De toepassing van matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF) massaspectrometrie (MS) rechtstreeks bloed kweekbouillon versnelt de identificatie van bacteriën. De onderhavige methode is een snelle en betrouwbare methode voor de identificatie van Gram-negatieve bacteriën direct uit bloed kweekbouillon.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een belangrijke rol van de klinische microbiologie laboratorium is om een snelle identificatie van bacteriën die bloedbaan infectie. Traditionele identificatie vereist de sub-cultuur van gesignaleerd bloedkweek bouillon met identificatie alleen beschikbaar nadat kolonies op vaste agar hebben gerijpt. MALDI-TOF MS is een betrouwbare, snelle werkwijze voor identificatie van de meeste klinisch relevante bacteriën wanneer toegepast op kolonies op vaste media. De toepassing van MALDI-TOF MS direct naar bloedkweek bouillon is een aantrekkelijke aanpak, omdat het heeft potentieel om species identificatie van bacteriën versnellen en verbeteren van klinische behandeling. Echter, een belangrijk probleem te overwinnen is de pre-analyse verwijdering van storende harsen, eiwitten en hemoglobine in bloedkweek specimens die, indien niet verwijderd, interfereren met de MS-spectra en kan leiden tot onvoldoende of lage discriminatie identificatie scores. Bovendien moet bacter concentrerenia te ontwikkelen spectra van voldoende kwaliteit. De gepresenteerde methode beschrijft de concentratie, zuivering en extractie van Gram-negatieve bacteriën waardoor de vroegtijdige identificatie van bacteriën uit een gesignaleerd bloedkweek bouillon.
Inleiding
Patiënten met een infectie in de bloedbaan (BSI) als gevolg van bacteriën blijven hoog sterftecijfer in het ziekenhuis hebben, variërend 6-48% 1. De levering van geschikte empirische antibiotica bevordert de overleving en de subgroep van patiënten met ernstige sepsis, elk uur vertraging passende therapie correleert met verminderde overleving 2,3. Dienovereenkomstig is een belangrijke doelstelling van het klinisch laboratorium is om snel te detecteren, identificeren en communiceren van de aanwezigheid van bacteriën in het bloed culturen om klinische beslissingen. Het is aangetoond dat de microbiologie laboratorium heeft de grootste invloed op antimicrobiële therapie bij de rapportage van de Gramkleuring 4 en recent een waarnemingsstudie aangetoond dat matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) direct uitgevoerd op bloed kweeksuspensies beïnvloeden voorschrijven in meer dan een derde van de BSI veroorzaakt door Gram-negatieve bacteriën 5.
De commerciële ontwikkeling van MALDI-TOF MS heeft geleid tot een effectieve laboratorium hulpmiddel voor de identificatie van micro-organismen 6,7. De technologie is nu goed ingeburgerd en is geïntegreerd in veel laboratoria voor snelle en accurate identificatie van micro-organismen die op vaste media 6,8. De directe toepassing van MALDI-TOF MS bloed cultuur (BC) bouillon die voor micro-organismen beroep op zowel clinici en laboratorium managers vanwege de potentie om een snellere identificatie van micro-organismen tegen een lage prijs te krijgen "positief" zijn gesignaleerd.
De klinische bruikbaarheid van directe toepassing van MALDI-TOF MS om bloed cultuurbouillon is beperkt door de brede waaier van gevoeligheden waargenomen in vergelijking met standaard fenotypische cultuur gebaseerde methoden van identificatie, met meldingen van succesvolle identificatie van Gram-negatieve bacteriën, variërend 47-98,9 % 9-11. De variatie in gevoeligheid waarschijnlijkebetreft de BC bouillon samenstelling, aanvankelijk bacteriële concentratie variatie monstervoorbereiding en de talloze gramnegatieve organismen aangetroffen in onderzoekspopulatie 9. Vergeleken met deze andere gepubliceerde protocollen de hier gepresenteerde werkwijze vermijdt het gebruik van ethanol, ammoniumchloride of extra (niet-matrix) acetonitril. Als gevolg van de bacteriële pellet levensvatbaar blijft (tot het tijdstip eiwitextractie) waardoor potentiële fenotypische gevoeligheid testmethoden rechtstreeks worden toegepast op deze organismen in bouillon. Daarnaast heeft de gepresenteerde methode getoond goedkoop, betrouwbaar en snel met bacteriële identificatiemiddelen bestaan binnen 25 minuten van de bloedkweek Gramkleuring resultaten met minimale praktijkervaring op tijd 12 zijn.
Deze werkwijze is een eenvoudige eigen rotatie-lysis protocol gebruik mierenzuur extractie direct op positieve bloedkweek bouillon door Gram negatieve b identificerenBacteriën met MALDI-TOF MS technologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bloed kweeksuspensies Markeren als "Positief"
- Verwijder de gesignaleerd bloedkweekfles van de continue monitoring incubatie kast en plaats deze in een biologisch veiligheidskabinet. Opmerking: De flessen kunnen gevaarlijke micro-organismen bevatten en universele voorzorgsmaatregelen moeten worden gevolgd. Vanwege het risico van infectieuze aërosolen in monsters, moeten alle monsters procedures worden uitgevoerd in een Biosafety klasse II laminair flowkast.
2. Gram Stain is voorbereid
- Maak een Gramkleuring van de gesignaleerd bloed cultuurbouillon volgens lokale institutionele protocollen. Opmerking: Bij Gram negatieve organismen zijn vermeld microscopie bloed kweekmedium wordt verwerkt volgens de volgende werkwijze. Bij Gram-positieve organismen worden geïdentificeerd, wordt een alternatieve moleculaire methode gericht genetische identificatie en resistentiemerkers toegepast op de bouillon (niet in dit artikel behandeld) 13.
- Meng de bloedkweekfles door het omkeren van 2-3x.
- Binnen de bioveiligheid kast bevestig een injectiespuit 10 ml van een veiligheidsprobleem bloedtransfusie apparaat.
- Bevestig de bloedtransfusie apparaat om de bloedkweekfles en 5 ml van de bouillon te trekken in de spuit. Breng de aangezogen BC bouillon in een serum scheiden buis.
4. Concentratie van Blood Culture Bouillon
- Centrifugeer het serum scheiden buis bij 1250 xg gedurende 15 min met een groot volume rode bloedcellen verwijderd.
- Zuig de bovenstaande vloeistof met behulp van een steriele transferpipet voorzichtig om ongeveer 1 ml van de buffycoat direct boven de gel / vloeistof-interface te verlaten. Opmerking: De aërobe flessen een duidelijke scheiding van rode bloedcellen op de bodem van de buis met de gel / vloeistof-interface verschijnt een ondoorschijnende witte kleur. Wanneer daarentegentoegepast op de lytische anaerobe bloed cultuurbouillon de gel / vloeistof-interface verschijnt als een diepe rode kleur te wijten aan de gelyseerde rode bloedcellen componenten blijven gesuspendeerd in het supernatant.
5. Herhaal Centrifugeren wasstappen
- Meng de laatste 1 ml buffy coat vloeistof boven de gel interface met een steriele pipet en vervolgens over het gehele volume in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer de nieuwe buis bij 288 g gedurende 30 sec.
- Breng de supernatant met een wegwerpbare plastic 1 ml pipet in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en gooi de buis met de pellet. Opmerking: Het is van cruciaal belang in deze stap die zorg wordt genomen om de overdracht van de pellets voorkomen. Dit is bijzonder belangrijk voor een preparaat uit de anaërobe BC fles verwerkt de supernatant blijft gepigmenteerd en de pellet wordt niet altijd duidelijk zichtbaar.
6. Lysis van een blijvend Cellen
- Centrifugeer het monster bij 18.407 xg gedurende 1 minuut en vervolgens aspireren (en teruggooi) de bovenstaande vloeistof met een fijne tip transferpipet om zo weinig resterende vloeistof mogelijk te verlaten zonder verstoring van de pellet.
- Resuspendeer de residuele pellet in 1 ml steriel DNAse en RNAse vrij water op en neer te pipetteren. Opmerking: Sommige auteurs hebben het gebruik van alcohol oplossingen in plaats van steriel water om de pellet welke bacteriën niet-levensvatbaar maakt resuspenderen beschreven.
- Centrifugeer de oplossing geresuspendeerd 18.407 xg gedurende 1 minuut.
7. Extractie van bacteriële eiwitten
- Zuig en gooi het supernatant, wederom met behulp van aspiratie met een fijne tip pipet ervoor te zorgen dat zoveel vloeistof als mogelijk wordt verwijderd.
- Resuspendeer de pellet in 10 pl mierenzuur (70% v / v). Opmerking: Mierenzuur kan het lichaam beïnvloeden als deze wordt ingeademd of wanneer het in contact komt met de huid. Bij de voorbereiding of het manipuleren van oplossingen is het rANBEVOLEN dat medewerkers gebruik maken van een zuurkast in aanvulling op de persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Meng goed met behulp van de pipet om een homogene geresuspendeerd oplossing zorgen. De pipetpunt fysiek verstoren de pellet kan nodig zijn om een homogene oplossing te garanderen.
8. Bereiding van MALDI-TOF richtmerk
- Inoculeren een schone MALDI-TOF doel plaat met 2 pi van de bereide suspensie per doel plek. Bereid 3 doelwitplaatsen voor elk monster de occasionele probleem van de mislukte leest overwinnen.
- Laat de MALDI-TOF richtplaat te drogen. De droogsnelheid kan worden verhoogd door het plaatsen van de plaat op de rand van de zuurkast luchtstroom over de plaat te maximaliseren.
- Overlay elk gedroogde vlek met 1 pl van de matrix-oplossing (10 mg / ml α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (HCCA), 50% acetonitril, 2,5% trifluorazijnzuur). Opmerking: Matrix oplossing kan het lichaam beïnvloeden als het wordt ingeademd of als het komt in contact met de huid. Bij de voorbereiding of het manipuleren van oplossingen is het aanbevolen dat het personeel gebruik een zuurkast in aanvulling op de persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Laat de MALDI-TOF richtplaat drogen aan de rand van de zuurkast zoals hierboven beschreven. Zorgen homogene bereiding elk doel vlekken op de plaat vult.
9. Place MALDI-TOF Richtmerk in de massaspectrometer
- Steek de MALDI-TOF doel plaat in de MALDI-TOF massaspectrometer. Zorg ervoor dat de plaat zit gelijk met de verende platen. Let op: niet in te voegen het doel plaat totdat alle doelgroepen plekken zijn droog.
- Zorg ervoor dat de rubberen afdichting schoon is van pluizen, stof en haren om de vereiste vacuüm kan worden gecreëerd.
- Sluit de MALDI-TOF stadium deksel en druk op de "in / out"-knop op de voorkant van het instrument. Het deksel zal nu vergrendeld en kan de vereiste vacuüm te creëren.
10. MALDI-TOF MS Spectra Acquisitie
- Open de MALDI Biotyping en FlexControl software.
- Binnen de typen software selecteren "nieuwe classificatie" uit het dropdown menu met de titel "file". Noem het project en selecteer "nieuw". Selecteer "Next" om de installatie binnen de typen software te voltooien.
- Binnen de besturingssoftware venster identificeren van de afbeelding van het doel plaat op het scherm. Markeer de MALDI-TOF doelwit plekken die in gebruik zijn door het bewegen van de muis over het geënte plekken terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt.
- Gebruik de rechter muisknop ergens op het geselecteerde doel posities en selecteer vervolgens "analyten toevoegen" uit het dropdown menu.
- Voeg bloedkweek identificatiegegevens aan de "ID" kolom voor elk van de beoogde plekken in en klik op "volgende" als u klaar bent.
- Selecteer de commerciële "taxonomie" spectra databank en selecteer "volgende". Opmerking: Laboria kan gebruik maken van bijkomende vaste of commerciële databases om het aantal referentie-spectra te verhogen.
- Klik op "finish" en de MALDI-TOF MS zal beginnen genereren spectra. Opmerking: MALDI-TOF instellingen waren als per instelling fabricage's (lineaire positieve modus, 60 Hz laser frequentie, 20 kV versnelling spanning, 16,7 kV IS2 voltage, 170 ns extractie vertraging, en 2,000-20,137 m / z bereik).
- Als de MALDI control software niet pieken genereren, kan handmatige overname van spectra worden uitgevoerd (methode niet beschreven).
11. Bericht Analyse Interpretatie van MALDI-TOF MS Scores
- Zodra de spectra worden verworven en analyse is voltooid, selecteert u de knop "+" naast de identificatie van soorten op de Typen software om de identificatie lijst voor elke doelgroep uit te breiden.
- Bestudeer de top 5 identificaties, wijzend als de top 5 zijn vergelijkbaar. Strijdige top 5 geslachten met scores ≥ 1.7 van dezelfde doelgroepspot gewezen op de mogelijkheid van gemengde bouillon. Opmerking: MALDI-TOF-technologie heeft een slechte sensitiviteit voor de detectie van gemengde bouillon. Wanneer bijvoorbeeld een bouillon bevat gemengde species een hoge betrouwbaarheidscore worden geïdentificeerd voor slechts een van de gemengde species.
- Bij een score ≥ 2,0 wordt genoteerd voor de hoogste wedstrijd op een doel plek, melden de soort.
- Wanneer de hoogste score op een doel spot is ≥ 1,7, doch <2,0, melden alleen de geslachten. Als aanvullende criteria van de top 5 identificaties zijn concordant, vervolgens verslag uit bij soortniveau.
12. Verwijdering van MALDI-TOF Richtmerk
- Wanneer alle spectra zijn, drukt het "in / out"-knop op de MALDI-TOF machine.
- Open de MALDI-TOF doel plaat houder en verwijder de MALDI-TOF richtmerk.
- Bij gebruik van een herbruikbare MALDI-TOF richtmerk, schoon alle doelgroepen plekken gebruik van alcohol en opslaan van de MALDI-TOF plaat bij RT als het eenmaal schoon en droog is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gegenereerde MALDI-TOF MS spectra vergeleken met de geïntegreerde referentiedatabank spectra. Een logaritmische score wordt toegekend voor het vertrouwen van de wedstrijd tussen de test isolaat en de referentiedatabank isolaten, met de aanbeveling van een score ≥ 1.7 vereist voor waarschijnlijke identificatie geslachten niveau (figuur 1) en ≥ 2,0 voor waarschijnlijke identificatie van soorten (Figuur 2). Rapporteer aan soorten in als de score ≥ 1.7 en de eerste 5 identificaties geëve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is van belang bij de toepassing van MALDI-TOF MS om bloed cultuurbouillon dat de post centrifugeren stappen worden uitgevoerd met voldoende zorg niet aan de gescheiden componenten te remixen. Het is bijzonder belangrijk om de bestanddelen bloedkweek en menselijke cellulaire eiwitten, zoals hemoglobine, die spikes interfereren met de MALDI-TOF spectra kunnen veroorzaken te verwijderen.
Hoewel MS produceert raden afgesneden score van ≥ 2,0 voor soorten en ≥ 1,7 voor genus identificatie, he...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 ml) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
Referenties
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel,, et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
