Methodenartikel

Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door

DOI:

10.3791/51668

⸱

12 juni 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke infectie door Entamoeba histolytica leidt tot amoebiasis, een belangrijke oorzaak van diarree in tropische landen. Infectie wordt gestart door pathogeen interactie met intestinale epitheelcellen, veroorzaken de opening van cel-cel contacten en bijgevolg diarree, soms gevolgd door leverbesmetting. Dit artikel geeft een model om de vroege gastheer-pathogeen interacties beoordelen in ons begrip van amoebiasis pathogenese verbeteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entamoeba histolytica is de verwekker van de menselijke amoebiasis, een belangrijke oorzaak van diarree en lever abces in tropische landen. Infectie wordt geïnitieerd door interactie van het pathogeen met intestinale epitheelcellen. Deze interactie leidt tot verstoring van intercellulaire structuren zoals tight junctions (TJ). TJ zorgen voor afdichting van de epitheliale laag om gastweefsel scheiden van darmlumen. Recente studies tonen aan dat verstoring van TJ door de parasitaire eiwit EhCPADH112 is een voorwaarde voor E. histolytica invasie die gepaard gaat met epitheliale barrière disfunctie. De analyse van de moleculaire mechanismen betrokken bij TJ demontage tijdens E. histolytica invasie is van het grootste belang voor ons begrip van amoebiasis pathogenese verbeteren. Dit artikel presenteert een eenvoudig model dat de beoordeling van de eerste gastheer-pathogeen interacties en de parasiet invasie potentieel toestaat. Te analyseren parameters omvatten transepithelial elektrische weerstand interactie van EhCPADH112 epitheliale oppervlak receptoren, veranderingen in de expressie en localisatie van epitheliale junctie merkers en lokalisatie parasiet moleculen in epitheelcellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entamoeba histolytica is een eencellige protozoaire verantwoordelijk van menselijke amoebiasis, een darminfectie veroorzaakt ontsteking en diarree. E. histolytica infecteert tot 50 miljoen mensen per jaar, maar slechts ongeveer 10% van de geïnfecteerde mensen ontwikkelen de symptomen verbonden met amoebiasis 1. Infectie optreedt na inname van besmet voedsel of water met E. histolytica cysten. In de darm, cysten produceren levende trofozoïeten die voldoen aan dikke darm mucine en vermenigvuldigen 2. Trofozoiten vormen meestal cysten die worden uitgescheiden via de ontlasting. In andere gevallen en voor nog onbekende redenen, trofozoïeten breken de intestinale epitheliale laag en binnenvallen onderliggende weefsels. In het ergste geval, ze in de bloedbaan en invloed op andere organen zoals de lever 3.

Het doorbreken van de epitheliale barrière vereist verstoring van epitheliale transmembraanpenetratie structuren die cellen toegetreden handhaven. Epitheelcellencontacten worden gevormd door de apicale junctionele complex bestaande uit vast (TJ) en contactplaatsen (AJ) en desmosomen 4. De meest apicale knooppunten zijn TJ, en daarom zijn ze de eerste barrière beledigd door E. histolytica en enkele andere ziekteverwekkers tijdens gastheer invasie. TJ bestaan ​​uit transmembraanpenetratie adhesie receptoren zoals Claudins, occludin en junctionele adhesiemoleculen (JAM) die zich bezighouden met homo-of heterofiele interacties met receptoren van de naburige cel. Ze worden intracellulair gebonden aan steiger moleculen van de zonula occludens (ZO) familie die adhesiereceptoren aansluiten op actinecytoskelet verdere mechanische sterkte aan het epitheel. TJ zijn verantwoordelijk voor het afdichten van darmweefsel uit de darm lumen, het voorkomen van overmatig water en opgeloste stof lekken. Zo, na TJ worden verstoord door de parasiet, weefsels zijn binnengevallen. E. histolytica scheidt verschillende moleculen, zoals: (i) die betrokken is bij hechting van amoebae te target 5 cellen; (Ii) membraan-actieve factoren die aan doden van gastheercellen door exocytose, bijvoorbeeld ion-channel vormende peptiden genoemd amoebapores 6,7; en (iii) proteïnasen die extracellulaire matrix afbreken en bemiddelen weefsel desintegratie 5,8,9.

De cysteïne protease EhCP112 en adhesiemoleculen EhADH112 die samen de EhCPADH112 complex twee E. histolytica virulentie eiwitten die een belangrijke rol spelen bij de demontage van TJ 10. Levende trofozoiten, hun totale lysaten en uitgescheiden te induceren moleculaire veranderingen in de TJ complexe en functionele verstoring van de epitheliale barrière. In deze studie wordt aangetoond dat EhCP112 en EhADH112 interactie met occludin en claudine-1 eiwitten leidt tot internalisatie en degradatie van cel eiwitten, waardoor E. vergemakkelijkt histolytica entree via de paracellulaire pad.

Onze gegevens en die of andere groepen 11-17 suggereren sterk de noodzaak van specifieke gastheer-pathogeen interacties die parasiet invasie mogelijk te maken. Het ontrafelen van de moleculaire basis van deze interacties is van groot belang voor een beter begrip van amoebiasis pathogenese. Selectieve verstoring van TJ door trofozoïeten, gekenmerkt door verhoogde paracellulaire permeabiliteit kan worden gemeten door een afname in transepitheliale elektrische weerstand (TER). De overdracht van parasitaire eiwitten naar gastheer epitheel kan worden bepaald door immunofluorescentie kleuring en confocale laser microscopie, een werkwijze die ook co-lokalisatie van amoebe virulentiefactoren epitheliale junctions bebakening mogelijke directe interacties kunnen onthullen. In dit artikel beschrijven we in detail hoe epitheelcellen en trofozoiten worden gekweekt, geoogst en gemanipuleerd om gastheer-pathogeen interacties en de gevolgen daarvan te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Opzetten en onderhouden van E. histolytica Cultures

  1. Grow axenisch (geheel vrij van alle andere verontreinigende organismen) 1 x 10 5 trofozoiten van Entamoeba histolytica stam HML: IMSS klonen A 18 in 16 x 125 mm cultuur buizen met Teflon liner schroefdoppen (of 1 x 10 6 trofozoïeten in een wegwerp T- 25 kolf) en 15 ml (of 50 ml in T-25 kolf) van TYI-S-33 medium (TYI bouillon aangevuld met 3% Diamond vitaminemengsel, 10% hitte geïnactiveerd volwassen runderserum, 0,5 IU / ml penicilline en 35 ug / ml streptomycine) 19 in een incubator bij 37 ° C.
  2. Oogst trofozoïeten in de logaritmische groeifase meestal 48-96 uur tijdstippen (figuur 1) door koeling de kweek buizen gedurende 5-10 minuten in een ijs-waterbad tot trofozoïeten aan de glazen kweekbuis los.
  3. Breng de cultuur in een conische buis en keer het een paar keer om de cel te verspreidenls. Bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer (Neubauer kamer), en breng een entstof in een cultuur buis met verse TYI-S-33 medium.
    1. Gebruik lage aantallen amoebes langer incubatie (~ 3 x 10 5 cellen ~ 5 dagen) en een groter aantal voor kortere perioden (~ 1 x 10 6 cellen ~ 1 dag). Terwijl geteld inocula zijn wenselijk, opgericht culturen geworden voorspelbaar zodat geschatte volumes inocula haalbaar zijn.
    2. Titreer de hoeveelheid trofozoïeten aan celaantallen optimaliseren voor elk experiment.
    3. Handhaaf een parallel duplicaat cultuur om een ​​back-up in geval van onbedoelde verontreiniging of buis breuk hebben.
  4. Cap buizen ze stevig en incubeer bij 37 ° C in een 5 ° gekanteld horizontale hoek.
  5. Controleer culturen door visuele inspectie regelmatig, aangezien een overmatige groei van de cultuur vele gelyseerde cellen kan bevatten.

2. Oprichting en onderhoud van MDCK Cultuur

  1. Groei MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cellen type I (hoge weerstand) van het beschikbare T-75 kolven met 10 ml DMEM medium aangevuld met penicilline (100 IE / ml), streptomycine (100 mg / ml), insuline (0,08 U / ml) en 10% pasgeboren kalfsserum in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.
  2. Om de cellen te splitsen, check ze op een omgekeerde microscoop. Splits cellen wanneer ze ~ 85-100% confluent.
  3. Gebruik een stofzuiger aspirator in een steriele kap en een steriele glazen Pasteur pipet om media uit de cultuur te verwijderen. Om te schrapen cellen te voorkomen, zet de fles ondersteboven en zuig media uit de benedenhoek.
  4. Doseer 10 ml voorverwarmde PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, pH 7,4) in een T-75 kolf (5 ml bij een T-25 kolf ) en schud de kolf om de cellen te wassen. Verwijder PBS door vacuüm aspiratie. Uitgebreid wassen is nodig omdat serum remt trypsine.
  5. Verdeel 1,5 ml 0,05% trypsine in een T-75 kolf (voor T-25 kolf gebruik 0,5 ml) en schud de kolf om de cellaag met trypsine bedekken.
  6. Incubeer gedurende 5-10 min in de incubator (exacte tijd afhankelijk trypsinewerking).
  7. Controleer op cel detachement door te oordelen fles tegen het licht en kijk voor vloeiende cellen. Cel detachement (afgerond cellen) kan ook worden gecontroleerd met behulp van een microscoop. Vaak cellen sneller laat een snelle, zachte klap tegen de zijkant van de kolf.
  8. Voeg 15 ml DMEM aangevuld met een T-75 kolf (5 ml voor een T-25 kolf). Resuspendeer cellen door en neer te pipetteren 4 of 5 keer.
  9. Om cellen verspreiden, verdunnen celsuspensie 01:05 met verse AANGEVULD DMEM. Cellen nummer kan ook worden bepaald op dit punt met behulp van een hemocytometer, maar dit is meestal alleen nodig als splitsen cellen in specifieke formaten voor sommige assays.

3. Bereiding van trophozoite Totaal Lysaten

  1. Los trofozoïeten van culture buizen door koeling van de buis gedurende 5-10 minuten in een ijs-waterbad. Breng de kweek aseptisch in een conische buis en centrifugeer bij 360 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi voorzichtig het supernatant door decanteren, voeg ijskoude PBS om de pellet keer de buis een paar keer om de cellen en centrifugeer opnieuw dispergeren bij 360 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap tweemaal om alle sporen van TYI-S-33 medium te verwijderen.
  2. Bepaal trofozoiten nummer met behulp van een hemocytometer.
  3. Lyse trofozoiten door vries-dooi cycli. Snap-vries een afgemeten inoculum van trofozoïeten (600.000 trofozoïeten / ml) verdund in ijskoude PBS, in vloeibare stikstof gedurende 1 minuut. Ontdooi het monster bij 4 ° C en vortex krachtig. Herhaal invriezen en ontdooien 3 keer om cellysis te voltooien.
  4. Activeer proteasen in de lysaten met 0,02% β-mercaptoethanol.

4. Bereiding van trophozoite uitgescheiden producten

  1. Voer stap 3.1 en 3.2.
  2. Bepalencellen nummer en de levensvatbaarheid op dit moment met behulp van een hemocytometer en het toepassen van een trypanblauwexclusie proef 20:
    1. Verdun 9 x 10 6 trofozoïeten in 3 ml ijskoude PBS en overdracht cellen in een 50 ml conische buis. Neem 10 pi van deze schorsing en voeg 1 pl van 0,4% trypanblauw voorraad oplossing pH 7,2.
    2. Gebruik een Neubauer kamer om cellen bij een lage vergroting tellen.
    3. Tel alle cellen en scheiden het aantal blauwe cellen, omdat blauwe cellen van de kleurstof hebben genomen en dood moet worden beschouwd.
    4. Bereken het percentage levensvatbare cellen door het aantal levensvatbare cellen door het totale aantal cellen en vermenigvuldigd met 100.
  3. Breng de conische buis met de trophozoite suspensie in de incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur op 5 ° gekanteld horizontale hoek.
  4. Voor het uitgescheiden produkten, centrifugebuizen halen bij 360 xg gedurende 10 minuten. Gebruik een wegwerp en steriele spuit en zorgvuldig verzamelen van de supernatant, om contaminatie van monsters met trofozoïeten van de pellet. Verwijder eventuele overgedragen cellen door het passeren van de supernatant over een 0,22 urn celluloseacetaatmembraan. Activeer proteasen met 0,02% β-mercaptoethanol.
  5. Naar vermeende ongewenste besmetting met moleculen vrijkomen uit dode cellen te verwijderen, opnieuw de trypanblauwexclusie test voor levensvatbaarheid van de cellen. Levende en totale aantal cellen moet hetzelfde zijn als verkregen in stap 4.2. Indien dit niet het geval is, kan het verzamelde supernatans niet alleen bevatten uitgescheiden eiwitten en moet worden weggegooid.

5. Interactie van MDCK Cellen met Trofozoïeten, trophozoite Lysaten of uitgescheiden producten

  1. Incubeer samenvloeiende MDCK celmonolagen met live trofozoïeten (een MDCK-to-amoebe verhouding van 1:1), trophozoite lysaten (een MDCK-to-amoebe verhouding van 1:2) of uitgescheiden producten (een MDCK-to-amoebe verhouding van 1 : 10) bij 37 ° C gedurende 2 min en 30 (Figuur 2A).
  2. Was epitheelcellen vijf maal met ijskoude PBS om ongebonden moleculen of trofozoiten elimineren.

6. Voorbereiding van monsters voor immunofluorescentie

  1. Cultuur MDCK cellen op steriele dekglaasjes geplaatst in een 24-multiwell celkweekschaal. Controleer de cellen op de omgekeerde microscoop totdat ze 100% van de samenvloeiing. Vervang vervolgens medium met 1 ml vers AANGEVULD DMEM medium en breng de plaat naar een 37 ° C incubator gedurende 24 uur verder.
  2. Verwijder het medium met een stofzuiger aspirator en een steriele glazen Pasteur pipet en voeg 1 ml warm PBS aan elk putje. Verwijder de PBS en herhaal het wassen met verse PBS. Let erop dat cellen schrapen van de bodem van de put met de glazen pipet.
  3. Voeg verschillende omstandigheden van trofozoïeten verdund in 1 ml warm PBS: leef trofozoiten (T), trophozoite totale lysaten (TL) en uitgescheiden producten (SP).
    1. Zet de cultuur plaat in de incubator voor 2 of 30 minuten.
    2. Bereid twee controle condities: een met name genoemde tijdstip 0 min, waar MDCK cellen niet mag worden geïncubeerd met E. histolytica maar alleen met 1 ml warm PBS; en een voorwaarde secundaire antilichamen controle, in dit geval incubeer MDCK met T, TL of SP 2 of 30 min en weglaten incubatie met primaire antilichamen.
  4. Was epitheelcellen vijf maal met koude PBS om ongebonden moleculen of trofozoiten elimineren.
  5. Bevestig en permeabel de cellen met 1 ml 96% ethanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C.
  6. Om ethanol te verwijderen, voert drie snelle wassingen met 1 ml PBS bij kamertemperatuur.
  7. Voer de volgende stappen in een vochtige kamer om uitdroging van de monsters te voorkomen:
    1. Gebruik alle beschikbare platte doos die kan worden afgesloten en gevuld met een natte papieren handdoek waar monsters veilig kan worden geplaatst. Bijvoorbeeld, een lege pipet tip box dient dit doel ook.
    2. Binnen de kamer, gelijkmatig plaats een Parafilm laag en pipet 25 ul van bloking oplossing (0,5% BSA) per dekglaasje.
    3. Neem dekglaasjes uit de putten met fijne tang, voorzichtig het overtollige water uit de rand te verwijderen met een filter papier en zet dekglaasje in de daling met het blokkeren van oplossing (0,5% BSA) met de cellen naar de blokkerende oplossing. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  8. Maak een mengsel van primaire antilichamen in PBS: IgM muizen anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112, 1:10 verdunning) en IgG konijn anti-ZO-1 (pα-ZO-1, 1:100 verdunning).
  9. Leg een nieuw vel Parafilm in de vochtige doos en pipet 25 ul van antilichamen oplossing voor elke dekglaasje.
  10. Til de dekglaasjes van de blokkerende oplossing, drogen de overtollige vloeistof aan de randen een papieren filter, en plaats ze in de druppels met de cellen naar het antilichaam oplossing. Incubeer de monsters overnacht bij 4 ° C.
  11. Zet elk dekglaasje in een putje van een 24-multiwell (celkant boven) en voeg 1 ml PBS.
    1. Was vijf maal met 1 ml PBS om ongebonden moleculen te verwijderen.
  12. Maak een mengsel van fluorescente secundaire antilichamen in PBS: geit anti-IgM muis gekoppeld aan FITC (1:100 verdunning) en geit anti-konijn IgG gekoppeld aan TRITC (1:50 verdunning).
  13. Leg een nieuw vel Parafilm in de vochtige doos en pipet 25 ul van de secundaire antilichamen oplossing voor elke dekglaasje.
  14. Breng de monsters in 6.10 en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker bleken van de fluorescerende kleurstoffen voorkomen. Herhaal stap 6.11.1.
  15. Voor nucleaire kleuring, incubeer gedurende 3 min met 200 ul 0,05 mM DAPI oplossing bij kamertemperatuur en bescherm tegen licht. Herhaal stap 6.11.1.
  16. Om de fluorescente kleurstoffen besparen, plaatst de dekglaasjes (cellen naar beneden) in 5 pi Vecta Shield Antifade montage oplossing op glas microscoop dia's. Dicht de dekglaasjes met behulp van nagellak tot monster voorkomen dat ze uitdrogen.
  17. Voor de lange termijn opslag, houden dia's in eenmicroscoopdia doos bij -20 ° C.
  18. Analyseer de voorbereidingen van confocale microscopie door Z-stack secties en xz-vliegtuigen (Figuur 2A).

7. Incubatie van Trofozoïeten met proteaseremmers of specifiek antilichaam

  1. Herhaal de stappen 3.1 en 3.2. Voor elke experimentele conditie, incubeer 1 x 10 5 trofozoïeten (geresuspendeerd in 50 gl PBS) met proteaseremmers (1 mM Volledige en 40 ug / ml E-64) of 30 ug monoklonaal antilichaam tegen EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 gedurende 20 minuten bij 4 ° C (Figuur 2B). Gebruik deze preparaten co-incubatie testen zoals beschreven in stap 8.5.

8. Meting van Transepitheliaal Elektrische weerstand (TER)

  1. Culture MDCK cellen op steriele transwell doorlaatbare dragers (0,4 um poriegrootte). In het bovenste compartiment plaats 100 ui celsuspensie en in het onderste compartimentBreng 600 pi DMEM medium aangevuld.
    1. Controleer het medium, op gezette tijden. Vers medium kan worden toegevoegd indien nodig.
    2. Inspecteer de cellen op een omgekeerde microscoop totdat ze 100% van de samenvloeiing. Wijzig medium om de 2-3 dagen.
    3. Celbinding (indien nodig) verbeteren evenwicht de transwell filters overnacht bij 37 ° C in DMEM vóór toevoegen van de celsuspensie.
  2. Steriliseren stx2 elektroden in de kap door onderdompeling in ethanol en daarna in steriele PBS gedurende 15 minuten elk, onder UV-licht. Sluit elektroden een EVOM epitheliale voltohmmeter en selecteer weerstand modus.
  3. Verzamel medium uit het bovenste compartiment van elk transwell en bundelen ze. Neem 50 pi van dit mengsel en media combineren met 50 ui trofozoïeten suspensie (1 x 10 5 trofozoïeten in PBS) of PBS alleen (controle). Gebruik een soortgelijk mengsel per Transwell.
  4. Mengsels toe te voegen aan de bovenste kamer van elk transwell containing de MDCK cellen. Experimentele omstandigheden omvatten MDCK cellen zonder trofozoïeten (controle), een co-kweek met trofozoiten of trofozoïeten gepreïncubeerd met proteaseremmers of mαEhCPADH112. Om de weerstand die door filters te elimineren, gebruiken transwells geïncubeerd met alleen medium. Voor elke experimentele conditie gebruik ten minste drie transwells.
  5. Onmiddellijk meten TER door dompelen de stx2 elektroden in elk transwell.
    1. Controleer of de langere elektrode raakt de bodem van de onderste kamer en de kortere elektrode onder medium in het bovenste compartiment (zie figuur 2B).
    2. Zorg ervoor dat de elektroden houden loodrecht elke keer. Dit zal verbeteren reproduceerbaarheid, aanzienlijk. Beweeg of kantelen van de elektrode tijdens de meting: dit zal leiden tot variatie van gegevens.
  6. Deze meting moet worden beschouwd als de eerste TEW-waarde. Daarna volgen de TER tijdens de volgende30 min..
  7. Om de uiteindelijke TEW-waarde te berekenen, trekt de TEW-waarde van slechts filters. Om de resultaten te vergelijken van verschillende experimenten normaliseren elk gegevenspunt naar de oorspronkelijke waarden, waarbij deze als 100% (Figuur 2B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor een succesvolle E. histolytica cultuur, moeten twee belangrijke voorwaarden worden voldaan: de groei in axenische voorwaarden en oogst in logaritmische fase. Voorheen, culturen van E. histolytica werden gemakkelijk opgericht in samenwerking met bepaalde soorten bacteriën of trypanosomatids 22. Echter, tegenwoordig is het gebruikelijk om axenic teelt van deze parasiet betekent onbepaalde subkweek van amoeben in een omgeving zonder metaboliseren bacteriën, schimmels, protozoa, of metazoan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om in vitro gastheer-pathogeen interacties tijdens epitheliale infectie te bestuderen door E. histolytica, is het cruciaal om te werken met gevestigde culturen van zowel epitheelcellen en trofozoiten. Bijvoorbeeld, vroeger, E. histolytica culturen had meestal in combinatie met bepaalde soorten bacteriën of trypanosomatids 22,23 vastgesteld. Echter, co-kweken van E. histolytica culturen contraproductief voor de studie van gastheer-pathogeen interacties omdat waargenomen effe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 aan EO) en het Mexicaanse Raad voor Wetenschap en Technologie (Conacyt, 179895 aan MS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A IMSS Hospital, MexicoWithout/numberVirulente trofozoieten18 
TYI bouillonBecton, Dickinson and Company
Merck
Merck
Merck
J.T. Baker
Reproquifin
SIGMA-Aldrich
SIGMA-Aldrich		211862
K35625437 626
21578
4873
3252-01
CAS 50-81-7
C7880
F-5879		3,45% BBL Biosate peptone
58 mM glucose
39 mM NaCl
5 mM KH2PO4
6,5 mM K2HPO4
16,3 mM ascorbinezuur
8,1 mM L-cysteïne
0,1 mM ferric ammonium citraat, pas pH 6,8 aan19
Volwassen bovien serumMicrolab, Labs., Mex.SU146Gebruik bij 10% en geïnactiveerd tot 56 °C gedurende 30 min
Diamond  vitaminenmengsel- Tween 80In vitroSR-07Gebruik bij 3%
Penicilline Lakeside,  Méx.34564SSA IV0,5 IE/ml
Streptomycine Lakeside,  Méx.75757SSA IV35 µg/ml
Pyrex 15 ml schroefdop kweekbuisjes met PTFE gecoat fenolische doppenCorning-Pyrex9826-16X16 x 125 mm, inhoud 15 ml en doppen gemaakt van een speciaal formule weerstand biedend tegen temperatuureffecten
Celkweekplaten, 6-WellCorning-Costar3516Steriele platen, putdiameter 34,8 mm en groeigebied 9,5 cm2.  Ringen op het deksel voorkomen kruisbesmetting
25 cm2 celkweekkolfCorning-Costar430168Kolfjes met kantelhals
MDCK (Madin Darby canine kidney) type IAmerican Type Culture CollectionCCL34Nierapitheelcellen gekweekt tussen de 60th en 90th passage
DMEM medium Gibco 12800-017Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium met hoge glucose.
Neonate Calf SerumIn vitroS-02Gebruik bij 10%.  
Penicilline/Streptomycine mengsel In vitro A-01Voorraad oplossing 10.000 U/µg/ml
Insulin  AMSA398MJ94SSA IVVoorraad oplossing 100 IE/ml
Trypsinoplossing In vitroEN-0050,05% enzymoplossing zonder calcium en magnesium
75 cm2 celkweekkolfCorning-Costar430720Kolfjes met kantelhals voor trofozoietencultuur in TYI-S-33 medium
Transwell doorlaatbare steunenCorning-Costar34700,4 µm polyster membraan, 6,5 mm insert in 24-well plate, groeigebied 0,3 cm2
24-well celkweekschaal  Corning-Costar3524Doorzichtig polystyreen, behandeld voor optimale celaanhechting, gesteriliseerd door gammastraling en gecertificeerd niet-pyrogeen
Complete MiniRoche11836 153 001Protease remmercocktail remmer een breed spectrum van serine, cysteïne en metallo-proteasen. Eindconcentratie 1 mM 
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butaan (E-64)SIGMA-AldrichE3132Cysteïne protease remmer, eindconcentratie 40 µg/ml
pαZO-1 Invitrogen402200IgG konijn polyklonale  antilichaam  tegen  een synthetisch peptide in de middelste regio van het ZO-1 humane eiwit
mαEhCPADH112Zelfgemaakt antilichaamWithout/ NumberIgM muis monoklonaal antilichaam  tegen  444-601 epitoop geplaatst aan C-terminaal van EhCPADH11221,27
FITC-geit anti-muis IgMZymed62-6811Fluoresceïne isothiocyanate (FITC)-gelabelde geit anti-muis secundair  antilichaam
TRITC- geit anti-konijn IgG (H+L)Zymed816114Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-gelabelde  geit anti-konijn IgG  secundair antilichaam.
STX2 ElectrodeWorld Precision Instrument 102711Bestaat uit een vast paar dubbele elektroden, 4 mm breed en 1 mm dik. Elke stick van het elektrodenpaar bevat een zilver/zilver-chloride pellet voor het meten van voltage en een zilveren elektrode voor het doorgeven van stroom. Voor gebruik met EVOM
EVOM epitheel voltohmmeterWorld Precision Instrument 12111Gebruik in weerstandsmodus en ontkoppeld houden tijdens TER metingen
Neubauer kamerMEARIENFELD610610Hemocytometer 
Leica TCS_SP5_MOLeicaWithout/numberLaser confocale microscopie met Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
VectashieldVector Laboratories, Inc.H-1000Monteermedium voor fluorescentie
4',6-diamino-2-fenylindole (Dapi)SIGMAD-

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
  2. Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
  3. Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
  4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
  5. Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
  6. Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
  7. Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
  8. Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
  9. Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
  10. Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
  11. Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
  12. Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
  13. Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
  14. Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
  15. Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
  16. Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
  17. Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
  18. Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
  19. Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
  21. Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
  22. Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
  23. Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
  24. Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
  25. Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
  26. Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
  27. Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
  28. Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
  29. Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Demontage van tight junctionsepitheliale barri refunctietransepitheliale elektrische weerstandimmunofluorescentieanalyseconfocale microscopieparasiet gastheerinteractieZO 1 markerprotease remmerbehandelingepitheliale celkweek

Gerelateerde artikelen