Microdissectie is uitgebreid toegepast voor de behandeling van DNA, RNA en eiwitten in weefsel. Laser capture microscopie (LCM) is de meest gebruikte methode, maar een nieuwe frees-techniek, mesodissection, is sinds kort beschikbaar. We tonen RNA extractie uit mesodissected formaline gefixeerd paraffine-ingebed weefsel slides van Mycobacterium tuberculosis granulomen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Microdissectie is gebruikt voor de behandeling van weefsels aan DNA, RNA en eiwit meer dan tien jaar. Laser capture microscopie (LCM) is de meest voorkomende microdissection techniek die tegenwoordig worden gebruikt. In deze techniek wordt een laser gebruikt om een thermoplastisch membraan dat een gedehydrateerde weefselsectie 1 ligt over focaal smelten. De weefselsectie composiet wordt vervolgens opgetild en gescheiden van het membraan. Hoewel deze techniek met succes kan worden gebruikt voor weefselonderzoek, is tijdrovend en duur. Bovendien is de succesvolle voltooiing van de procedures die deze techniek vereist het gebruik van een laser, waardoor het gebruik ervan beperkt. Een nieuwe, meer betaalbare en praktische microdissection aanpak genoemd mesodissection is een mogelijke oplossing voor de valkuilen van LCM. Deze techniek maakt gebruik van de MESO-1/MeSectr systeem om de molen van de gewenste weefsel van een dia gemonteerd weefselmonster terwijl tegelijkertijd de verstrekking en het opzuigen van vloeistof naar de gewenste weefsel monster in herstelleneen verbruiksartikel molen beetje. Voordat de dissectie proces begint, de gebruiker lijnt de formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) schuiven met een hematoxyline en eosine gekleurde (H & E) verwijzing glijbaan. Daarna, de exploitant annoteert de gewenste dissectie gebied en overgaat tot het passende segment ontleden. Het programma genereert een gearchiveerd beeld van de dissectie. Het belangrijkste voordeel van mesodissection is de korte duur die nodig is om een dia te ontleden, met een gemiddelde van tien minuten van het opzetten op generatie proeven in dit experiment. Bovendien is het systeem significant meer kosteneffectief en gebruiksvriendelijk. Een klein nadeel is dat het niet zo precies laser capture microscopie. In dit artikel laten we zien hoe mesodissection kunnen worden gebruikt om RNA te extraheren uit dia uit FFPE granulomen veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Inleiding
Monsters zijn traditioneel handmatig gemicrodissecteerde van zowel hele weefsel of dia's met behulp van een naald en scalpel. Daartoe is een duidelijke scheiding tussen het gedeelte weefsel van belang en de omliggende weefsels in paragraaf 2. Met de huidige vooruitgang in de moleculaire profilering technologie, is er een toenemende behoefte om weefsel te beoordelen op cellulair niveau. Door de beperkingen van de handleiding microdissectie werden technieken, waaronder LCM vastgesteld grotere isolatie precisie mogelijk. Deze techniek kan de onderzoeker bepaalde celpopulaties uit verschillende cellen en schuif soorten, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse testen zoals genexpressie profilering isoleren. Hoewel zeer effectief voor stroomafwaartse testen, LCM is niet zonder beperkingen. Eerst LCM is een duur en tijdrovend proces. Bovendien, vanwege de instabiele aard van RNA, is het vaak uitdagend om hoge kwaliteit te verkrijgen van RNA LCM monsters 2. Door het disadvantages van LCM, zijn nieuwe ontwikkelingen in microdissection technologie nog steeds nodig om het meer toegankelijk voor een groter aantal onderzoekers in een betaalbare en tijd gevoelige manier te maken.
Een van deze vooruitgang in microdissection technologie nu beschikbaar is een techniek die bekend staat als mesodissection. Bij deze techniek wordt een machine wordt gebruikt om de molen van de geannoteerde weefsel sectie van belang en zuigt het in een voor consumptie molen bit 3. Vervolgens kan dit monster worden opgezogen in een verzameling buis en gebruikt voor verdere toepassingen. De voordelen van dit systeem is dat het aanzienlijk goedkoper en tijdgevoelig. In onze ervaring, het systeem maakt het mogelijk de dissectie van een long granuloom weefsel sectie in tien minuten. Aan de andere kant, zou de traditionele LCM waarschijnlijk uren nodig om het proces te voltooien. Het systeem kan de bestuurder een verwijzing dia laden om te gebruiken als een vergelijking als hulpmiddel voor annotatie. Bovendien is een rapport gegenereerd waarin the gebied van de dia die werd ontleed. Er zijn twee belangrijke nadelen aan mesodissection. Hoewel effectief bij het extraheren meerdere cellen, is het moeilijk om een cel te isoleren. Bovendien is de nauwkeurigheid van het beeld dat is gegenereerd is minder duidelijk bij gebruik van andere imaging microscopen.
Tuberculose (TB) is een belangrijke besmettelijke ziekte moordenaar van de mensheid over de hele wereld en de resultaten van infectie met Mtb. In een meerderheid van de mensen blootgesteld aan aërosolen van Mtb, wordt de infectie latent beperkt. In ten minste 10 miljoen mensen per jaar, het resulteert in actieve tuberculose ziekte 4. Tijdens de latente infectie, wordt Mtb vervat in pathologische longlaesies bekend als granulomen. Daarom is betoogd dat de uitkomst van Mtb infectie wordt besloten op het niveau van het granuloom 5.
Hier laten we zien hoe mesodissection kan worden om granulomen veroorzaakt door Mtb microdissect. De slides gebruiktzijn van FFPE longweefsel van geïnfecteerde rhesus makaken. Ten behoeve van deze demonstratie, zullen we granulomen ontleden in hun geheel. We tonen ook dat RNA van het teruggewonnen weefsel kan worden geëxtraheerd. Deze techniek kan worden toegepast op weefselmonsters van diverse andere monsters en vervolgens gebruikt voor verschillende stroomafwaartse testen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Kalibreren Mesodissection Instrument met 2id Imaging Software
De 2id imaging software zal worden aangeduid als de software of het programma voor de rest van dit artikel. Deze stap is nodig te kunnen volgen het beeld en sluiten meerdere diaraampjes.
- Schakel instrument en de computer.
- Open software en selecteer "kalibreren instrument".
- Kalibreren reizen stadium met behulp van de joystick. Verplaats etappe naar linksboven positie. Druk op "set" in stap 1 in het programma.
- Verplaats podium om juiste positie te verlagen. Druk op "set" bij stap 2 in het programma.
- Kalibreren aspiratie door "Z-knop" eerst op het hoofd assemblage verhogen. Druk op "aspireren pulse" knop en "dissectie" knop op de joystick totdat plunjer stuurstang toppositie bereikt. Druk op "set" in stap 3 van het programma.
- Druk op "aspireren reset &# 8221; knop. Zodra de zuiger stopt aan de onderzijde de druk op "set" in stap 4.
- Klik op het tabblad "schaal".
- Plaats kalibratie liniaal op blanco zijde.
- Focus microscoop indien nodig.
- Teken lijn tussen de twee schaalbalken behulp van de muis.
- Voer afstand in vakje met stap 2 Druk op "compute" knop..
- Klik op het tabblad "crosshair". Draai motorsnelheid tot 1.
- Steek xScisor in het hoofd assemblage. Lagere hoofd assemblage in z-as gereed positie door te drukken "z-as" knop. OPMERKING: Het hoofd assemblage is de grote structuur aan de top van de dissectie instrument. De xScisor zal worden aangeduid als een verbruiksartikel molen beetje voor de rest van dit artikel.
- Klik op "dissectie gaan" knop op de joystick. OPMERKING: Deze knop bevindt zich aan de bovenzijde van de joystick.
- Definieer draaipunt visueel. Om dit te doen, bewegen centrum van crosshair dan draaipunt gebruik definiërend parameter in stap 1 van het programma. Gebruik de pijlen omhoog en omlaag in de "x" en "y-as" bars om de pixels aan te passen aan crosshair te lijnen. Klik op de "done" tabblad.
- Klik op het pictogram "thuis". OPMERKING: Dit wordt weergegeven beeld Het huis ligt in de rechterbovenhoek een door.
2. Maak Referentiebeeld
- Plaats H & E dia op het podium. Plaats ondoorzichtig deksel op de top van dia. Rijd het instrument door de joystick naar het gewenste gebied van de H & E slide. Sla de afbeelding gegenereerd. OPMERKING: Ofwel de tab "capture reference" of tabblad "ontleden" kan worden gebruikt om deze stap te voltooien.
3. Lijn Tissue voor Dissection
- Klik op de "ontleden weefsel" optie op het beginscherm.
- Vul de "exploitant", "dissectie toetreding nummer," "referentie toetreding nummer," "xScisor barcodenummer," & #8220; dissectie vloeistof lotnummer, "" xScisor size "en" description "in het tabblad" setup ".
- Klik op de "vind weefsel" tabblad.
- Import referentiebeeld eerder opgeslagen.
- Plaats een ongekleurde FFPE dia van 5 micron dikte op het podium. Verplaats etappe naar hetzelfde gebied als waar afgeschilderd in het referentiebeeld. Klik op het tabblad "Afbeelding invoegen".
- Klik op het tabblad "align". Gebruik de muis en de bijbehorende pijlen op de foto om de verwijzing aan te passen aan de ongekleurde afbeelding.
4. Commenteren Slide
- Klik op het tabblad "annoteren".
- Gebruik de muis om een cirkel rond het gewenste gebied van de dia die wordt gemicrodissecteerde trekken.
5. Laad verbruiksartikelen Mill Bit
- Vul verbruiksartikelen molen beetje met de gewenste buffer, hier PKD buffer, door op en neer trekken van de zuiger in een vloeiende beweging meerdere malen. Zorg ervoor dat de lucht uit te sluitenbubbels.
- Raise Z-as door te drukken "Z-as button".
- Laad verbruiksartikelen molen beetje in de machine. Doe dit door in de bovenkant van de machine schuiven van de verbruiksgoederen molen beetje zodat de witte lijn op het instrument lijn staat met de zwarte lijn op de verbruiksartikelen molen bit. Druk op "aspiratie reset" knop om de plunjer te worden neergelaten in de juiste positie. OPMERKING: Het moet gemakkelijk zijn om de verbruiksartikelen molen beetje schuiven. Als het niet, zorg ervoor dat de inkepingen correct zijn uitgelijnd.
- Lagere Z-as door opnieuw op "Z-as" knop.
6. Ontleden weefsel (figuur 4)
- Open het tabblad "ontleden".
- Draai de motor en aspiratie snelheden tot 1.
- Selectievakje "toon volgen". Opmerking: Hierdoor kan de gebruiker de ontleed gebied visualiseren tijdens de dissectie proces.
- Eenmaal klaar om te ontleden, blijven vasthouden "nemen" knop evenals "aspireren & #8221; ingedrukt terwijl u de joystick tegen de klok in om weefsel te ontleden.
- Blijven ontleden tegen de klok in totdat de verzamelbak is "vol" tab rood.
7. Leeg en verwijder verbruiksartikelen Mill Bit
- Plaats een 0,5 pi microfugebuis onder de punt van de verbruiksgoederen molen bit.
- Druk op "aspiratie" stuurstang snel monster uit te werpen in microfugebuis.
- Druk met een verhoogde kracht te werpen gebruikte verbruiksgoederen molen bit.
- Spoel weefsel fragment door te trekken zuiger terug. Druk de zuiger uit naar resterende monster uiten in consumeerbare molen bit. Het weefsel fragment wordt nu opgenomen in de microcentrifugebuis.
8. Lyse Sample met Proteinase K Digestion gevolgd door een warmtebehandeling
- Voeg 70 ul TE pH 8,5 met 5 ug proteinase K te weefselmonster hersteld.
- Plaats monster in programmeerbare verwarming-shaker.
- Volledige ontsluiting met behulp van programmeerbare verwarming-schudder bij de volgende instelling: 60 ˚ C gedurende 30 minuten bij 1500 rpm; 82 ˚ C gedurende 15 minuten bij 1500 rpm; en 25 ˚ C gedurende 1 min bij 450 rpm. Het monster is nu klaar voor verdere toepassingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hiervoor genoemde protocol laat zien hoe een nieuwe mesodissection techniek gebruiken om RNA te extraheren uit FFPE weefsel dia's. Doeltreffendheid Dit protocol is opgenomen door FFPE dia long granulomen van NHP geïnfecteerd met MTB in verschillende infectieuze stadia. Figuren 1-3 zijn beelden van het instrument. 4 toont hoe de dissectie proces plaatsvindt en het resulterende beeld dat is gegenereerd door de software. Tabel 1 toont de resultaten van RNA-...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Mesodissection is een techniek die kan worden toegepast op RNA-extractie uit pathologische laesie dia veroorzaakt door een breed scala van pathogenen. Het is een noodzaak dat de gebruiker het beeld volgt en lijnt de afbeelding correct. Om dit te bereiken, moet het instrument worden gekalibreerd volgens de aanwijzingen op de imaging software. Bij het ontleden, als de glijbaan en interessegebied wordt ontleed niet op een lijn, de gebruiker moet het kalibreren. Een andere belangrijke stap in de dissectie proces is het verb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs beschrijven dat er geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de volgende NIH awards / subawards voor de ondersteuning van dit onderzoek luidt: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, en P51OD011104.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Andere maten beschikbaar | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmeerbare Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extractiekit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Zuiveringskit | Qiagen | 28104 |
Referenties
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
