Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit Trichoderma reesei In tabaksplanten

Samenvatting

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Samenvatting

Cellulose afbrekende enzymen, cellulasen, zijn doelwit van zowel onderzoek en industriële belangen. Het overwicht van deze enzymen op moeilijk-cultuur organismen, zoals hyfen opbouw schimmels en anaërobe bacteriën is bespoedigd het gebruik van recombinante technologieën op dit gebied. Plant expressiewerkwijzen zijn gewenst voor grootschalige productie van enzymen en andere industrieel bruikbare eiwitten. Hierin werkwijzen voor de transiënte expressie van een endoglucanase schimmel, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum worden gedemonstreerd. Succesvolle eiwitexpressie blijkt, gecontroleerd door fluorescentie met een mCherry-enzym fusieproteïne. Bovendien, een aantal standaard tests worden gebruikt om de activiteit van tijdelijk tot expressie T. onderzocht reesei Cel5A, waaronder SDS-PAGE, Western blotting, zymografie, evenals fluorescentie en kleurstoffen gebaseerde substraat degradatie assays. Het hier beschreven systeem kan worden gebruikt om een ​​actieve cel producerenUlase in een korte tijdsperiode, om het potentieel voor verdere productie in planten te evalueren door constitutieve of induceerbare expressiesystemen.

Inleiding

Afbraak van lignocellulose biomassa en het aanmaken van vloeibare brandstof is voorgesteld als een methode om afhankelijkheid van fossiele brandstoffen. Een belangrijke hindernis bij het ​​vaststellen economisch haalbare biomassa-systemen in de enzymatische afbraak van cellulose en hemicellulose ^1. Plant expressiesystemen enorme mogelijkheden voor de productie van enzymen op industriële schaal. Landbouwsystemen te oogsten planten economisch als in volume zijn al gevestigd, zoals ze al duizenden jaren zijn geweest. De productie van cellulasen in planten gewenst door factoren zoals het gemak van autohydrolysis ^2, en de mogelijkheden voor maximalisering van het gebruik van lagere enzym niveaus door het verhogen van de verteerbaarheid van plantaardige celwanden ^1. Tot slot, plantaardige systemen maken het mogelijk de targeting van recombinante eiwitten naar specifieke gebieden van plantencellen en zijn in staat om enzymen waar vereist ³ posttranslationeel wijzigen.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (tabak) wordt zeer vaak gebruikt als modelorganisme voor heterologe eiwitexpressie studies in planten, vanwege de snelle groei en biomassa accumulatie functies ^4. Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten is een techniek die eiwitproductie mogelijk maakt in korte perioden ^5, met behoud van flexibiliteit om de lokalisatie en dus posttranslationele modificaties van de geselecteerde eiwitten, namelijk cellulasen. Dit maakt de productie van de cellulase (s) voor basis-analyse, terwijl ook de basis te leggen voor verdere expressie strategieën in planten. Met dergelijke transiënte expressie strategie is een endoglucanase van glycosyl hydrolase familie 5, Cel5A, afgeleid van de schimmelgastheer Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ geproduceerd (hierna TrCel5A). TrCel5A is een 42 kDa eiwit dat natief geglycosyleerd en is zeer actief in hydroylzing celluloseketens ^7.

De tijdelijke expressie techniek die hier beschreven is gebaseerd op relatief gebruikte systeem, infiltreren de bladeren met Agrobacterium die het gen van belang in een geschikte expressievector. Te zorgen voor een snelle analyse van succesvolle in planta expressie, kan TrCel5A ook worden uitgedrukt als een fusie-eiwit met mCherry, een monomeer fluorescerend eiwit oorspronkelijk afkomstig van Discosoma sp. Eiwit DsRed ^8, met een extra zes Histidineresten (His-tag) gefuseerd met de C-terminus (TrCel5A-mCherry). Expressie van het heterologe fusie-eiwit, TrCel5A-mCherry kunnen dus worden gecontroleerd in de groeiende plant met groen licht mCherry verspreiding te onderzoeken. Desgewenst kunnen dunne secties van het plantenmateriaal met groen licht worden microscopisch onderzocht op de specifieke lokalisatie van het eiwit vast. Voor dit werk, signaal en tranzitten peptiden werden opgenomen in het construct, om het heterologe eiwit export naar het endoplasmatisch reticulum ⁹ lokaliseren.

Om de activiteit van plantaardige expressie cellulasen, zoals TrCel5A een aantal cellulase activiteit testen kunnen uitgevoerd worden geanalyseerd. Na de winning van de totale oplosbare plantaardige eiwitten, kan TrCel5A gedeeltelijk worden gezuiverd met behulp van een thermische incubatie techniek. Eiwit maat wordt ingesteld met behulp van SDS-PAGE gevolgd door Western blotting. Zymografie kan worden gebruikt om de activiteit te analyseren tegen substraten, bijv. cellulose die carboxy-gemethyleerd is (waardoor carboxymethylcellulose CMC) voor oplosbaarheid ^10. Cellulase en glucosidase activiteit kan worden gecontroleerd met de fluorofoor 4-methylumbelliferyl (4-MU) geassocieerd met β-D-cellobioside (gecombineerde 4-MUC). Een andere methode om endoglucanase activiteit bij omvat de spectrometrische analyse CMC die is geassocieerd met een azo-dgij (Remazolbrilliant Blue R) ^11. Daarnaast kunnen eiwit activiteit van zowel endoglucanasen en verschillende cellulasen worden gecontroleerd door het gebruik van een suiker analysetest, zoals p-hydroxybenzoëzuur hydrazide (PAHBAH) test ^12. Deze technieken kunnen gebruikt worden om op te helderen en kwantificeren van de activiteit van de tot expressie gebrachte cellulase plaats.

Protocol

1. Groei van Wild Type N. tabacum Planten

1. N. groeien tabacum L. cv. Petit Havana SR1 planten op de bodem, plaatst tabak zaden op de juiste potten gevuld met normale potgrond voor kieming. Na 2 weken overdragen zaailingen individuele potten. Incubeer planten in een kas met een constante 22 ° C (donkere periode) of 25 ° C (licht periode) en 70% relatieve luchtvochtigheid. Zorg voor verlichting in een 16/8 uur licht / donker-cyclus (bv. Philips IP65 400 W lampen, 180 micromol · sec ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) en water dagelijks.

2. Transient Expressie van TrCel5A en TrCel5A-mCherry Eiwitten

1. Onder steriele omstandigheden, pick enkele kolonies van Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK gmr, KmR, RifR) die ofwel pTRAkc-ER-TrCel5A of pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry en transfer naar een erlenmeyer met 10 ml gistextractbouillon (YEB, bereid volgens specificaties van de fabrikant) medium en kanamycine (50 mg / ml), rifampicine (50 mg / ml) en carbenicilline (100 mg / ml) voor selectie. Incubeer 36-40 uur bij 26 ° C en 180 rpm. Opmerking: Het ontwerpen van passende constructies voor eiwitexpressie is buiten het bestek van dit artikel, maar voor begeleiding kunnen de werkwijzen van Maclean et al. ¹³ en Munro en Pellham ¹⁴ worden gevolgd voor construct ontwerp..
2. Neem 200 pi van elke cultuur 20 ml YEB inoculeren met antibioticum concentraties bovengenoemde en incuberen onder dezelfde omstandigheden als hiervoor.
3. Na 36-40 uur, preinduce de kweken door toevoegen van 2 pl acetosyringon (200 uM eindconcentratie), 100 pl 40% (w / v) glucoseoplossing en 200 gl 1 M MES-buffer pH 5,6. Incubeer overnacht.
4. Bereid 100 ml 2x infiltratie buffer (100 g / L sucrose, 3,6 g / L glucose, 8,6 g / l Murashige en Skoog basale zouten, Breng de pH op 5,6 met behulp van kaliumhydroxide).
5. Meet OD ₆₀₀ van de kweken met 1:05 verdunningen tot deze een _OD600 van 5-6 bereikt. Bereken cultuur benodigde volume 30 ml infiltratie medium bij OD _600. Voeg 15 ml 2x infiltratie buffer, voeg dan gedemineraliseerd H ₂ O om de buffer te maken tot 30 ml.
6. Neem planten uit de kas en gebruik een pipet tip om nick de abaxiale kant van de ^3e tot ^5e blad van de top naar infiltratie verlichten.
7. Gebruik een pipet tip om nick de abaxiale kant van de bladeren om infiltratie te verlichten.
8. Vul een spuit met infiltratie medium en zet het (zonder naald) op een van de eerder gemaakte nicks. Ondersteunen spuit met een vinger op de adaxiale blad zijde. Druk het medium voorzichtig in het weefsel van Intraveneuze blad zones. Opmerking: Na infiltratie cultiveren planten in een kas onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven. Ook, maar ook een gelijk aandeel van untrat 's avonds, niet-transiënte expressie planten (NTEPs) als controles, onder dezelfde voorwaarden als geïnfiltreerd planten.

3. Beoordeling van TrCel5A-mCherry Expressie in Plant Leaves

1. Na 4-6 dagen, nemen planten geïnfiltreerd met A. tumefaciens met pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry uit de kas en leg ze in een donkere kamer voor fluorescentie analyse.
2. Om de fluorescentie te visualiseren in blad secties uitdrukken TrCel5A-mCherry, licht planten met behulp van een draagbare lichtbron emitting groen licht bij 515 nm met een rode filter (620-750 nm). Opmerking: In diepte karakterisering van eiwit expressie in de plant bladeren kunnen worden bereikt door dunne-snijden bladeren met een vibratoom en onderzoek onder licht en fluorescentie microscopie. Hiervoor volgt u de onderstaande stappen:
   1. Snijd kleine secties van ongeveer 5 x 5 mm grootte van een geïnfiltreerd blad en insluiten in 4% agarose opgelost in 50 mM fosfaatbuffer (pH 5,7).
   2. Gesnedensectie van 80-90 micrometer grootte van ingesloten bladeren met behulp van een vibratome. Leg ze op een microscoop dia, dek af met buffer of een dekglas en onderzoekt ze met behulp van een microscoop bij een vergroting van 10x met een fluorescentie detector, met dezelfde golflengte en filter hierboven vermeld.

4. TrCel5A Winning Tabaksbladeren

1. Snijd stukken uit tabaksbladeren tot een gewicht van 1 g bij benadering uit planten geïnfecteerd met A. tumefaciens met pTRAkc-ER-TrCel5A en plaats in een mortier voorgekoeld met vloeibare stikstof. Voeg een geschikte hoeveelheid vloeibare stikstof aan de monsters. Grind laat tot poeder met behulp van een voorgekoeld stamper.
2. Voeg 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride de grond bladkwestie en meng tot het meeste blad materie in suspensie. Centrifugeer extract bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en te-eiwit bevattende supernatant.
3. Centrifuge het extract bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en te-eiwit bevattende supernatant voorzichtig de pellet te verstoren. Gooi de pellet.
4. Gedeeltelijk zuiveren TrCel5A door het incuberen van het eiwit bevattende supernatant bij 55 ° C gedurende 10 minuten. Laat rusten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Herhaal gedeeltelijke zuivering van niet-geïnfiltreerde planten controlemonsters verkrijgen. Gebruik deze monsters voor alle volgende experimenten. Opmerking: Eiwit oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 week bij -20 ° C maximaal 3 maanden.
5. Herhaal de gedeeltelijke zuivering van niet-geïnfiltreerde planten controlemonsters verkrijgen. Gebruik deze monsters voor alle volgende experimenten. Opmerking: Eiwit oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 week bij -20 ° C maximaal 3 maanden.

5. SDS-PAGE, Western blotting, en Azo-CMC zymografie van TrCel5A-mCherry

1. Aankoop of bereid 12% (w / v) SDS-PAGE gels volgens gevestigde methoden ^15.
2. CMC oplossen in water tot een 1,5% (w / v) oplossing. CMC-SDS-PAGE gels maken, vervangen 1 ml 1,5% CMC 1 ml water in 10 ml SDS-PAGE-gel mix oplossing, resulterend in een 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE gel mix. Giet gel normaal. Opmerking: Zorg ervoor dat de CMC in de oorspronkelijke oplossing volledig is opgelost door een combinatie van roeren en verwarmen tot 40 ° C (herhalen direct voorafgaand aan de voorbereiding van de gel-oplossing).
3. Denatureren monsters door koken in de aanwezigheid van SDS, volgens vastgestelde methoden ^12. Als een positieve controle, gebruikt een 1:500 verdunning van een in de handel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei, zoals T. reesei ATCC 26921. Als negatieve controle gebruikt een vergelijkbare wijze bereid eiwitoplossing van niet-geïnfiltreerde bladeren (NTEPs).
4. Voer de elektroforese als per normale protocollen ^15,bijvoorbeeld gebruiken 200 V ~ 50 min met de elektroforese gestopt wanneer de kleurstof voorkant tot de onderkant van de gel.
5. Vlekken op een SDS-PAGE-gel met 0,1% (w / v) Coomassie brilliant blauw en destain met methanol / ijsazijn. Opmerking: Snelle kleuren en ontkleuren kan worden uitgevoerd door voorzichtige verwarming kleuring en ontkleuren oplossingen, dat wil zeggen met een magnetron ~ 15 seconden eerst warm (maar niet koken) kleuring en het ontkleuren oplossingen, veranderen de ontkleuroplossing na 10 min , of wanneer gekoeld, en herhaal met nieuwe ontkleuroplossing.
6. Voer Western blot van een SDS-PAGE gel met vastgestelde protocollen ^16,17. Gebruik de volgende antilichamen: een polyklonaal konijn antilichaam tegen een His-tag (primair) en een polyklonaal geit anti-konijn antilichaam Fc-gebied dat is geconjugeerd aan een alkalische fosfatase (secundaire). Opmerking: secondaire antilichamen worden gekozen visualisatie mogelijk gebruik nitroblue tetrazoolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate p-toluidine zout (NBT / BCIP), zoals beschreven ^18.
7. Voer in-gel proteïne hervouwing van 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 1,5% (w / v) β-cyclodextrine, 20 mM fosfaat-citraatbuffer, pH 6,5, bij kamertemperatuur zacht schudden gedurende 15 minuten ^19.
8. Gooi de β-cyclodextrine oplossing Spoel even de gel met _H2O Incubeer bij kamertemperatuur in 50 mM natriumacetaatbuffer (pH 4,8) gedurende een verdere 15 minuten. Voer CMC zymografie met het hervouwen 0,15% CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 30 mM natriumacetaat buffer pH 4,8 gedurende 20 minuten bij 50 ° C.
9. Voer CMC zymografie met het hervouwen 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 30 mM natriumacetaatbuffer (pH 4,8) gedurende 20 min bij 50 ° C.
10. Vlekken op de gel gedurende 10 minuten met een 0,1% gew / vol oplossing Congo rood en destain gedurende 30 minuten of totdat duidelijke banden worden waargenomen met behulp van 1 M NaCl. Was de gel met 0,3% (v / v) azijnzuur duidelijkere beeldvorming.

6. 4-MUC activiteit Assay van TrCel5A

1. Bereid een voorraad oplossing van 10 mM 4-MUC in 50% (v / v) methanol, en bewaar deze in het donker bij kamertemperatuur
2. Onmiddellijk voorafgaand aan de test, bereiden een 4-MUC 2x werkende oplossing, bestaande uit 1 mm 4-MUC en 60 mM natriumacetaat, pH 4,8.
3. Voer deze test monsters die 100 gl blad eiwit (met of zonder TrCel5A induceerbaar expressie), 100 pi van een commercieel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei 1:1000 en zuivere _H2O respectievelijk. Run elk monster in drievoud.
4. Pipetteer 100 ul van de 4-MUC werkoplossing in afzonderlijke putjes van een 96-well plaat, voeg 100 ul van elk monster.
5. Bepaal 0 min tijdpunt van 4-MU fluorescentie door fluorescentie spectroscopie, met een excitatiegolflengte van 360 nm en een emissiegolflengte van 465 nm.
6. Incubeer de platen gedurende 20min bij 50 ° C, bedekt met lijm deksels om verdamping te voorkomen. Stop de reactie door bevriezing (of door combinatie van 100 pi 0,15 M glycine, pH 10,0, en 100 gl monster in een afzonderlijke plaat).
7. Bepaal het eindpunt van 4-MU fluorescentie door fluorescentie spectroscopie, met een excitatiegolflengte van 360 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. Trek 0 min van eindpunt (20 min) tijdpunt de verandering in fluorescentie waarden te komen.

7. Azo-carboxymethylcellulose activiteit Assay van TrCel5A

1. Bereid een voorraad van 1,5% (w / v) Azo-CMC wordt opgeslagen bij kamertemperatuur en een neerslag oplossing die 18 mM zinkacetaat, 0,5 M natriumacetaat, pH 5 en 80% ethanol (v / v), opslag bij kamertempera temperatuur.
2. Vlak voor de test bereidt een Azo-CMC 2x werkoplossing, bestaande uit 1% (w / v) Azo-CMC (in _H2O) en 60 mM natriumacetaat, pH 4,8.
3. Combineer 50 pi monster en 50 ul van de werking oplossing in 1,5 ml buizen.
4. Testmonsters die 50 ul blad eiwit (met of zonder TrCel5A tijdelijk tot expressie); 100 pi van een commercieel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei verdund 1:1000; en zuiver _H2O Run monsters en standaarden in drievoud.
5. Incubeer monsters gedurende 20 minuten bij 50 ° C. Stop de reactie door toevoeging van 250 ul van neerslag oplossing. Vortex elk monster krachtig gedurende 10 seconden te waarborgen oplossingen werden volledig gecombineerd.
6. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna weer vortex. Centrifugeer monsters bij 1000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder 200 pi van elk monster supernatant van een 96-well plaat, verzorgen de pellet te verstoren.
7. Assay middels absorptie spectroscopie bij een golflengte van 590 nm.

8. PAHBAH Assay van TrCel5A

1. Gebruik een hole-punch om een ​​cirkel (~ 5,5 mm diameter) van de filter papier te snijden. Voeg 100 ul 60 mM NaAc, pH 4,8, en 100 pl monsters, hetzij met blad eiwit (met of zonder TrCel5A induceerbaar expressie) of een commercieel T. reesei cellulase mengsel verdund 1:1000 en incubeer met filtreerpapier cirkels gedurende 20 uur bij 50 ° C met 300 rpm schudden. Voor elk monster geïncubeerd met filterpapier, ook uitbroeden een duplicaat oplossing zonder papieren filter als individuele steekproef-controles.
2. Bereid een 330 mM p-hydroxybenzoëzuur hydrazide (PAHBAH) oplossing A door oplossen PAHBAH in _H2O onder toevoeging van 5 ml geconcentreerd HCl gedurende een totaal van 100 ml oplossing, en bewaar bij kamertemperatuur. Opmerking: De beste resultaten worden bereikt door het toevoegen van de HCl tot een kleiner volume PAHBAH suspensie, namelijk 30 ml, die is geroerd onder temperatuur oplossen helpen alvorens het volume op 100 ml met _H2O
3. Bereid PAHBAH oplossing B, die 50 mM natriumcitraat, 10 mM calciumchloride, en 500 mM NaOH en bewaar bij kamertemperatuur.
4. Immediately voorafgaand aan de test bereid een 1.5x werkoplossing van 1 ml PAHBAH reagens 9 ml bufferoplossing, opslag tot gebruik op ijs (te gebruiken binnen 4 uur).
5. Bereid monsters thermostabiele 0,2 of 0,5 ml buizen. Combineer 5 ui van elke oplossing geïncubeerd met filtreerpapier (stap 8.1) 45 ui _H2O en 100 ui PAHBAH werkoplossing. Voorbeeld controles (monsters geïncubeerd zonder filterpapier) worden uitgevoerd onder dezelfde concentraties (5 pl monster, 45 pl _H2O, 100 pl PAHBAH werkoplossing). Ook testen 5 normen (5 ui) die tussen 0 en 0,2 g / l glucose en zuiver _H2O Run monsters en standaarden in drievoud.
6. Incubeer monsters gedurende precies 10 minuten bij 100 ° C, daarna afgekoeld bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten. Pipetteer oplossingen in een plaat met 96 putjes en spectroscopisch onderzoek bij een golflengte van 410 nm. Aftrekken individuele sample-controles (geïncubeerd zonder papieren filter) van monsters definitief te verkrijgenwaarden.

Resultaten

TrCel5A en TrCel5A-mCherry succesvol in tabaksplanten uitgedrukt in het tijdelijke expressiesysteem (Figuren 1A en 1B). Onderzoek van het expressiepatroon van de TrCel5A-mCherry fusie-eiwit onthulde gezonde bladeren (figuur 1C), die wijdverspreid eiwitexpressie onder groen licht (figuur 1D) toonde.

Extractie van totaal oplosbare proteïnen werd uitgevoerd op tabak planten die bladeren die bevatte had tijdelijk tot expressie T...

Discussie

Recombinante expressie van cellulasen is een gebied van groot belang, vanwege het verlangen naar efficiëntere biobrandstoffen productiesystemen ^1. Planten bieden vele mogelijkheden voor een succesvolle cellulase productie, met functies zoals economische oogsttechnieken en autohydrolysis methoden zeer wenselijke eigenschappen voor grootschalige productie van biobrandstoffen. Verder, het gebruik van verschillende lokalisaties voor het produceren van eiwitten toestaan, indien nodig, posttranslationele modificati...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
Azijnzuur	ROTH	3738
Acetosyringon (geconcentreerd)	ROTH	6003
Antibioticum - kanamycine	ROTH	T832
Antibioticum - rifampicine	ROTH	4163
Antibioticum - carbencillin	ROTH	6344
Antilichaam - konijn anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Antilichaam - geit anti konijn AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxymethylcellulose	MEGAZYME	S-ACMC
β-cyclodextrine	SIGMA-ALDRICH	C4805
Calciumchloride dihydraat	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxymethylcellulose	ROTH	3333.1
Cellulase van Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo rood	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie briljantblauw G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucose	ROTH	8337
Ethanol	ROTH	K928
Filterpapier - Rotilabo blotting paper	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES-buffer	ROTH	4256
Methanol	ROTH	8388
Natriumcitraat	ROTH	3580
Natriumdodecylsulfaat	SERVA	20765
Natriumhydroxide	ROTH	6771
Grond, Einheitserde classic	PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide	SIGMA-ALDRICH	H9882
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	ROTH	1058
UV lichtbron - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica