Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

13.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51666

⸱

24 juni 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor live celbeeldvorming met behulp van primaire neonatale rattencardiomyocyten na lentivirale en adenovirale transductie met behulp van confocale spinning disk microscopie. Dit maakt gedetailleerde observaties van cellulaire processen in levende cardiomyocyten mogelijk.

Samenvatting

Primaire rat neonatale cardiomyocyten zijn nuttig in de basis in vitro cardiovasculair onderzoek, omdat zij gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd in grote aantallen in een enkele procedure. Door de vooruitgang in microscoop technologie is het relatief eenvoudig om levende cellen beelden vast te leggen voor de onderzoeken cellulaire gebeurtenissen in realtime met minimale zorgen over fototoxiciteit aan de cellen. Dit protocol beschrijft hoe levende cellen timelapse beelden van primaire rat neonatale cardiomyocyten te nemen met behulp van een confocale draaiende schijf microscoop volgende lentivirale en adenovirale transductie om eigenschappen van de cel moduleren. De toepassing van twee verschillende soorten virussen vergemakkelijkt een passend transductie snelheid en expressieniveaus voor twee verschillende genen bereiken. Nou gericht levende cellen beelden kunnen worden verkregen met behulp van de microscoop autofocus systeem, dat stabiel aandacht onderhoudt gedurende lange perioden. De toepassing van deze methode, de functies van exogeen ingenieured eiwitten tot expressie in gekweekte primaire cellen kunnen worden geanalyseerd. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt om de functie van genen te onderzoeken door het gebruik van siRNA en chemische modulatoren.

Inleiding

Primaire cardiomyocyten van neonatale ratten zijn lang gebruikt voor het onderzoeken cardiomyocyt-functie in vitro 1. Ze zijn gemakkelijk te isoleren van jonge ratten door verschillende gevestigde methoden 2-4. De meest voorkomende methode maakt gebruik van collagenase of trypsine om bindweefsel van het hart voorafgaand aan celisolatie verteren. Onderzoekers hebben ook werkwijzen voor het isoleren cardiomyocyten van volwassen knaagdieren 5-8 en neonatale muizen 9,10.

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van hartspiercellen van pasgeboren pups rat, waarbij een twee-staps enzymdigestie procedure. Trypsine wordt eerst gebruikt O / N bij 4 ° C en daarna gezuiverd collagenase bij 37 ° C. Incubatie van het hartweefsel met trypsine O / N bij 4 ° C vermindert de nodige oogst cellen vergeleken met methoden waarbij opeenvolgende incubaties in een warme enzymoplossing 2. Bovendien, met gezuiverde collagenase plaats ruwe enzymen, kan veel te veel variabiliteit worden geëlimineerd, waardoor verbeterde reproduceerbaarheid.

Functionele studies van een bepaald eiwit gebruiken vaak een eiwitexpressie systeem met een adenovirus 11-13 en / of 14-16 lentivirus. [VOORZICHTIGHEID] De virale productie en manipulatie moet worden uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen.

Het adenovirus niet integreren in het gastheergenoom. Het heeft een zeer hoge efficiëntie van transductie in de meeste celtypen, waaronder delende cellen en niet-delende cellen, en primaire cellen en gevestigde cellijnen. Dit maakt het adenovirus een betrouwbare vector voor genexpressie. Hoge niveaus van de proteïne gecodeerd door het adenovirus vector ontwikkelen binnen 48 uur na transductie, en ze kunnen enkele weken 17. Echter, een nadeel van een adenovirus voor eiwitexpressie is dat de ontwikkeling van een recombinant adenovirus is zowel gecompliceerd en tijdrovend. Dit nadeel verklaart ten dele waarom veel onderzoekers zijn zich tot lentiviruses voor recombinante genexpressie. In tegenstelling tot adenovirale constructen, het genereren van een lentivirale construct is snel en eenvoudig. Hoewel lentivirussen zijn algemeen lagere efficiëntie van transductie dan adenovirussen, zowel delende als niet-delende cellen, ze integreren in het gastheergenoom. Bijgevolg expressie van het getransduceerde gen stabieler lentivirussen dan adenovirussen.

Door de technologische ontwikkelingen op het gebied van microscopie, is het veel gemakkelijker om levende cellen beelden van cellen die recombinante eiwitten vangen. Dit geldt ook bij video rate snelheden van de overname. Hierdoor kan de onderzoeker bepalen hoe bepaalde veranderingen in het eiwit van belang functioneel beïnvloeden de cel in real time. De confocale draaiende schijf microscoop heeft een aantal belangrijke functies die het een optimale techniek voor liv makene cell imaging 18,19. De Yokogawa draaiende schijf zorgt voor veel sneller beeldacquisitie, terwijl tegelijkertijd gebruik veel minder laservermogen dan point confocale microscopen. Beide speciale functies worden door de draaiende schijf, die tal confocale gaten waardoor de laser passeert gelijktijdig de monsters bevat. Tijdens acquisitie, de schijf zelf draait snel en continu 18-20. Door het autofocussysteem van de microscoop, als stabiel nadruk gehandhaafd gedurende lange tijd. Dit stelt onderzoekers in staat om goed gerichte live cell beelden nemen. Verkregen beelden worden afgespeeld als een filmbestand. De beelden worden geanalyseerd met behulp van beeldanalyse-software zoals ImageJ 21,22, FIJI 23, of andere in de handel verkrijgbare software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Isolatie van rat neonatale cardiomyocyten

  1. Gebruik Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met foetaal runderserum (FBS) en penicilline / streptomycine (P / S) als het kweekmedium. Broomdeoxyuridine (BrdU) toe te voegen aan het medium om de groei van fibroblasten te voorkomen voor de eerste 2 dagen na de isolatie.
Base medium FBS BrdU (mM) P / S (U / ml)
selectie DMEM 10% 0 20
De eerste dag DMEM 10% 0.1 10
De volgende dag DMEM / MEM 5% 0.1 10
Verdere cultuur DMEM / MEM 5% 0 10

Tabel 1:. Medium voor rat neonatale cardiomyocyten Gebruik deze media voor het kweken van rat neonatale cardiomyocyten. DMEM / MEM 1:1 mengsel van DMEM en MEM medium.

  1. Cardiomyocyte isolatie, Dag 1 (Geschatte benodigde tijd, ongeveer 1 uur)
    OPMERKING: Voor het werken met neonatale knaagdieren, verwijzen naar de lokale richtlijnen en regels universiteit door dierlijke zorgprogramma's in te stellen en zich te houden aan institutioneel goedgekeurd dier protocollen. Alle methoden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Yale Animal Resource Center.
    1. Bereid reagentia en hulpmiddelen: calcium-en magnesium-vrije Hank's gebalanceerde zoutoplossing (CMF HBSS), 30 ml x 2, 10 ml x 2, op ijs; 1 mg trypsine, gereconstitueerd met 2 ml CMF HBSS, op ijs; geautoclaveerd instrumenten; 70% ethanol (EtOH) in 250 ml bekerglas; vier gesteriliseerde 10 cm plastic schaaltjes, drie voor de isolatie van hart en een voor trypsine.
    2. Bestel 1 litter van 1-op-2-dagen oude ratten pups (ongeveer 10 pups) met hun dam van een proefdier distributeur.
    3. Dag1, Transfer pups te kleine kooi en euthanaseren dam met een ketamine / xylazine cocktail (Ketamine, 200ml/10g en xylazine 20ml/10g) overdosis.
    4. Neem een ​​pup en steriliseren zijn hele lichaam met 70% EtOH. Onthoofden pup met goed onderhouden scherpe chirurgische schaar op een gesteriliseerde 10 cm plastic schaaltje op een locatie geïsoleerd van andere pups.
      Opmerking: Om de monsters zo snel mogelijk te verzamelen, is het best om de meest snelle en efficiënte methode voor het beëindigen van het leven van de knaagdieren. Onthoofding bij juist gebruik door ervaren professionals met goed onderhouden apparatuur kan leiden tot minder angst en angst voor het dier en zijn sneller en praktischer dan andere vormen van euthanasie. Het is in overeenstemming met de aanbevelingen van de American Veterinary Association Richtlijnen Medische voor de euthanasie van dieren.
    5. Verwijder het verslaan hijkunst met gesteriliseerde instrumenten, en zet hart in 30 ml ijs gekoeld CMF HBSS in 50 ml conische buis. OPMERKING: Verwijder de harten zo snel mogelijk en leg ze op ijs onmiddellijk. Na verwijdering van de harten van lichaam dienen alle procedures worden uitgevoerd op ijs.
    6. Verzamel 5 harten in 30 ml ijs gekoeld CMF HBSS en de resterende 5 harten in een 30 ml ijs gekoeld CMF HBSS. Zwenk de buis om de harten te spoelen. LET OP: Na deze stap, voer alle procedures in een laminaire stroming kap.
    7. Verwijder het supernatant en breng de harten om een ​​nieuwe gesteriliseerde 10 cm plastic schaaltje op ijs. LET OP: Wees voorzichtig niet om harten met de aspirator te zuigen.
    8. Verwijder grote vaten en / of ongewenste weefsels. Voeg 10 ml van ijs gekoeld CMF HBSS aan het gerecht om de harten te spoelen.
    9. Breng alle harten naar een nieuwe gesteriliseerde 10 cm plastic schaaltje op ijs. Hak de harten met een schaar tot minder dan 1 mm 3 op ijs.
    10. Voeg 9 ml koud CMF HBSS. Voeg 1 ml koud trypsine gereconstitueerdstitueerde met CMF HBSS (laatste 50 ug / ml).
    11. Dicht de schotel met parafilm en dek deze af met aluminiumfolie, plaats dan in een koude kamer (4 ˚ C) gedurende de nacht.
  2. Cardiomyocyte isolatie, Dag 2 (Geschatte benodigde tijd, ongeveer 4 uur)
    1. Bereid reagentia en hulpmiddelen: 50 ml conische buis x 2; 2 mg trypsine inhibitor, opgelost in 1 ml CMF HBSS, op ijs; 1500 eenheden collagenase, opgelost in 5 ml Leibovitz L-15, bij kamertemperatuur (KT); Leibovitz L-15, bereid met 1 liter gesteriliseerd water en gefiltreerd door een 0,22 micron filter, 8 ml bij kamertemperatuur; 10 mg / ml (32,6 mM) BrdU in water; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; twee 10 cm plastic celkweekschalen; 3,5 cm glazen bodem gerechten.
    2. Day2, Voorbereiden gelatine gecoate gerechten. Voeg 1 ml van 0.1% gelatine oplossing voor het bekleden van een 3,5 cm glazen onderste schaal een imagingexperiment. Incubeer gerechten bij 37 ˚ C gedurende enkele uren, dan zuigen en gelatine oplossing weggooien voor gebruik.
      NOTE: Een 3,5 cm glazen bodem gerecht is geschikt voor een imaging experiment met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Voor het afzuigen van eiwitten uit primaire hartspiercellen op eiwit expressie te detecteren door western blotting (WB), kan 0,1% gelatine beklede kunststof celkweekschalen worden gebruikt.
    3. Breng alle hartweefsel verteerd door trypsine nachts met buffer in een 50 ml conische buis op ijs in de gesteriliseerde kap. Voeg 1 ml trypsine-remmer in CMF HBSS (definitief 182 ug / ml). Sluit het deksel van 50 ml conische buis strak om besmetting te voorkomen.
    4. Incubeer de buis gedurende ongeveer 30 minuten in een 37 ˚ C incubator op te warmen weefsel en de buffer op 30-37 ˚ C. Voeg 5 ml collagenase in Leibovitz L-15 (laatste 94 eenheden / ml). Incubeer bij 37 ˚ C gedurende 45 min zachtjes schudden (170-200 rpm shaker in 37 ˚ C incubator).
      OPMERKING: Deze stap kan buiten de laminaire stroming kap worden gedaan. Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
    5. Desinfecteer de buitenkant van een 50 ml conische buis met 70% EtOH en zetin de gesteriliseerde kap.
    6. Vermaal weefsels met behulp van automatische pipet met pipetteren bij 3 ml / sec snelheid voor 20 keer. Laat weefsel residu te regelen voor 3 min en filteren de bovenstaande vloeistof met een 70 um cel zeef.
      OPMERKING: Een regelmatige vorm 10 ml pipet kan worden gebruikt voor trituratie.
    7. Voeg 5 ml van de Leibovitz L-15 om de resterende weefsel klonten en vermaal en filteren de supernatant opnieuw. Was cel zeef met 2 ml van de Leibovitz L-15.
    8. Plaats gefiltreerde cel oplossing in een motorkap voor 20-60 min om collagenase aan de gedeeltelijk afgebroken collageen verteren.
    9. Sediment cellen bij 100 x g gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in 20 ml DMEM dat 10% FBS en hoge concentratie P / S (20 U / ml).
    10. Pre-plaat cellen op twee 10 cm plastic celkweekschalen gedurende 1 uur in CO 2 incubator bij 37 ˚ C voor cardiomyocyten selectie. OPMERKING: Fibroblasten hechten beter aan de bodem van de schaal dan cardiomyocyten.
    11. While wachten, bereid DMEM met 10% FBS, P / S (10 U / ml) en 0,1 mM BrdU. Voeg 1 ml 10 mg / ml BrdU tot 325 ml DMEM dat 10% FBS en P / S.
    12. Swirl gerechten zachtjes en verzamel de cardiomyocyte bevattende supernatant van twee 10 cm schotels.
      OPMERKING: De meeste hartspiercellen worden nog steeds zwevend in de supernatant na 1 uur incubatie. Om verontreiniging met fibroblasten die licht zijn aangesloten op de schotel te voorkomen, mag het supernatans niet innen door pipetteren.
    13. Optioneel> Tel cellen in de bovenstaande vloeistof met en zonder 0,2% trypaanblauw levensvatbaarheid van de cellen te controleren.
    14. Sediment cellen bij 100 x g gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in DMEM met 10% FBS, P / S (10 U / ml) en 0,1 mM BrdU. Plaat cellen op 2 x 10 5 cellen / schaal in-gelatine beklede 3,5 cm glazen bodem gerechten voor observatie met behulp van de microscoop. OPMERKING: de cellen niet storen na plating ten minste 24 uur in CO 2 incubator bij 37 ˚ C.
    15. Dag 3, ChaNSE medium 24 uur na plating aan DMEM / MEM met 5% FBS, P / S en 0,1 mM BrdU.
    16. Dag 4, Verander medium 48 uur na plating aan DMEM / MEM met 5% FBS en P / S.
      OPMERKING: Wijzig medium om de 2-3 dagen met DMEM / MEM met 5% FBS en P / S.

2. Lentivirale transductie

  1. Verpakking van lentivirale plasmiden
    OPMERKING: Raadpleeg de andere bronnen voor meer diepgaande informatie over dit onderwerp 24-26. Het zal ongeveer 3 dagen om de lentivirale oplossing te bereiden. Het beste is om verse lentiviral oplossing te gebruiken om hogere transductie efficiëntie te bereiken. Start de verpakking van lentivirale plasmiden en isolatie van rat neonatale cardiomyocyten parallel. In plaats van polyethyleenimine (PEI) 27 voor het verpakken van lentivirale plasmiden, kan een commercieel verkrijgbare transfectie reagens worden gebruikt. Volg de instructies van de fabrikant.
    1. Bereid reagentia en instrumenten; HEK293T-cellen, 10 cm plastic celkweekschalen, lentivirale plasmide oplossingen (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentivirale transfer vector, 1,0 mg / ml elk), 1 g / l PEI, serum-vrij medium, 20 mM chloroquine in water, 10% bleekmiddel, 1% SDS in 70% EtOH
    2. Dag 0, Plate 2-2,5 x 10 6 HEK 293T cellen per 10 cm de dag voor transfectie schotelen.
      OPMERKING: 30-60% confluentie op transfectie is optimaal.
    3. Dag 1, Voorbereiden PEI transfectieoplossing. Voeg 30 ul van 1 g / l PEI 960 ul serumvrij medium in een 1,5 ml buis. Voeg 4 plasmiden in de PEI transfectie oplossing in de buis van 1,5 ml, en meng met tikken.
    Naam van plasmide Noot Grootte (KBP) toegevoegde volume (ml) Eindbedrag in 10 cm schotel (mg) Uiteindelijke concentratie 10 cm schaal (pM)
    Lentivirale transfer vector gen codeert te verpakken 9-13 3,6-5,2 3,6-5,2 60
    pMDLg / pRRE uitdrukt HIV-1 GAG / POL 8.8 1,76 1,76 30
    pRSV-Rev uitdrukt HIV-1 REV 4.1 0,82 0,82 30
    pMD2.G uitdrukt VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    Tabel 2:. Het bedrag van de plasmiden voor lentivirale verpakking Gebruik deze plasmide bedraagt ​​HEK293 cellen te transfecteren in 10 cm schalen. Eindbedrag van lentivirale transfer vector per gerecht kan verschillen naar gelang van de grootte, uiteindelijke concentratie per gerecht te handhaven op 60 uur. Gemiddeld molecuulgewicht van een basepaar van dubbelstrengs DNA 660 dalton.

    1. Gooi de oude mediumvan 10 cm schaal van HEK 293T cellen, en zachtjes voeg 9 ml nieuw medium (DMEM + 10% FBS, zonder P / S).
    2. Voeg PEI-DNA mengsel voorzichtig druppelsgewijs op de plaat en draai voorzichtig om te mengen met medium. Voeg 10 ul van 20 mM chloroquine (laatste 20 uM) tot 10 ml medium. OPMERKING: Chloroquine wordt gedacht dat de afbraak van plasmide bevattende transfectie complexen binnen lysosomale compartimenten 28 te verminderen door gedeeltelijke neutralisatie van de pH.
    3. Incubeer in CO 2 incubator bij 37 ˚ C gedurende 6 uur. Verwijder vervolgens medium dat het PEI-DNA mengsel en voeg 10 ml nieuw medium (DMEM + 10% FBS + 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), pH 7,4 + P / S) . OPMERKING: Na incubatie virus wordt geproduceerd in het medium. Opzuigen Pasteur pipetten en / of tips, moet gereinigd worden met 10% bleekmiddel. Ontsmetten van de biologische veiligheid kabinet oppervlak altijd en mogelijk besmet materiaal met 70% EtOH, ongeacht of supernatant is gemorstof niet. Als morsen opgetreden, grondig decontaminatie met 1% SDS in 70% EtOH noodzakelijk.
    4. Dag 2-3, Incubate in CO 2 incubator bij 37 ˚ C gedurende 48-72 uur. Dag 4, verzamel lentivirale oplossing (blijven paragraaf 2.2).
      OPMERKING: Medium kan op 48 uur na transfectie worden gewijzigd. Verzamelen virus supernatant 48 uur en 72 uur tweemaal kan bereiken hogere titer virus oplossingen te vinden.
  2. Het verzamelen van lentivirale oplossing en transductie
    1. Bereid reagens en gereedschappen: 15 ml conische buizen, 1 M HEPES, pH 7,4 (0,22 um gefilterd)
    2. Dag 4, Verzamel supernatant dat lentivirus deeltjes (lentivirale oplossing) met 10 ml gesteriliseerd Luer-Lok spuit, dan filteren op de bovenstaande vloeistof op 0,45 um filter in een 15 ml conische buis. Voeg 1/100 volume 1 M HEPES pH 7,4 gefilterde lentivirale oplossing (uiteindelijke 10 mM).
      OPMERKING: Voor het filteren, gebruik dan alleen cellulose aceTate of polyethersulfon (PES) (geringe eiwitbinding) filters. Gebruik geen nitrocellulosefilters. Nitrocellulose bindt oppervlakte-eiwitten op de lentivirale omhulling en vernietigt het virus.
    3. Verwijder medium van 3,5 cm schalen van rat neonatale cardiomyocyten, verkregen bij de laatste stap van paragraaf 1.2, voeg 1 ml gefilterd lentiviral oplossing voor de 3,5 cm schotel.
    4. Toevoegen hexadimethrine bromide (eindconcentratie 4-6 ug / ml).
      OPMERKING: Hexadimethrine bromide kan lentivirale transductie efficiëntie te verbeteren. Concentratie van hexadimethrine bromide worden geoptimaliseerd.
    5. Incubeer schotel voor 6 uur in CO 2 incubator bij 37 ˚ C voor lentivirale transductie, dan veranderen medium om nieuwe DMEM / MEM met 5% FBS en P / S. Incubeer schotel in CO 2 incubator bij 37 ˚ C gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: Integratie van het exogene gen in het genoom van de gastheer door lentivirus wordt geacht te worden ingevuld door 72 uur.
    7. Dag 7, gebruiken cellen uit stap 2.2.5 voor de volgende stap. OPMERKING: Eiwit expressie van lentivirale plasmide kan worden bevestigd door WB of immunocytochemie (ICH) na 48-72 uur na transductie teneinde het relatieve expressieniveau bepalen (figuur 1a en 1b).
  3. Concentratie van lentivirale oplossing
    OPMERKING: Het beste is om verse lentiviral oplossing te gebruiken om de hoogste transductie efficiëntie te bereiken, in het geval de lentivirale oplossing titer niet hoog genoeg is, de lentivirale oplossing kan worden geconcentreerd door polyethyleenglycol (PEG) neerslag 29.
    1. Bereiding van 4x PEG-oplossing (32% PEG6000, 400 mM natriumchloride (NaCl), 40 mM HEPES pH 7,4)
      1. Voor 125 ml 4x PEG-oplossing, weegt 40 g PEG6000, los het dan in 60 ml water.
        Noot: (. Dwz gemiddeld molecuulgewicht van PEG6000 6.000) Het nummer na de PEG molecuulgewicht
        OPMERKING: 2.3.1.2) Voeg langzaam 10 mlvan 5 M NaCl. Voeg langzaam 5 ml van 1 M HEPES pH 7,4. Breng de pH op 7,4 met 2 M natriumhydroxide.
        OPMERKING: 2.3.1.3) Voeg water toe tot 125 ml. Steriliseren 4x PEG-oplossing door membraanfiltratie met een 0,22 um filter en het op 4 ˚ C.
    2. Lentivirus concentratie
      1. Filter lentivirale getransduceerde supernatans in nieuwe 50 ml buis met behulp van een 0,45 um filter.
        OPMERKING: 2.3.2.2) toevoegen 4x PEG-oplossing 01:03 ratio (PEG-oplossing: supernatant = 1:3). Bewaren bij 4 ˚ C gedurende 16-48 uur.
        OPMERKING: 2.3.2.3) Centrifugeer bij 2600 x g bij 4 ˚ C gedurende 30 minuten. Het supernatans en centrifugeer bij 2600 x g bij 4 ˚ C gedurende 5 minuten.
        OPMERKING: 2.3.2.4) supernatans voorzichtig om de pellet te verstoren. Resuspendeer pellet in serumvrij medium met 1/2 tot 1/25 volume van het oorspronkelijke volume supernatant.
        OPMERKING: 2.3.2.5) Gebruik direct of bevriezen met behulp van vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ˚ C

3. Adenovirale transductie

OPMERKING: Raadpleeg de andere bronnen voor methoden voor de bouw en voortplanting van adenovirale constructen 13. Opzuigen Pasteur pipetten en / of tips, moet gereinigd worden met 10% bleekmiddel. Ontsmetten altijd de biologische veiligheid kabinet oppervlak en mogelijk besmet materiaal met 70% EtOH, ongeacht of supernatant is gemorst. Als morsen opgetreden, grondig decontaminatie met 1% SDS in 70% EtOH noodzakelijk.

  1. Adenovirale titratie met 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID 50)
    OPMERKING: Voordat transductie, is het noodzakelijk om de adenovirale voorraad oplossing titreren. TCID50 is een van de beste methoden om de virale oplossing te titreren. Omdat de werkwijze evalueert een titer door een besmettelijk vermogen om HEK 293T-cellen, berekend TCID50 weerspiegelt werkelijke infecteerbaarheid van het adenovirus voorraad. De PFU (plaque vormende units) is evenredig met de TCID50 met een factor van ongeveer 0,56 30.
    1. Bereid cellen en gereedschappen: HEK 293T cellen, 10 cm celkweekschalen, 96-well vlakke bodem celkweek plaat, 8-kanaals multi pipet
    2. Bereid 70-90% samenvloeiing HEK 293T cellen in een 10 cm schotel.
    3. Voer een pre-verdunning van 1/10 4 van het virus voorraad. Voeg 50 ul DMEM + 10% FBS aan elk putje van een 96-well vlakke bodem celkweek plaat. Voeg 25 ul van de verdunde pre-virusvoorraad in de eerste rij A tot H
    4. Meng goed en breng 25 ul van de eerste rij van putten naar de tweede rij met een 8-kanaals multi pipet. Herhaal 1/3 verdunning van virale oplossing voor elke rij putjes tot en met de 11e rij en de laatste 25 ul ontdoen.
    5. Vermaal HEK 293T-cellen in 10 ml DMEM + 10% FBS. Voeg 50 ul van cel-oplossing in elk putje van de rijen 1 tot 12.
    6. Incubeer de cellen bij 37 ˚ C in CO2 incubator voor 11-13 dagen. Voeg 50 ul DMEM + 10% FBS na 4-5 dagen en 7-8 dagen in de platen.
    7. Meet de cytopathische effecten in elk putje op 11-13 dagen na infectie.
    rijstrook 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Rij A d d d d d d d d d
    Rij B d d d d d d d d d
    Rij C d d d d d d d d d
    Rij D d d d d d d d
    Rij E d d d d d d d d d d d
    Rij F d d d d d d d
    Rij G d d d d d d d d
    Rij H d d d d d d d d d d d
    het aantal positieve wells per rij 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    de verhouding van positieve wells per rij 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0,63 0.25 0.25 0
    d Weergeven van meer dan 50% cytopathische effecten
    Artikel onder de 50% of geen cytopathische effecten

    Baan 1, verdunning 3 1 x10 4; baan 2, verdunning 3 2 x10 4; ...; laan 11, verdunning 3 2 x10 11; laan 12, controle.
    S = de som van de verhoudingen van positieve putjes per rij
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8,875
    TCID50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875-0,5) = 2,97 x 10 8
    TCID 50 / ml = 5,94 x 10 9

    Tabel 3: Voorbeeld van een geïnfecteerde 96 well-plaat na 10 dagen incubatie Meet de cytopathische effecten in elk putje en de som van de verhoudingen van positieve wells per rij..

    1. Bereken de titer volgens Kaerber formule 31.
    2. TCID 50 = (verdunning van eerste baan) x (verdunning) (S-0.5)
    3. S = de som van de verhoudingen van positieve putjes per rij
      LET OP: Voor dit protocol, TCID 50 = (30000) x (3) (S-0.5). Omdat 50 ul van virale oplossing wordt gebruikt in dit protocol, verdeel TCID 50 bij 0,05 tot TCID 50 / ml te berekenen.
  2. Adenovirale transductie
    1. Bereken vereiste hoeveelheid adenovirale oplossing van de titer (PFU / ml, viraal deeltje / ml of TCID50 / ml). Gebruik de formule voor de berekening MOI (multipliciteit van infectie).
    2. em> [Plaats Tabel 4 hier]
    3. Voeg berekende hoeveelheid virus oplossing serumvrij medium (zie tabel 5). Meng goed en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    4. em> [Place Tabel 5 hier]
    5. Day7, Neem gerecht verkregen bij de laatste stap van paragraaf 2.2, en vervang-medium met 750 ul van nieuwe DMEM / MEM met 5% FBS en P / S.
      OPMERKING: Vermindering van gemiddeld volumebij transductie tot ongeveer 50% van het oorspronkelijke volume is essentieel voor hoge transductie efficiëntie.
    6. Voeg verdunde virus oplossing voor te schotelen. Incubeer gerecht voor 4-8 uur in CO 2 incubator bij 37 ˚ C. Dan, te vervangen door vers medium.
    7. Incubeer schotel voor 24-48 uur in CO 2 incubator bij 37 ˚ C. Op dag 8-9, Gebruik cellen voor de live-cell imaging experiment. OPMERKING: Eiwit expressie van adenovirale plasmide kan worden bevestigd door WB of ICH na 24-48 uur na transductie teneinde het relatieve niveau van eiwitexpressie (figuur 1c en 1d) bepalen.

4. Live cell imaging

  1. Beeldopname met behulp van een confocale microscoop draaiende schijf met een temperatuur gecontroleerde ruimte en een CO 2-milieu-systeem (optioneel)
    1. Temperatuurregelaar systeem ten minste 1 uur vóór de verwerving, zodat alle apparaten temperatuur ervan 37 ˚ C voor het begin van verwerving. Zet confocal spinning disk microscoop systeem (PC voor bediening, microscoop, draaiende schijf unit, CCD-camera, lasers, fluorescerende lichtbron, normale lichtbron, gemotoriseerde podium, en automatische rolluiken).
      OPMERKING: meer dan 1 uur nodig om de volledige temperatuurevenwicht van devices.
    2. Medium veranderen in 3,5 cm glazen bodem gerechten om gewenste medium voor de overname, indien nodig. Zet de schaal op het podium van de confocale microscoop draaiende schijf in een temperatuur gecontroleerde ruimte.
      OPMERKING: In verband met sferische aberratie voor een optimale waarneming door microscopie gebruik van een 3,5 cm glazen bodem schaal met nr. 1.5 afdekglas (ongeveer 0,16-0,19 mm dikte) is ideaal. Als het doel wordt gebruikt heeft een correctie kraag, kunnen beelden verkregen met deksel glazen dikker dan 0,17 mm worden gecorrigeerd. Ook Fenolrood een lichte fluorescentie. Soms verdient het de voorkeur een fenol rood-vrij medium, zoals DMEM zonder fenolrood. Als er geen apparaat om CO controleren 2-concentratie op de microscoop fase is beter in een CO2 onafhankelijk medium of medium gebufferd met HEPES voor langdurige time-lapse imaging.
    3. Selecteer het lichtpad naar het oculair.
    4. Draai de sluiter van de bright-field lichtbron op. Pas de focus naar de cellen onder de microscoop door de oculairs. Draai de sluiter voor de bright-field lichtbron af.
    5. Draai de sluiter voor de fluorescerende lichtbron op. Vind cellen die fluorescerende eiwitten onder de microscoop door de oculairs. Draai de sluiter voor de fluorescerende lichtbron af.
    6. Optioneel> Druk op de activatie knop voor de perfecte focus systeem voor de microscoop om de perfecte focus systeem op te zetten om de focus stabiel te houden tijdens de time-lapse acquisitie.
    7. Verander het licht pad naar de draaiende schijf confocale microscoop. Instellingen voor overname aanpassen adequaat op het gebruik van de besturingssoftware, het controleren van beelden displaYed op het scherm. (Bv. Focus, laservermogen, belichtingstijd, CCD-camera gain en off-set)
    8. Stel de instellingen voor de fluorescerende beeldaanwinst behulp besturingssoftware. Voorbeeld: Selecteer "Verander kanalen met behulp van licht paden" en "Channel 1: EGFP" naar fluorescerende signaal over te nemen van EGFP voor kanaal een.
    9. Stel de frequentie tussen tijdstippen door het configureren van time-lapse-instellingen om time-lapse opnamen te maken met de bedieningssoftware. Voorbeeld: Als u een time-punt te verwerven om de 5 minuten, selecteer "Minuten per Time-point" in het drop-down menu en voer 5 in het tekstveld.
      OPMERKING: Selecteer "Maximumsnelheid" om een ​​film te maken op ware snelheid. Als uitdrukking van het fluorescerende eiwit laag is, kan de fluorescentie snel bleken tijdens de time-lapse acquisitie. In dat geval is het beter om het aantal acquisitie tijdstippen reduceren.
    10. Start de time-lapse overname door te klikken op de "start "om een ​​sequentie van beelden te verwerven.
      OPMERKING: Het is beter de multiple-punten acquisitie functie niet te gebruiken. Het kan leiden tot verlies van focus of beweging van het veld beeldvorming tijdens time-lapse imaging veroorzaken.
  2. Analyse van de verkregen beelden
    OPMERKING: Verworven beelden kunnen worden afgespeeld als een filmbestand en het gebruik van de analyse software geanalyseerd.
    1. Selecteer de verkregen beelden worden opgenomen in een film. Indien nodig, gewas gebieden van belang uit afbeeldingen en kies interessante tijd-punten om de bestandsgrootte van de film met de bedieningssoftware verminderen.
    2. Exporteer afbeeldingen als een filmbestand in AVI of MOV-formaat. Selecteer een film formaat van "Format" drop-down menu en de timing die nodig zijn voor de voltooide film, klik dan op "Export". OPMERKING: Time-lapse beelden die in een keer-punt om de 5 minuten kan worden afgespeeld als een film in 10 frames per seconde, dat is 3000 keer sneller dan de werkelijke snelheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de techniek, een lentivirus codering EGFP (versterkt groen fluorescerend eiwit) gemerkte Cx43 (Connexin43) of gemuteerde Cx43 32 werd gebruikt om EGFP-gemerkte eiwitten tot expressie in cellen en een adenovirus dat codeert FGFR1DN (fibroblast groeifactor receptor 1 dominant negatief illustreren ) werd gebruikt om gesloten FGF signalering in de cel 33-35. Drie dagen na het isoleren van hartspiercellen werden de geïsoleerde cardiomyocyten getransduceerd met lentivirus om EGFP-gemerkte eiwitten tot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Primaire cardiomyocyten geïsoleerd uit neonatale ratten lang gebruikt om cardiomyocyten functies te bestuderen in vitro. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van neonatale cardiomyocyten van jonge ratten met een tweestaps enzymdigestie werkwijze eerst digereren met trypsine O / N bij 4 ° C en daarna gezuiverd collagenase. Een voordeel van het gebruik van het gezuiverde collagenase stap is dat dezelfde graad van enzym wordt gebruikt voor alle isolaties. Aldus, de kwaliteit en de hoeveelheid geïs...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Alengo Nyamay'antu en Dr. Ilse Timmerman bedanken voor hun adviezen over lentiviraal verpakken. Dit werk wordt ondersteund door een American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 Scissors for decapitationWPI501749Autoclave voor gebruik
1 Fijne schaar voor hartisolatie en hakkenWPI14393Autoclave voor gebruik
2 Fijne pincetten (Dumont Nr. 5)SigmaF6521Autoclave voor gebruik
3 Gesteriliseerde plastic schaaltjes van 10 cmSigmaCLS430165Voor hartisolatie
3.5 cm glazen bodemcultuurschaaltjesMatTekP35G-1.5-20-CVoor het uiteindelijke plateren van cardiomyocyten voor toekomstige live-cel beeldvorming. Micro-Dishes van ibidi zijn een acceptabel alternatief.
3.5 cm glazen bodemcultuurschaaltjesMatTekP35G-0.17-14-CVoor TIRF of hoge resolutie afbeelding
Ethanol oplossing, 70% (v/v) in waterSigmaE7148
2% GelatineSigmaG1393
1 Gesteriliseerd plastic schaaltje van 10 cmSigmaCLS430165Voor trypsinisatie
AluminiumfolieElk merk
ParafilmSigmaP7543
Twee plastic cellencultuurschaaltjes van 10 cmSigmaCLS430165Voor selectie
AutopipetDrummond Scientific4-000-300Voor trituratie
Cell counter
Cellometer, geautomatiseerde cell counternexcelomOm cellen te controleren en te tellen
Microscoop en hematocytometerElk merkOm cellen te controleren en te tellen
Trypanblauw oplossing, 0,4%invitrogen15250-061
CO2 incubatorSanyoMCO-19AIC
Incuberende orbitale schudderSigmaZ673129Om hartweefsel te schudden met collagenase bij 37 °C bij 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU oplossingBD Pharmingen550891
DMEM, hoge glucoseinvitrogen41965039Meng medium zoals aangegeven in het protocol en verwarm voor gebruik
MEMinvitrogen31095029Meng medium zoals aangegeven in het protocol en verwarm voor gebruik
Fetaal bovien seruminvitrogen26140079
Penicilline-streptomycine (10.000 U/ml)invitrogen15140-122
Sectie 2 Lentivirale transductie
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
De lentivirale transfer vector, pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM (serumvrij medium)invitrogen31985070
Transfectie reagens
polyethyleenimine“Max”, (MW 40.000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25.000 in Free Base Form)Polysciences24765-2Kan worden vervangen door X-tremeGENE 9 van Roche
X-tremeGENE 9Roche6365779001vervanger voor PEI als transfectie reagens
ChloroquineSigmaC6628Oplossen in water en maak 100 mM stock oplossing. Remming van endosomale acidificatie kan worden bereikt met 10-100 µM Chloroquine.
HEPESSigmaH3375
10 ml Luer-Lok spuit, gesteriliseerdBD309604
0.45 µm filtersSigmaF8677Gebruik alleen cellulose acetaat of polyethersulfone (PES) (lage proteïne binding) filters. Gebruik geen nitrocellulose filters. Nitrocellulose bindt oppervlakte-eiwitten op de lentivirale envelop en vernietigt het virus.
HexadimethyleenbromideSigmaH9268Oplossen in water en maak 8 mg/ml stock oplossing, en filter het vervolgens om te steriliseren.
Polyethyleenglycol 6.000Sigma81260
NatriumchlorideSigmaS9888
NatriumhydroxideSigmaS5881
Sectie 3 Adenovirale transductie
HEK 293T cellenATCCCRL-11268
Enkele cellencultuurschaaltjes van 10 cmSigmaCLS430165
96-Well microplaat met deksel, platte bodem, weefselcultuur, sterielBD Falcon353072Voor titratie
Meerkanaals pipet, 10-100 µl, 8-kanaalseppendorf3122 000.035
Sectie 4 Live-cel beeldvorming
Spinning disk confocale microscopiePerkinElmerL7267000
Een temperatuur gecontroleerde kamerElk merkOm de temperatuur op 37 °C te houden
Een CO2 omgevingssysteemElk merkOptioneel om de CO2 concentratie optimaal te houden
CO2 Onafhankelijk medium, geen glutamineinvitrogen18045-054Voor lange tijd time-lapse beeldvorming
DMEM, hoge glucose, HEPES, geen fenolroodinvitrogen21063-029Voor lange tijd time-lapse beeldvorming

Referenties

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Adenovirale transductietime-lapse imagingprotocol voor celisolatieEGFP-gelabelled eiwitdominant negatieve FGFRglazen bodemschalenautofocus-systeem
Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.