Methodenartikel

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

39.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51682

⸱

6 september 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is <30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Samenvatting

Eerder beschreven mitochondriale isolatiemethoden middels differentiële centrifugatie en / of Ficoll gradiënt centrifugatie vereisen 60 tot 100 minuten in beslag. We beschrijven een werkwijze voor de snelle isolatie van mitochondria van zoogdieren biopten met een commercieel tissue Dissociator en differentiële filtratie. In dit protocol wordt manueel homogenisering vervangen door gestandaardiseerde homogenisering cyclus het weefsel Dissociator's. Dit zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. Na weefsel dissociatie, wordt het homogenaat gefilterd door nylon mesh filters, die repetitieve centrifugeren stappen te elimineren. Hierdoor kan mitochondriale isolatie worden uitgevoerd in minder dan 30 minuten. Deze isolatie protocol levert ongeveer 2 x 10 10 levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria van 0,18 ± 0,04 g (nat gewicht) weefselmonster.

Inleiding

Mitochondriën bestaan ​​in elke cel in het lichaam behalve rode bloedcellen en zijn betrokken bij een groot aantal belangrijke cellulaire en metabole processen 1-4. Door deze vele functies kunnen mitochondriale schade nadelige gevolgen 3 hebben. Om mitochondriale functie en dysfunctie verschillende mitochondriale isolatiemethoden onderzoeken zijn beschreven. De vroegste gepubliceerde rekeningen van mitochondriale isolatie datum om de jaren 1940 5-8. De eerste gedocumenteerde poging aangetoond mitochondriale isolatie door malen leverweefsel in een mortier gevolgd door centrifugatie in een zoutoplossing bij lage snelheid 5,8. Later, andere groepen uitgebreid op de oorspronkelijke procedure en gedemonstreerd weefsel fractionering op basis van differentiële centrifugatie 6-8. Deze vroege methoden vormde de basis van de huidige technieken die vaak nemen homogenisering, en / of differentieel centrifugeren 9-15. Het aantal homogenizatiop en centrifugatiestappen varieert tussen protocollen. Deze repetitieve stappen verhogen de tijd voor mitochondriële isolatie en uiteindelijk levensvatbaarheid verminderen. Daarnaast kunnen handmatige homogenisering mitochondriale schade en inconsistente resultaten veroorzaken als ze niet goed gecontroleerd 10,16.

Onlangs, gebruikten we homogenisering en differentiële centrifugatie om mitochondriën voor transplantatie te isoleren in hartspierweefsel 17,18. Deze langdurige isolatie procedure vereist ongeveer 90 min en de klinische toepasbaarheid van deze methode was dus beperkt. Met het oog op acute therapeutisch gebruik in klinische en chirurgische behandeling hebben we een snelle mitochondriale isolatieprocedure die in minder dan 30 min kan worden uitgevoerd ontwikkeld.

De belangrijkste voordelen van dit protocol is dat gestandaardiseerde weefsel dissociatie zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. In addition, het gebruik van differentiële filtratie in plaats van differentiële centrifugatie elimineert tijdrovend en repetitief centrifugatiestappen waardoor meer snelle isolatie van zeer gezuiverd, levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria.

Het vermogen om levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria isoleren in minder dan 30 minuten maakt klinische toepasbaarheid. Deze isolatie protocol heeft potentieel voor gebruik in een coronaire bypass operatie chirurgie (CABG) en andere therapeutische procedures.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voorbereiding

  1. Bereid 1 M K-HEPES Stock Solution (pas pH op 7,2 met KOH).
  2. Bereid 0,5 M K-EGTA Stock Solution (pas pH op 8,0 met KOH).
  3. Bereid 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution.
  4. Bereid 1 M MgCl2 voorraadoplossing.
  5. Bereid Homogenisatie Buffer (pH 7,2) 300 mM sucrose, 10 mM K-HEPES en 1 mM K-EGTA. Bewaren bij 4 ° C.
  6. Bereid Ademhaling buffer 250 mM sucrose, 2 mM KH 2PO 4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES Buffer (pH 7,2) en 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Bewaren bij 4 ° C.
  7. Bereid 10x PBS voorraadoplossing door oplossen 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 en 2,4 g KH 2PO 4 tot 1 L tweemaal gedestilleerd H2 O (pH 7.4).
  8. Bereid 1x PBS pipetteren 100 ml 10x PBS tot 1 L tweemaal gedestilleerd H2O
  9. Bereid Subtilisine Een Stock door weging van 4 mg Subtilisine A ineen 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
  10. Bereid BSA De door weging uit 20 mg BSA in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.

Mitochondriale Isolatie (figuur 1)

  1. Onmiddellijk voorafgaand aan isolatie lossen Subtilisine A in 1 ml buffer Homogeniseren.
  2. Onmiddellijk voorafgaand aan isolatie, BSA opgelost in 1 ml buffer Homogeniseren.
  3. Verzamel twee verse weefselmonsters met een 6 mm biopsie punch en op te slaan in 1x PBS in een 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  4. Breng de twee 6 mm stempels weefsel een dissociatie C buis met 5 ml ijskoude buffer Homogeniseren.
  5. Homogeniseer het weefsel door het aanbrengen van de dissociatie C buis op het weefsel Dissociator en selecteer de ingestelde mitochondriale isolatie cyclus (60 seconden homogeniseren).
  6. Verwijder de dissociatie C buis om een ​​ijsemmer.
  7. Voeg 250 ul van Subtilisine Een voorraad oplossing voor dehomogenaat, meng door omkeren en incubeer de homogenaat op ijs gedurende 10 minuten.
  8. Plaats een 40 um mesh filter op een 50 ml conische centrifugebuis op ijs en pre-natte het filter met homogenisatie Buffer en filteren het homogenaat in de 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  9. Voeg 250 ul van vers bereide BSA Stock Solution aan het filtraat en meng door omkeren.
    Opmerking: Sla deze stap over als mitochondriaal eiwit bepaling nodig is.
  10. Plaats een 40 um filter op een 50 ml conische centrifugebuis op ijs en pre-natte het filter met homogenisatie Buffer en filteren het homogenaat in de 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  11. Plaats een 10 um filter op een 50 ml conische centrifugebuis op ijs en pre-natte het filter met homogenisatie Buffer en filteren het homogenaat in de 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  12. Breng het filtraat twee voorgekoelde 1,5 ml microfuge buizen en centrifugeer bij 9000 xg gedurende 10 minuten bij4 º C.
  13. Verwijder supernatant en opnieuw op te schorten en te combineren pellets in 1 ml ijskoude Ademhaling Buffer.

ATP Assay

Opmerking: Om de metabole activiteit van geïsoleerde mitochondria een ATP-luminescentie test kan worden uitgevoerd met behulp van een ATP testkit bepalen. Het protocol, reagentia en standaarden werden geleverd in de testkit. Een samenvatting van de procedure wordt hieronder beschreven.

  1. Equilibreer kitreagentia tot kamertemperatuur.
  2. Bereid 10 mM ATP voorraadoplossing door de oplossing gelyofiliseerd ATP pellet in 1170 ui dubbel gedestilleerd water. Slaan ATP standaard Stock Solution en bereid mitochondriale monsters op ijs.
  3. Voeg 5 ml Substraat Bufferoplossing een flesje met gevriesdroogd substraatoplossing. Meng voorzichtig en plaats in het donker.
  4. Voeg 100 ul van buffer Ademhaling alle putjes van een zwarte, ondoorzichtige bodem, 96 wells plaat.
  5. Voeg 10 ul van mitochondria van de bereide monsters in elk putje ofa zwart, ondoorzichtige bodem, 96 wells plaat. Opmerking: De monsters worden in drievoud uitgeplaat. Omvatten een rij voor normen en drie putten voor de negatieve controle (Ademhaling Buffer).
  6. Voeg 50 ul van zoogdiercellen lysisoplossing alle putjes, inclusief standaarden en controles.
  7. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5 min op een orbitale schudder bij 125 rpm.
  8. Tijdens de incubatie bereiden ATP normen in concentraties van 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM en 0,0001 mM ATP van 10 mM ATP voorraadoplossing. Store normen op het ijs.
  9. Na de incubatie, voeg 10 pl ATP normen overeenkomstige putjes zoals aangegeven op de plaat kaart. Opmerking: Normen worden in duplo uitgevoerd.
  10. Voeg 50 ul van de bereide substraatoplossing aan elke well.
  11. Incubeer de plaat bij 37 ° C op de orbitale schudder gedurende 5 minuten bij 125 rpm.
  12. Open Gen5 1.11 software op een computer die verbonden zijn met de spectrofotometer.
  13. Onder "Create a New Item ", klik op" Experiment ".
  14. Klik op "Default Protocol". Klik op "Ok".
  15. In de linker kolom, selecteert u "Protocol", dan "Procedure".
  16. Selecteer "Delay". Ingesteld op 00:10:00. Klik op "Ok".
  17. Selecteer "Lees". Selecteer "luminescentie" van drop-down menu. Pas de overige instellingen om de volgende: Lees het type Endpoint, Integratie tijd 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Stelt 1, Emissie Hole, Optics Positie Top, Gevoeligheid 100, Top Probe Verticale offset 1,00 mm.
  18. Als de plaat klaar is om te worden geanalyseerd, klikt u op het pictogram "Lees Plate" op de bovenste rij. Klik op "Read". Als de spectrofotometer wordt geopend, plaatst u de plaat in de lade met goed A1 in de linker bovenhoek. Een doos met de temperatuur zal openen. Klik op "Read". Opmerking: Hogere waarden correleren met een verhoogde ATP-niveaus en een hogere metabolische activiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een figuur waarin de procedurele stappen in de isolatie van mitochondriën met weefsel dissociatie en differentiële filtratie wordt getoond in figuur 1. Totale procedure is minder dan 30 minuten.

Weefsel monsters werden verkregen met een 6 mm punch biopsie. Tissue gewicht bedroeg 0,18 ± 0,04 g (nat gewicht). Het aantal mitochondria geïsoleerd zoals bepaald door deeltjesgrootte telling bedroeg 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitochondria voor skeletspieren en 2...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met succes isoleren mitochondria met dit protocol is het essentieel om alle oplossingen en weefselmonsters op ijs houden mitochondriale levensvatbaarheid behouden. Zelfs wanneer op ijs wordt geïsoleerde mitochondria een afname van functionele activiteit vertonen in de tijd 19. We raden aan dat alle oplossingen en aanvullingen vooraf worden voorbereid. We vooraf wegen en te bewaren Subtilisine A in 4 mg aliquots in 1,5 ml microfuge buizen en opgeslagen bij -20 ° C. Evenzo BSA is pre-gewogen en opgeslagen in al...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de huidige institutionele richtlijnen. We hebben geen concurrerende financiële belangen bekend te maken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL 103542, en de BCH Anesthesia Research Foundation Distinguished Trailblazer Award voor CAP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SucroseSigma Aldrich84100
HEPESSigma AldrichH4034
EGTASigma AldrichE4378
Substilsin ASigma AldrichP5380
BSASigma AldrichA7906
KH2PO4Sigma AldrichP5379
MgCl2Sigma AldrichM8266
NaClSigma AldrichS6191
KClFisher ScientificP2173
Na2HPO4Fisher ScientificS374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit		Perkin Elmer6016941
50 ml Conical TubesBD352098
40 μm Nylon FiltersBD 352340
GentleMACS C tubeMiltenyl Biotech120-005-331
1.5 ml Eppendorf tubeFisher Scientific05-408-129
6 mm biopsy punchMiltex33-36
10 μm PluristrainerPluriselect43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415CMarshall ScientificEP-5415C 
GentleMACS Dissociator Miltenyl Biotech130-093-235
96-well plates, tissue culture treatedVWR82050-732
Rotomax 120 orbital shakerHeidolph544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader		BioTek
Multisizer 4 Coulter CounterBeckman CoulterA63076
Oxytherm SystemHansatech Instruments
HemacytometerFisher Scientific267110

Referenties

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317(2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Trefwoorden

Isolatie van mitochondri nzuivering van mitochondri nrespiratie competente mitochondri nATP luminescentie assayweefselhomogenisatiemitochondri le opbrengstmitochondri le levensvatbaarheidanalyse van de mitochondri le respiratie

Gerelateerde artikelen