Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

Samenvatting

Een werkwijze om het vermogen van geïsoleerde muis alveolaire macrofagen om de groei van Aspergillus gefagociteerde sporen bedienen door confocale microscopie evalueren.

Samenvatting

De long is een interface waarbij gastheercellen routinematig worden blootgesteld aan microben en microbiële producten. Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde schimmels en andere microben tegenkomen. Macrofagen en andere immuuncellen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren en initiëren downstream ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase genereert reactieve zuurstof tussenproducten (ROI) en is van cruciaal belang voor de afweer. Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer ^{1 - 3,} het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Het doel van deze studie was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen af te bakenen in het bemiddelen afweermechanismen tegen A. fumigatus. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen ^4. Hier beschrijven we een methode voor het beoordelen van het vermogen van de muis eenlveolar macrofagen (AM's) om de groei van Aspergillus gefagocyteerd sporen (conidia) regelen. Alveolaire macrofagen zijn gekleurd in vivo en tien dagen later geïsoleerd van muizen door bronchoalveolaire lavage (BAL). Macrofagen uitgeplaat op dekglaasjes, dan geënt met groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie A. fumigatus sporen. Op bepaalde tijdstippen worden cellen gefixeerd en het aantal intacte macrofagen met gefagociteerde sporen wordt beoordeeld door confocale microscopie.

Inleiding

Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde microben tegenkomen. Macrofagen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren, innemen en beperken de groei van geïnhaleerde sporen (conidiën), en initiëren ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase zet moleculaire zuurstof om superoxide anion en downstream reactieve zuurstof tussenproducten (ROI). Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het NADPH oxidase gekenmerkt door ernstige bacteriële en schimmelinfecties en overmatige ontstekingsreacties.

Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer ^{1 - 3,} het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat alveolaire macrofagen innemen en doden Aspergillus sporen, terwijl neutrofielen voornamelijk richten op de hyphal fase ^5. Er zijn tegenstrijdige results over de rol van NADPH oxidase in macrofagen in het beheersen van de groei van A. fumigatus sporen ^{6, 7.}

Het doel van deze methode was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen bakenen als mediator afweermechanismen tegen A. fumigatus sporen. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen ^4. Het nauwst model van de gastheer op geïnhaleerd schimmels, gebruikten we alveolaire macrofagen geoogst door bronchoalveolaire lavage van gestimuleerde muizen onmiddellijk na offer. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen stelde ons in staat om zich te concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijv. aangeworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo. Bij deze werkwijze werden alveolaire macrofagen gekleurd vivo voor zo oogst om de hoeveelheid post-harvest manipulatie minimaliseren.

Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een GFP-expressie A. fumigatus stam. Deze schimmel uitdrukking GFP uit de conidiale stadium door de hyphal podium en heeft geen behoefte aan verdere kleuring. Om beelden met meer detail bieden we kozen confocale microscopie die de reconstructie van driedimensionale structuren van de verkregen beelden maakt. Drie-dimensionale reconstructie geeft de mogelijkheid om tussen hyfen groeien rond plaats of door een macrofaag. Conidia kan ook juist onderscheiden als intracellulaire versus extracellulair.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd op dieren in deze studie werden goedgekeurd door het Comite Animal Care en gebruik bij Roswell Park Cancer Institute en aan alle provinciale, federale en National Institutes of Health regelgeving.

1. In vivo Macrophage Labeling

Opmerking: PHK26 is een lipofiele kleurstof die door fagocyten wordt afgelezen in omloop en in de weefsels bij intraveneuze toediening (iv). PKH26 werd gebruikt voor in vivo labeling van de hoeveelheid na de oogst manipulatie van de macrofaag minimaliseren. PKH-26 heeft het voordeel stabiel accumuleren in alveolaire macrofagen gedurende lange perioden. Wacht 10 dagen na toediening zorgt voor de goedkeuring van alle gelabelde cellen uit de circulatie waardoor alleen alveolaire macrofagen stabiel gelabeld met PKH26 ^{8, 9.} PKH26 is een rode fluorochroom dat excitatie (551 nm) en emissie (567 nm) kenmerken compatibel ismet rhodamine of fycoerytrine detectiesystemen. Iedere etikettering procedure kan artefact introduceren, waaronder het verlies van levensvatbaarheid. Aangezien we dezelfde aanpak voor de etikettering van macrofagen uit andere muis genotypen (bijv. WT versus NADPH oxidase-deficiënt), de effecten van deze artefacten zou uniform.

1. Verdun voorraad oplossing van PKH26 (1 x 10 ^-3 M in ethanol) 1:05 in verdunningsmiddel C die door de fabrikant.
2. Belasting 100 pl verdund PKH26 in een 1/2 ml insulinespuit (29 G x 1/2 ") voor elke muis.
3. Dienen aan muizen door iv injectie (ofwel staart ader of retro orbitale) ten minste 10 dagen voor de oogst.

2. Oogsten alveolaire macrofagen door bronchoalveolaire lavage (BAL)

Het aantal muizen gebruikt voor een experiment kan variëren. Een kenmerkende opbrengst van de gestimuleerde muizen in het traject van 3-5 x 10 ⁵ alveolaire macrofagen, maar dit aantal kan sterk variëren based van factoren zoals grootte van de muis, de ervaring van de persoon die de lavage en het aantal instillaties van lavage vloeistof en uit longen opgetrokken volume. In dit protocol long lavage wordt uitgevoerd met een gesloten borstholte die samen met 1 ml herhaalde spoelingen helpt cel opbrengst te verhogen.

1. Euthanaseren muis door het toedienen van een dodelijke dosis van avertin verdoving (12,5 mg) intraperitoneaal (ip) met behulp van aseptische omstandigheden aan de oplossing steriel te houden.
2. Spray muis grondig met 70% ethanol.
3. Verwijder het vel van de craniale einde van dierlijke blootstelling van de thorax (figuur 1A).
   1. Maak een kleine snede in de huid net onder het middenrif.
   2. Steek een vinger in de uitsparing en trek de huid weg van het craniale einde van het dier (Figuur 1A).
   3. Push up iets op het hoofd, de uitbreiding van de ventrale zijde van de nek (Figuur 1A).
4. Knip een klein gaatje door de ribbenkastin de rechterkant van de thorax aan de longen leeglopen en laten ook visualisatie van de longen tijdens de volgende stappen.
5. Zoek de luchtpijp, en zorgvuldig ontleden weg omringende weefsel.
   1. Verwijder de speekselklieren, sternohyoid spieren en strottenhoofd, enz. gebogen pincet.
   2. Til met een gebogen pincet en knip met een schaar het dunne weefsel dat de luchtpijp (adventitia) onthullen de onderliggende geringd kraakbeen structuur.
6. Plaats katheter in de luchtpijp.
   1. Met behulp van gebogen pincet, plaatst een hechting achter (dorsale naar) de luchtpijp en een 10 cm lengte te trekken door de opening.
   2. Vanaf boven de cricoid (de verdikte ring van kraakbeen) zorgvuldig begeleiden een 22 G katheter en de luchtpijp te stoppen waar de luchtpijp verdwijnt achter het borstbeen.
   3. Stevig binden hechtdraad rond de luchtpijp en de katheter voor een goede pasvorm. Verwijder de naald uit de katheter.
7. Monteer 4-weg kraan.
   1. Vulleneen 6 ml spuit met DPBS, 1% FBS en hechten aan 4-weg kraan zoals in figuur 1B.
   2. Sluit een lege 6 ml spuit op de aangegeven positie op de 4-weg kraan (Figuur 1B).
   3. Bevestig open poort op de 4-weg kraan om katheter (Figuur 1B). Wees voorzichtig om katheter niet verdrijven uit luchtpijp.
8. Verzamel lavage vocht uit de longen.
   Opmerking: Onderzoekers kunnen kiezen lagere hoeveelheden spoelvloeistof om mogelijke beschadiging aan het weefsel te minimaliseren. Het is belangrijk dat dezelfde benadering consistent toegepast in alle groepen muizen.
   1. Draai de hendel op de kraan, zodat de lege spuit is afgesloten en injecteer langzaam ~ 1 ml DPBS, 1% FBS aan de longen te blazen. Observeer long inflatie door het gat gesneden in stap 2.4.
   2. Wees voorzichtig dat u de longen Blaas.
   3. Draai de hendel op de kraan zodat de volledige spuit is gesloten, en voorzichtig trekken de griep id uit de longen.
   4. Let op de longen leeglopen door het gat gesneden in stap 1.4. De katheter kan nodig zijn om iets vooruit of achteruit worden verplaatst naar een goede draw te krijgen. Neem speciale voorzorgsmaatregelen om de katheter in de luchtpijp te houden.
   5. Herhaal stappen 2.8.1-2.8.4 5-6x totdat alle DPBS, 1% FBS werd geïnjecteerd en naar de longen onttrokken. Opmerking: herstel van longvocht zal niet 100% van de geïnjecteerde vloeistof.
9. Lege spuit met spoelvloeistof in een 50 ml conische buis. Laat cellen bij kamertemperatuur.
10. Pellet cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur en giet supernatant. Dit kan worden opgeslagen voor cytokine analyse indien gewenst.
11. Resuspendeer cellen in 1-5 ml RPMI 1640 met 10% FBS en te tellen op een hemocytometer. In de gestimuleerde muis,> 95% van de cellen geoogst door BAL verwachting macrofagen, die kan worden bevestigd door cytologie zijn.

3. Kweken en oogsten Fungus

"> De Aspergillus fumigatus in dit protocol gebruikte uitdrukking GFP in alle stadia van de levenscyclus:. Sporen, germlings en ​​hyfen Deze schimmel stam werd verzorgd door dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada.

1. Plaat conidia van een Aspergillus fumigatus stam die GFP op Sabouraud hersenen hart infusie (BHI) agarslants met chlooramfenicol (0,05 g / L) en Gentamicine (0,5 g / l).
2. Incubeer in het donker losjes afgedekt gedurende 7 tot 10 dagen bij kamertemperatuur geroerd.
3. Oogst conidia door wassen inslag met 10 ml 0,01% Tween 20 in DPBS. Licht schrapen de schimmel met de stripette los te maken. Spoel de schuine meerdere malen om de opbrengst te verhogen.
4. Ga conidiale suspensie door een 100 urn zeef cel in een 50 ml conische.
5. Pellet conidia door centrifugeren bij 400 g gedurende 10 minuten.
6. Hersuspenderen conidia in 50 ml DPBS en te tellen met behulp van een hemocytometer.
7. Twee keer wassen met DPBS en vul aan tot de gewenste concentratietratie.

4. Schimmel Challenge en confocale microscopie

Om de rol van macrofagen NADPH oxidase in afweer onderzoeken het vermogen van geïsoleerde alveolaire macrofagen van muizen drie genotypen om de groei van Aspergillus sporen gefagocyteerd controle geëvalueerd. De genotypen in deze studie omvatten; 1) wild-type muizen, 2) Ncf1 * / * Mn-muizen met een natuurlijk voorkomende mutatie Ncf1 (Ncf1 codeert voor p47 ^phOx een vereist bestanddeel van de fagocyt NADPH oxidase) waardoor ze NADPH-oxidase deficiëntie, en 3) Ncf1 * / * Mn + transgene muizen (MN duidt het transgen huisvesten wildtype Ncf1 onder controle van de menselijke CD68-promoter) wanneer NADPH-oxidase activiteit is opgelost in de monocyt / macrofaag populatie ^{10, 11.}

Confocale microscopie is het meest geschikt voor deze test door de aanwezigheiden groei van niet-gefagocyteerde conidia op de glijbaan. De confocale microscoop zal voor visualisatie van afzonderlijke niveaus in de Z-as en staat onderscheid tussen schimmel groeit rond plaats binnen macrofagen. Alle confocale beelden worden verkregen met behulp van een 63x olie-immersie lens. Z-stacks worden verworven met een elektronische zoomfactor van 2,5. De dikte van een Z-stack wordt bepaald met DAPI en helderveld beelden naar de bovenkant en onderkant van het veld te vinden. Z-stacks varieerde 14-24 urn met afzonderlijke segmenten ~ 1 urn dik. Voor de kwantificering van macrofagen, werden enkele scans van 1X elektronische zoom uitgevoerd op 10 velden per genotype. Intact macrofagen werden geïdentificeerd op basis van respectievelijk PKH26 en DAPI kleuring van het membraan en de kern. Conidia werden geïdentificeerd op basis van beelden helder veld FITC expressie en.

1. Bereid steriele dekglaasjes en platen
   1. Onder een biologische veiligheid kabinet, geniet 22 x 22 mm dekglaasjes in 70% ethanol voor 5-10 minuten.
   2. Spoel dekglaasjes in steriele PBS.
   3. Met steriele pincet, plaats voorzichtig een dekglaasje op de bodem van elk putje van een steriele afzonderlijk verpakt 6-wells plaat.
2. Zaad ~ 1 x 10 ⁶ geoogst PKH26 gelabeld alveolaire macrofagen gesuspendeerd in 300 ul RPMI 1640, 10% FBS op elke dekglaasje. Het exacte aantal kan variëren naargelang de oogstopbrengst.
3. Laat macrofaag te houden door incubatie bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende de nacht.
4. De volgende morgen, voeg ~ 1 x 10 ^7-GFP expressie A. fumigatus conidia gesuspendeerd in 100 pl voorverwarmde (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
5. Terug plaat 37 ° C incubator met 5% _CO2.
6. De cellen moeten minimaal 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C worden vastgesteld Op 3, 7 en 14 uur fix cellen door toevoeging van een gelijk volume 2% formaldehyde aan elk putje (eindconcentratie 1% formaldehyde). Plaats platen voor devroege tijdstippen bij 4 ° C gedurende de nacht. Voor het laatste tijdstip (14 uur), vast cellen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
7. Na fixatie, verwijder voorzichtig dekglaasjes behulp van een tang en spoel in DPBS.
8. Overtollige vloeistof door het plaatsen van de rand van het dekglaasje op een gevouwen Kimwipe.
9. Solliciteer 6 pl fluorescentie montage medium met DAPI een microscoopglaasje.
10. Leg een rand van het dekglaasje op de dia en voorzichtig druppel met cel naar beneden in het fixeermiddel. Montage medium zal verspreiden en vormen een gelijkmatige laag onder het dekglaasje. Er is geen noodzaak om druk op het dekglaasje.
11. Seal randen van dekglaasje met duidelijke nagellak en laat aan de lucht drogen.
12. Archief bereid dia's in een dia box (beschermd tegen licht) bij kamertemperatuur totdat klaar om te analyseren door confocale microscopie.

Resultaten

Verzamelen alveolaire macrofaag door BAL van gestimuleerde muizen zal resulteren in een> 95% zuivere populatie op basis van cytologie. De 3 en 7 uur (figuur 2) tijdstippen vooraf aan de hyfen stadium van schimmelgroei en maken een vergelijking van fagocytische efficiëntie van conidia tussen genotypen. De 14 uur tijdstip is waar genotypen vergelijkbaar wat betreft de mogelijkheid om de overgang van gefagociteerde conidia de weefsel-invasieve hyfen fase (figuur 3) remmen. Intact ...

Discussie

Met deze aanpak voor ex vivo analyse van de antifungale activiteit van macrofagen met in vivo schimmel uitdaging we eerder aangetoond dat NADPH oxidase in macrofagen een belangrijke rol in de verdediging tegen A. speelt fumigatus ^4. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen kunnen wij concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijvoorbeeld geworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit voor algemene celmembraanlabeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Gebruikt om AvertinAnesthetic te maken
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Gebruikt om AvertinAnesthetic te maken
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (zonder calcium en magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Gebruikt om ACK red cell lysis buffer te maken
KHCO3	Sigma	P91444	Gebruikt om ACK red cell lysis buffer te maken
EDTA	Sigma	E6758	Gebruikt om ACK red cell lysis buffer te maken
22 G x 1.00 inch i.v. katheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insuline spuiten
6 ml Spuiten
4-weg stopkraan	Fisher Scientific	50-700-077
Hechtdraad
50 ml kegelvormige centrifugeerbuizen
Gaasjesponsjes (4 inch vierkant)
RPMI 1640 met L-glutamine	Corning	10-040-CV
Foetaal runderserum	Hyclone	SH30396.03	hitte-geïnactiveerd
Hema 3 Kleurstelling	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Hersenhartinfusie Agar met Chlooramfenicol en Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous stam die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengt			aangeboden door Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Celzeevers	BD Falcon	64753-00
Schaar
Pincet
Biologische Veiligheidskast Klasse II
Sorval ST40 Centrifuge met draaiende emmer rotor
Leica DM1000 lichtmicroscoop
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Celcultuur incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro dekglaas	VWR	48366-227	glasdekjes
6-well celcultuur platen	Corning	3506
10% Neutraal Gebufferd Formaline	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield montagemedium met DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 systeem met een laserpuntscanner			Gemonteerd op DMIRE2 fluorescentiemicroscoop