eindconcentratie van ICAM-1 is 10 ug / ml, gemaakt van een 0,7 mg / ml voorraadoplossing en in een -80 ° C vriezer bewaard.
   2. Bereid de hechting oplossing verrijken PBS met 0,5% humaan (of runder) serum albumine (HSA / BSA), 2 mM _{MgCl2 en} 1 mM _CaCl2.
   3. Bereid de wasoplossing door toevoeging van 2 mM _MgCl2 en 1 mM _CaCl2 PBS. Warm alle oplossingen tot 37° C voor gebruik.
2. Was 24 putten met 50 ul van wasoplossing. Dit omvat ongewassen putten, positief (PMA behandelde cellen) en negatieve (ongecoate wells) controles. Voor elke voorwaarde stellen ten minste drie putten (drievoud).
3. Voeg 50 ul van bekledingsoplossing aan elk putje. Dragen niet bij aan de ongecoate controles. Incubeer gedurende een uur in 37 ° C incubator.
4. Zuig het bekledingsoplossing voorzichtig, zonder dat de top naar de bodem van de putjes raken. Was eenmaal met 50 ul van wasoplossing.
5. Voeg 50 ul van adhesie oplossing en incubeer de microplaat gedurende een uur in 37 ° C incubator.
6. Zuig zachtjes en een keer wassen met 50 pi wasoplossing. Gebruik de plaat op dezelfde dag, maar het is mogelijk om het bij 4 ° C gedurende de nacht bewaren en gebruiken de volgende dag.

2. T Cell Isolatie van Blood

1. Voeg de humane T cel verrijkingscocktail van 50 ul / ml of volbloed (bijv. voor 3 ml van antistollingsmiddel (heparine, EDTA of citraat) volbloed, voeg 150 ul van cocktail). Meng goed.
2. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
3. Aan een 50 ml centrifugebuis 3 ml behandeld bloed en een gelijk volume PBS (zonder calcium en magnesium) verrijkt met 1% D-glucose bij kamertemperatuur. Meng voorzichtig met een Pasteur pipet.
4. Voeg 15 ml Ficoll-Paque PLUS de centrifugebuis.
5. Layer zorgvuldig de 6 ml verdunde bloedmonster op de lymfocyten isolatie medium.
6. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 20 min bij 20 ° C met afbreken.
7. Tap de bovenlaag met een schone Pasteur pipet, waardoor de lymfocyt laag ongestoord aan het grensvlak. De bovenste laag van plasma kan worden opgeslagen voor later gebruik. Met een schone Pasteur pipet breng de lymfocyt laag op een schone centrifugebuis.
8. Voeg 3 delen (9 ml) PBS aan de lymfocyten. Hang de cellen door voorzichtig drawing ze in en uit van een Pasteur pipet.
9. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
10. Verwijder het supernatant. De lymfocyten moet nu in het medium past bij de aanvraag worden opgeschort. Breng de cellen om een ​​T-75 kolf in 20 ml RPMI 1640 medium met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine.

3. Bereiding van Cellen

Opmerking: Een voorwaarde is voor de cellen met een fluorescerend reagens te labelen. In dit protocol carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE), maar groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengende cellen een acceptabel alternatief.

1. Graaf 2.4 x 10 ⁶ T-cellen (1 x 10 ⁵ voor elk putje) met een hemocytometer.
2. Resuspendeer de cellen in kweekmedium zonder serum (serum honger). Incubeer de cellen gedurende 2 uur in 37 ° C incubator.
3. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten (400 xg). Zuig de media enresuspendeer in 1 ml PBS.
4. Voeg CFSE bij 1:1000 verdunning (voorraad gemaakt tot 5 mm). Bedek tegen licht en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
5. Stop de reactie door toevoeging van 10 ml 37 ° C PBS en spin bij 400 xg gedurende 5 minuten.
6. Resuspendeer celpellet met 1,2 ml voorverwarmde adhesie oplossing (1 x 10 ⁵ cellen per 50 pi).

4. Stimulatie van de Cellen

Opmerking: Om de hechting te starten, moeten de cellen worden gestimuleerd. In het volgende experiment worden de cellen gestimuleerd via de TCR met anti-CD3 verknopende antilichamen echter oplosbaar SDF-1 kan dienen als een alternatief. Afhankelijk van het doel van de experimenten konden verschillende farmacologische reagentia worden toegevoegd voor of tijdens stimulatie van de impact op cellulaire adhesie bestuderen. Forbolmyristaatacetaat (PMA) is een forbolester die structureel gelijk aan de tweede messenger diacylglycerol (DAG) en derhalve activeert meerdere kinases downstream de TCR (voornamelijk Proteïne kinase C); hier wordt gebruikt als een positieve controle.

1. Verwarm de microplaat tot 37 ° C.
2. Verdeel de cellen in 8 lege 1,5 ml buizen (150 pl in elke buis), een buis voor elke conditie.
3. Behandel de cellen dienovereenkomstig:
   1. Stimuleer een buis met PMA bij 10 ng / ml als positieve controle te dienen. Houd drie buisjes onbehandeld, om te dienen als controle voor stimulatie ("geen stimulatie"), ongewassen beladingscontrole ('no wash'), en controle voor ICAM-1 coating ("ongecoate").
   2. Stimuleer vier buizen met verschillende concentraties anti-CD3 antilichamen (0,1, 1, 5, en 10 ug / ml). Ga door naar de volgende stap zonder vertragingen.
4. Aliquot 50 pi gestimuleerde cel mix in elke lege put. Het uiteindelijke aantal cellen per putje is 1 x 10 ^5.
5. Plaats de microplaat in de 37 ° C incubator gedurende 15 minuten.
   Opmerking: Sommige T-cellijnen vereisen kortere stimulatie tie tijd. Gedurende deze tijd zullen de cellen omlaag naar de bodem van de putjes en zich aan het doelwit liganden.

5. Wegwassen van niet-hechtende cellen

Opmerking: Het doel van deze stap is om cellen die niet kunnen strak contact met de ligand-gecoate oppervlakken vormen waren verwijderd. Gebruik een multichannel pipet voor deze stap om ervoor te zorgen dat dezelfde fysische krachten worden toegepast op alle putjes. Het is belangrijk om de aangegeven controleputjes ongewassen te helpen bij de berekening van het percentage hechtende cellen houden.

1. Voeg 150 ul van warme adhesie oplossing in elk putjes. Schud de plaat zachtjes gedurende enkele seconden voordat u het medium uit de putjes. Raak de onderkant van de putten niet aan met de tips.
2. Herhaal deze stap drie keer. Verander de richting van de pipet bij het pipetteren de buffer in en uit.

6. Bepalen van het percentage van hechtende cellen

_content "> Opmerking: In deze stap een fluorescente plaatlezer wordt gebruikt om de fluorescentie-intensiteit in elk putje gemeten De intensiteit houdt direct verband met het aantal hechtende cellen..

1. Zet de plaat lezer. Open de plaat lezer software door te klikken op de snelkoppeling op het bureaublad.
   1. In het menu "Taak" klik "Nieuw" om een ​​nieuw protocol.
   2. In het menu "Acties" de optie "Lezen" optie. Klik op "fluorescentie-intensiteit" en druk op de knop "OK".
   3. Uit het drop down menu "Excitatiegolflengte 485" en "Emission golflengte 528". Druk op de "Ok" tabblad.
   4. In "Optic" optie menu "Bottom" en druk op de "Ok" tabblad. Ga terug naar het menu "Acties" en stel de temperatuur tot 37 ° C en klik op "Ok".
   5. Steek de microplaat in de plaat lezer enklik op "Run". Het resultaat zal worden geëxporteerd naar Excel-spreadsheet.
2. Bereken het percentage hechtende cellen volgens de formule: percentage hechtende cellen = (gemiddelde fluorescentie-intensiteit gelezen in de gewassen putjes) / (gemiddelde fluorescentie-intensiteit gelezen in ongewassen cellen) x 100%.

Results

Hieronder is een voorbeeld van adhesietest gebruik van primaire T-cellen gestimuleerd met verschillende concentraties anti-CD3 antilichamen. Het is nuttig om de fluorescentie van ongewassen cellen (dwz totale belading) kennen. Niet-gestimuleerde cellen dienen als een negatieve controle en PMA behandelde cellen zijn de positieve controle voor anti-CD3 antilichamen. Cellen uitgeplaat in putjes onbeklede dienen als controle voor ICAM-1. In een typisch experiment het percentage hechtende PMA behandelde cellen tusse...

Discussion

Er zijn verschillende assays om signalen te bestuderen LFA-1 activatie en T celadhesie ^12. Flowcytometrie wordt gebruikt voor LFA-1 affiniteit staten meten levende cellen met monoklonale antilichamen die selectief binden aan hetzij gebogen of uitgebreide LFA-1. Een van de beperkingen van deze methode is dat het geen rekening met de aviditeit integrinen. Migratie assays zijn nuttige hulpmiddelen, maar ze meten migratie, en niet miezerig hechting op een specifiek tijdstip. Muismodellen voor T-lymfocyten migrati...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plate reader	BioTek	Synergy H1 Hybrid
Multichannel pipette	Fisher	21-377-829
96-well microplate met optische bodem	Corning Costar	3603
Recombinant ICAM-1	R&D Systems	ADP4-050
Anti-CD3 antilichamen	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Molecular Probes	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS met calcium en magnesium	Gibco	14190250
Perifere lymfocyten	bijv. muis of mens
Magnesiumchloride	Sigma-Aldrich	M8266
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 software	BioTek	Versie 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
15 en 50 ml centrifugebuizen	Fisher	352099, 352070
Weggeef plastic Pasteur pipetten	Fisher	13-711-7M
T-75 kweekkolven	Fisher	50-754-1366
RosetteSep T-cel verrijkingskit	StemCell Technologies	15061