Methodenartikel

Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

33.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51694

⸱

11 september 2014

1Department of Pediatrics, Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Basistechnieken en verfijningen van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters en nanomaterialen voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie worden beschreven. Deze techniek is een aangewezen methode voor het onthullen ultrastructureel functies en specialisaties van biologische membranen en voor het verkrijgen van Ultrastructureel dimensionale en ruimtelijke gegevens in materials sciences en nanotechnologie producten.

Samenvatting

Freeze-fractuur / vries-ets beschrijft een proces waarbij exemplaren, meestal biologisch of nanomateriaal in de natuur, zijn bevroren, gebroken, en gerepliceerd naar een carbon / platinum "cast" bestemd voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie genereren. Specimens worden onderworpen aan ultrasnelle vriessnelheden, vaak in aanwezigheid van cryoprotectieve middelen voor ijskristalvorming beperken latere breken van het model in vloeibare stikstof gekoelde temperaturen onder hoog vacuüm. De resulterende gebroken oppervlak wordt gerepliceerd en gestabiliseerd door verdamping van koolstof en platina vanuit een hoek die oppervlak verleent driedimensionale detail aan de cast. Deze techniek is bijzonder verhelderend voor het onderzoek van de celmembranen en hun specialisaties bewezen en heeft aanzienlijk bijgedragen aan het begrip van cellulaire vorm aan verwante celfunctie. In dit rapport geven we een overzicht van de eisen instrument en technisch protocol voor het uitvoeren vanbevriezen-breuk, de bijbehorende nomenclatuur en de kenmerken van breukvlakken, variaties op de klassieke procedure en criteria voor de interpretatie van de freeze-fractuur beelden. Deze techniek is op grote schaal gebruikt voor ultrastructurele onderzoek in veel gebieden van de celbiologie en houdt belofte als een opkomende beeldvormende techniek voor moleculaire, nanotechnologie en materiaalkunde studies.

Inleiding

Het concept en de praktische toepassing van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters werd een eeuw geleden geïntroduceerd door Steere 1 meer dan de helft. De vroege apparaat toegeëigend ongelijksoortige onderdelen in een werkende zelfstandige unit 1. De oorspronkelijke inrichting werd aangepast en verfijnd tot commercieel beschikbare instrumenten om de kritische behoefte aan externe manipulatie, het onderhoud van hoog vacuüm tegemoet te komen, en de verdamping van koolstof en metalen om een replica geschikt is voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie (Figuur 1 en Figuur produceren 2).

De typische instrument bestaat uit een hoog vacuümkamer specimens tafel en microtoom arm met regelbare vloeibare stikstof omzet (figuur 1). De kamer beschikt ook over twee elektron geweren, een voor het stabiliseren van koolstof verdamping gepositioneerd op een hoek van 90 graden met het model podium en de andere voor Platinum / carbon schaduw onder een instelbare hoek, meestal 15 ° - 45 ° (figuur 2). Stroom naar het apparaat wordt toegepast op de vacuümpomp werken en elektronische panelen reguleren temperatuurregeling en electron gun control.

Oorspronkelijk opgevat als middel om verbeterde beeldvorming van virussen bereiken, vries-breuk kreeg nog meer populariteit als een techniek voor het onderzoek en analyse van celmembranen en hun specialisaties 2, 3. Inderdaad, deze procedure integraal ophelderen structuur / functie relaties in cellen en weefsels en veel van deze studies passief klassieke bijdragen aan cellulaire en moleculaire biologie 4-9 geweest. Het hoofddoel en redenen voor de ontwikkeling van de freeze-fractuur technisch artefacten waarneembaar elektronenmicroscopische resolutie voortvloeien uit chemische fixatie en verwerking in gebruikelijke biologische elektronenmicroscopie beperken. Hier is het doel om chemische beperkenfixatie en het monster voldoende snel en vaak in de aanwezigheid van een koude beschermend om ijskristalvorming en andere artefacten invriezen beperken bevriezen. Meer recent heeft deze techniek een heropleving van interesse van moleculair biologen en materiaalkunde onderzoekers voor onderzoek van nanodeeltjes en nanomaterialen gevonden.

Freeze-breuk en vries-etch beelden vertonen een driedimensionaal karakter en soms verward scanning electronenmicroscoop. Echter, freeze-fractuur voorbereidingen onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie en hun belangrijke bijdrage aan de hoge resolutie morfologische studies is hun unieke voorstelling van structuur / functie-elementen van de celmembranen. Freeze-breuk verwerking geïnitieerd bevroren cellen en weefsels met voldoende snelheid ijskristallisatie beperken en / of bij gebruik van cryoprotectant middelen zoals glycerol. De monsters worden vervolgens gebroken onder vacuüm en een repLica wordt gegenereerd door verdamping van koolstof en platina via breukvlak. Het originele exemplaar wordt verteerd van de replica die wordt opgehaald op een standaard EM specimen net. Een andere veel voorkomende verkeerde interpretatie van freeze-fractuur beelden is dat ze uitbeelden celoppervlak. Maar het uitgangspunt van freeze-fractuur is dat biologische membranen worden gesplitst door de lipide dubbellaag van de fractuur-proces (figuur 3). Dit proces in biologische membranen levert twee breuk vlakken, een die de organisatie van de helft van het membraan grenzend aan het cytoplasma, de PF-face openbaart, en een die helft van de bimoleculaire bijsluiter van het membraan dat grenst aan het extracellulaire openbaart milieu, de EF-face. True cel oppervlakken zijn niet vertegenwoordigd in freeze-fractuur beelden, maar alleen wanneer de volgende toegevoegde stap van freeze-etsen na de breuk procedure wordt gebruikt. Om effectief te etsen eerder gebroken exemplaren aan de oppervlakte detai onthullenl, moeten de monsters bij een snel tempo en zonder unetchablecryoprotectant worden bevroren. Ets water van het oppervlak van het proefstuk gebroken openbaren onderliggende factoren wordt bewerkstelligd door het zo koelen microtoom arm via specimen stadium creëren van een temperatuurverschil tussen de fase die het specimen en het koelen microtoom arm die water veroorzaakt sublimeren van het oppervlak. Wanneer water wordt gesublimeerd van het oppervlak van het proefstuk gebroken tijdens het bevriezen etsen manoeuvre, dan aspecten daadwerkelijk celoppervlakken, extracellulaire matrix, cytoskeletstructuren en moleculaire assemblages kunnen worden onthuld met hoge resolutie. Aldus bevriezen-breuk en vries-etch zijn niet uitwisselbaar termen maar tijdens een stapsgewijze werkwijze waarbij de laatste niet nodig of wenselijk zijn afhankelijk van de behoeften van de specifieke studie.

Naar aanleiding van de vries-fractuur / vries-ets procedures, het gebroken oppervlakken zijn onderworpen aan gerichte verdampertief lagen van koolstof en platina met het oog op ondersteuning en beeldvorming contrast met de replica te bieden. De platina / koolstof imaging verdamping kan unidirectioneel of roterende en wordt bewerkstelligd door een weerstand of elektronenkanonnen. Unidirectionele shadowing uit een bekende hoek, meestal 30 ° - 45 °, is handig in het uitvoeren van bepaalde morfometrische berekeningen. Monsters die zijn onderworpen aan diepe etsen typisch roterende schaduw en de resulterende afbeeldingen van deze monsters zijn fotografisch teruggedraaid evalueren.

De historische en een doelstelling van de onderhavige freeze-fractuur / vries-etch techniek chemische fixatie en verwerking beperken specimen artefacten die worden geassocieerd met conventionele transmissie elektronenmicroscopie procedures. Deze techniek levert een wezenlijke voordeel in zijn vermogen om driedimensionale detail kennen en dus de verkrijging van morfometrische data in biologisch, materiaalkunde vergemakkelijken en nanotechnology specimens. Freeze-fractuur en vries-ets procedures zijn complex en veelzijdig en sommige aspecten van de toepassing worden aangepast. Deze presentatie biedt een overzicht aanzicht van de belangrijkste kenmerken van de werkwijze en de lezer om de gegevens adres en pas de werkwijze specifieke onderzoekbehoeften uitgebreide gepubliceerde protocollen 10, 11 bedoeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 Voorbereiding van biologische monsters voor Freeze-fractuur / Freeze-etch

  1. Gebruik een conventionele EM fixeermiddel formulering zoals 2% glutaaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 1 uur. primaire fixatie van biologisch weefsel uitvoeren. OPMERKING: Hoewel het wenselijk om een ​​aantal soorten van specimens bevriezen zonder voorafgaande fixatie kunnen zijn, universele bloed overgebrachte ziekteverwekkers voorzorgsmaatregelen mandateren geschikte fixatie waar het specimen bestaat uit menselijk weefsel.
  2. Volgende primaire fixatie, spoel het model in dezelfde buffer aangevuld met 0,2 M sucrose voor niet meer dan 1 uur.
  3. Het analysemonster in een cryobeschermingsoplossing bestaande uit 25% glycerol in 0,1 M fosfaatbuffer voor niet meer dan 1 uur.

2 Invriezen en opslag van monsters in Advance van Freeze-fractuur

  1. Kies goud of koper specimen stompjes van de juiste grootte en vorm van het monster wordt verwerkt (Figuur 4 ).
  2. Met een fijn pincet en / of kleine gauge naalden positie kleine fragmenten van het monster op de top van een metalen monster stub.
    1. Verminder de vloeistofinhoud van het monster tot een kleverige, licht lijm consistentie door afzuigen vloeistof van de rand van de stomp met filtreerpapier.
    2. Voor enkele replica's, gebruik maken van kleine gauge injectienaalden tot een heuvel van het weefsel te maken op de stomp. Voor dubbele replica, omkeren ander stomp en plaats het precies over de stomp en plaats licht op het monster oppervlak creëren van een broodje (figuur 5A). Druk niet op het model uit van tussen de twee stompen.
  3. Vul twee geïsoleerde Dewar vaten met vloeibare stikstof. OPMERKING: De eerste vat bevindt zich een metalen post met een kleine bron die wordt gebruikt om een klein volume vloeibaar propaangas uit de handel verkrijgbare cilinder (figuur 5B). Het tweede schip is een gepartitioneerde opslag / die het vaartuig voor het kortly handhaven bevroren monsters onder vloeibare stikstof.
    1. De cilinder mondstuk gelegen in het propaan goed openen van de cilinder en om gas te laten stromen in de put van het vaartuig waar het vloeibaar. LET OP: LET !! PROPANE explosief is, KAN FREEZING LETSEL BIJ CONTACT EN IS verstikkend. Gebruik propaan alleen in een chemische kap gecertificeerd voor een dergelijk gebruik de zorg ook om vreemde ontstekingsbronnen te voorkomen, gebruik beschermende kleding tegen lage temperaturen, en het behoud van voldoende ventilatie.
    2. Zo snel mogelijk af te halen van het model te monteren met fijne kwaliteit pincet en duik het in het vloeibaar gemaakte gas in het eerste vat gedurende enkele seconden daarna snel over te dragen aan de tweede opslagvat van vloeibare stikstof (figuur 5B).
    3. Zodra de monsters worden bevroren, op te slaan onder vloeibare stikstof totdat klaar om over te dragen aan de freeze-fractuur plant. Breng de stompjes aan een grotere opslag van vloeibare stikstof Dewar container voor uitgebreidopslag desgewenst echter zorg worden afgezien om de stubs ontdooien.

3 Werking van de Freeze-fractuur Instrument en Specimen Processing

  1. Laden exemplaren op de koperen houder en in de kamer
    1. Laad het goud specimen stompjes in een boekje-type double replica exemplaar houder of klem apparaat onder vloeibare stikstof en daar houden totdat klaar om te positioneren in het monster kamer (Figuur 6).
    2. Wanneer de kamer hoog vacuüm (ongeveer 2 x 10 -6 mbar) heeft bereikt en het podium is afgekoeld tot temperatuur van vloeibare stikstof, schakelt u de pomp, ventilatie van de kamer, en de positie van de gemonteerde exemplaar stompjes op het monster tafel zo snel mogelijk .
    3. Zet de pomp, herstellen hoog vacuüm, en het gebruik van elektronische podium en arm temperatuurregeling met het model tafel temperatuur tot -100 ° C en directe vloeibare stikstof om de microtoom arm en bri passenng aan vloeibare stikstof geroerd.
  2. Het breukproces
    1. Bij het bereiken van een hoog vacuüm, een podium temperatuur van -100 ° C en microtoom arm temperatuur van vloeibare stikstof, op afstand te openen dubbele replica monsterhouder daarmee het doorbreken van de exemplaren van het specimen mounts (freeze-fracture_movie1.mov).
    2. In het geval van specimens die voor etsen na breuk, gebruikt een scheermesje gehouden in een klem op de microtoom arm scheren (dwz breuk) het oppervlak van de monsters in plaats van stap 3.2.1 (vries-etch_movie2.mov).
    3. Als de toegevoegde bevriezing etsstap wordt uitgevoerd, plaatst de gekoelde microtoom arm via breukvlakken een tot enkele minuten. LET OP: Deze manoeuvre zal sublimeren (dwz, ets) water van het gebroken oppervlak. Het effect van deze manoeuvre ware celoppervlakken, extracellulaire matrix en / of moleculaire samenstellingen tonen door sublimatie van water, naast fracture gezichten die door de lipide dubbellaag membranen.
  3. Metal shadowing en replica ondersteuning verdamping met behulp van elektronenkanonnen
    1. Activeer de platina / koolstof elektron of weerstand pistool en laat een dunne laag (circa 2 nm) platina / koolstof verdampen via breukvlak van een hoek van 30 ° - 45 °. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 15 - 20 sec.
    2. Activeer de koolstof elektron of resistentie gun als in stap 3.3.1 en damp een dunne laag van koolstof het gebroken preparaatoppervlak rechtstreeks overhead (90 °) steun aan de replica geven. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 15 - 20 sec.
  4. Ophalen van replica's
    1. Na voltooiing van de replicatie shadowing en carbon stabilisatie, schakelt u de vacuümpomp, ventilatie van de kamer, en verwijder het monster de bevestiging uit het instrument.
    2. Met behulp van een paar fijne kwaliteit tang te verwijderen elke gouden exemplaar stomp van de dubbelereplica booklet / klem en laat ontdooien enkele seconden voordat langzaam verlagen van de stub op een wateroppervlak in een spot plaat (figuur 7). OPMERKING: De carbon / platina replica met aanhangend specimen materiaal blijft drijven op het wateroppervlak.
    3. Manoeuvreer de replica's met behulp van een fijne draad lus of een conventionele elektronenmicroscoop koperen rooster waarover fijne rang pincet en overdracht naar een andere spot plaat die 5% natriumdichromaat in 50% zwavelzuur gedurende een tot verscheidene uren. OPMERKING: Dit bad verteert de werkelijke biologische specimen materiaal van de replica. Volle sterkte bleekmiddel kan worden vervangen door het dichromaat / zwavelzuur oplossing.
    4. Wanneer de spijsvertering is voltooid, de overdracht van de replica terug naar een schoon wateroppervlak en op te halen op een standaard koperen elektronenmicroscopie raster. (NB: Replica's kunnen uiteenvallen in kleinere stukken tijdens de spijsvertering, maar zelfs zeer kleine replica's kan een aanzienlijke hoeveelheid informatie bevatten en moet r zijnieved en onderzocht.) winkel replica ondersteunen van roosters in de handel verkrijgbare rooster dozen, waar ze al jaren met voorzichtige behandeling stabiel zal blijven.

4 Ultrastructurele Onderzoek van Freeze-fractuur / etch Replica

  1. Bekijk replica's in een transmissie-elektronenmicroscoop in versneld spanning meestal 50-80 kV.
  2. Noteer relevante beelden op standaard TEM film of met een hoge resolutie digitale camera.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het belangrijkste uitgangspunt van freeze-fractuur afbeelding interpretatie is dat breukvlakken passeren de lipide dubbellaag membranen verlenen twee fractuur gezichten, riep volgens afspraak de PF-face (plasma fractuur-face) en EF-face (extracellulaire fractuur-face) (Figuur 3). De PF-face is helft van de membraan lipide dubbellaag grenzend aan het cytoplasma van de cel en de EF-gezicht helft van de membraan lipide dubbellaag naast het extracellulaire milieu. De vries-breuk techniek is bijzonder bruikb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de jaren na de invoering ervan en de commerciële beschikbaarheid, freeze-fractuur / etch procedures werden op grote schaal gebruikt voor het onderzoeken van de biologische membraan structuur. Inderdaad, de beste perspectieven van een aantal van de structurele specialisaties van membranen is verkregen in freeze-fractuur / etch voorbereidingen. Deze studies niet alleen bijdragen tot begrip van de structurele organisatie van de membranen maar ook ontvangen inzichten in structuur en functie zijn verbonden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze presentatie werd ondersteund door een Clinical Innovator Award aan JLC van het Flight Attendant Medical Research Institute en door de United States Environmental Protection Agency. Hoewel het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven geheel of gedeeltelijk is gefinancierd door de United States Environmental Protection Agency via een samenwerkingsovereenkomst CR83346301 met het Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill, is het niet onderworpen aan de vereiste collegiale en beleidsbeoordeling van de Agency en weerspiegelt daarom niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de Agency en er mag geen officieel goedkeuringsverklaring worden afgeleid. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plantBalzersBAF400T
Standaard buffersdiverse leveranciers
Standaard aldehyde fixatiemiddelendiverse leveranciers
Natriumdichromaatdiverse leveranciers
Zwavelzuurdiverse leveranciers
Weggebruiksartikelen voor Platinum/Carbon verdampingTechnotrade International
Vloeibare stikstofdiverse leveranciers
Propaandiverse leveranciers
Weggebruiksartikelen voor elektronenmicroscopieElectron Microscopy Sciences
Transmissie-elektronenmicroscoopCarl Zeiss Inc.

Referenties

  1. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
  2. Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
  3. Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
  4. Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
  5. Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
  6. Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
  7. Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
  8. Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
  9. Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
  10. Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
  11. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
  12. Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
  13. Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
  14. Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
  15. Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
  16. Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
  17. Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
  18. Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
  19. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
  20. Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
  21. Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
  22. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  23. Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
  24. Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
  25. Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
  26. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
  27. Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
  28. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
  29. Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
  30. Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
  31. Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
  32. Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
  33. Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Monsterpreparatieultrasnelle vriestechniekvloeibare stikstofkoolstof platina replicatietransmissie elektronenmicroscopiecelmembranenmoleculaire arrays

Gerelateerde artikelen