Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit Trichoderma reesei In tabaksplanten

Summary

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Abstract

Cellulose afbrekende enzymen, cellulasen, zijn doelwit van zowel onderzoek en industriële belangen. Het overwicht van deze enzymen op moeilijk-cultuur organismen, zoals hyfen opbouw schimmels en anaërobe bacteriën is bespoedigd het gebruik van recombinante technologieën op dit gebied. Plant expressiewerkwijzen zijn gewenst voor grootschalige productie van enzymen en andere industrieel bruikbare eiwitten. Hierin werkwijzen voor de transiënte expressie van een endoglucanase schimmel, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum worden gedemonstreerd. Succesvolle eiwitexpressie blijkt, gecontroleerd door fluorescentie met een mCherry-enzym fusieproteïne. Bovendien, een aantal standaard tests worden gebruikt om de activiteit van tijdelijk tot expressie T. onderzocht reesei Cel5A, waaronder SDS-PAGE, Western blotting, zymografie, evenals fluorescentie en kleurstoffen gebaseerde substraat degradatie assays. Het hier beschreven systeem kan worden gebruikt om een ​​actieve cel producerenUlase in een korte tijdsperiode, om het potentieel voor verdere productie in planten te evalueren door constitutieve of induceerbare expressiesystemen.

Introduction

Afbraak van lignocellulose biomassa en het aanmaken van vloeibare brandstof is voorgesteld als een methode om afhankelijkheid van fossiele brandstoffen. Een belangrijke hindernis bij het ​​vaststellen economisch haalbare biomassa-systemen in de enzymatische afbraak van cellulose en hemicellulose ^1. Plant expressiesystemen enorme mogelijkheden voor de productie van enzymen op industriële schaal. Landbouwsystemen te oogsten planten economisch als in volume zijn al gevestigd, zoals ze al duizenden jaren zijn geweest. De productie van cellulasen in planten gewenst door factoren zoals het gemak van autohydrolysis ^2, en de mogelijkheden voor max....

Protocol

1. Groei van Wild Type N. tabacum Planten

1. N. groeien tabacum L. cv. Petit Havana SR1 planten op de bodem, plaatst tabak zaden op de juiste potten gevuld met normale potgrond voor kieming. Na 2 weken overdragen zaailingen individuele potten. Incubeer planten in een kas met een constante 22 ° C (donkere periode) of 25 ° C (licht periode) en 70% relatieve luchtvochtigheid. Zorg voor verlichting in een 16/8 uur licht / donker-cyclus (bv. Philips IP65 400 W lampen, 180 micromol · sec ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) en water dagelijks.

2. Transient Expressie van TrCel5A en TrCe....

Results

TrCel5A en TrCel5A-mCherry succesvol in tabaksplanten uitgedrukt in het tijdelijke expressiesysteem (Figuren 1A en 1B). Onderzoek van het expressiepatroon van de TrCel5A-mCherry fusie-eiwit onthulde gezonde bladeren (figuur 1C), die wijdverspreid eiwitexpressie onder groen licht (figuur 1D) toonde.

Extractie van totaal oplosbare proteïnen werd uitgevoerd op tabak planten die bladeren die bevatte had tijdelijk tot expressie T.......

Discussion

Recombinante expressie van cellulasen is een gebied van groot belang, vanwege het verlangen naar efficiëntere biobrandstoffen productiesystemen ^1. Planten bieden vele mogelijkheden voor een succesvolle cellulase productie, met functies zoals economische oogsttechnieken en autohydrolysis methoden zeer wenselijke eigenschappen voor grootschalige productie van biobrandstoffen. Verder, het gebruik van verschillende lokalisaties voor het produceren van eiwitten toestaan, indien nodig, posttranslationele modificati.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
Acetic acid	ROTH	3738
Acetosyringon (concentrated)	ROTH	6003
Antibiotic - kanamycin	ROTH	T832
Antibiotic - rifampicin	ROTH	4163
Antibiotic - carbenicillin	ROTH	6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose	MEGAZYME	S-ACMC
β-cyclodextrin	SIGMA-ALDRICH	C4805
Calcium chloride dihydrate	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxymethyl cellulose	ROTH	3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo red	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie brilliant blue G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucose	ROTH	8337
Ethanol	ROTH	K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES buffer	ROTH	4256
Methanol	ROTH	8388
Sodium citrate	ROTH	3580
Sodium dodecylsulfate	SERVA	20765
Sodium hydroxide	ROTH	6771
Soil, Einheitserde classic	PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide	SIGMA-ALDRICH	H9882
Phosphate buffered saline	ROTH	1058
UV light source - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica