Stabiliserende Hepatocellulaire Fenotype behulp Geoptimaliseerd Synthetic Surfaces

Summary

Dit artikel zal zich richten op het ontwikkelen van polymeer gecoate oppervlakken voor de lange termijn, stabiele cultuur van stamcellen verkregen menselijke levercellen.

Abstract

Momenteel is een van de belangrijkste beperkingen in de celbiologie het handhaven van een gedifferentieerd celfenotype. Biologische matrixen worden vaak gebruikt voor het kweken en onderhouden van primaire en pluripotente stamcel-afgeleide hepatocyten. Hoewel biologische matrixen nuttig zijn, staan ze slechts kortdurende cultuur van hepatocyten toe, wat hun brede toepassing beperkt. We hebben geprobeerd de beperkingen te overwinnen door gebruik te maken van een synthetische polymeercoating. Polymeren vertegenwoordigen een van de breedste klassen van biomaterialen en bezitten een breed scala aan mechanische, fysische en chemische eigenschappen, die kunnen worden afgestemd op het doel. Belangrijk is dat dergelijke materialen kunnen worden opgeschaald naar kwaliteitsborgingsnormen en batch-tot-batch consistentie vertonen. Dit is essentieel als cellen moeten worden uitgebreid voor high-throughput screening in de farmaceutische testindustrie of voor cel-gebaseerde therapie. Polyurethaan (PU) is een groep materialen die veelbelovend zijn gebleken in celcultuur. Onze recente vooruitgang in het optimaliseren van een polyurethaan gecoat oppervlak, voor langdurige cultuur van humane hepatocyten die een stabiel fenotype vertonen, wordt gepresenteerd en besproken.

Introduction

Biologische materialen zijn op grote schaal gebruikt in het onderhoud en differentiatie van pluripotente stamcellen ^1. Terwijl waardoor deze biologische substraten bevatten vaak een groot aantal ongedefinieerde componenten. Matrigel is een veelgebruikte substraat voor stamcelkweek en differentiatie. Helaas, zijn variabele samenstelling beïnvloedt celfunctie en fenotype. Hoewel een verscheidenheid van alternatieve, meer gedefinieerde biologische matrices zijn gebruikt ^2-7, hun dierlijke oorsprong of slechte schaalbaarheid maakt ze ongeschikt kandidaten voor industriële productie. Daarom is de identificatie van synthetische alternatieven, met gedefinieerde samenstelling en betrouwbare prestaties, zijn belangrijke doelen in het stamcelonderzoek.

In een poging om de beperkingen van gedefinieerde celkweek substraten overwinnen, hebben interdisciplinaire samenwerking tussen chemie en biologie synthetische materialen die met de capaciteit om celfenotype ondersteunen. SyntheTIC substraten zijn schaalbaar, kosteneffectief, en kan worden vervaardigd tot complexe 3D-structuren, het nabootsen van de in vivo omgeving. Door deze eigenschappen synthetische substraten zijn op grote schaal gebruikt ter ondersteuning en differentiatie van veel celtypen ^8-10 drijven.

Geavanceerde en high throughput assays hebben vergemakkelijkt de snelle screening van synthetische materialen, van grote bibliotheken, en geleverd nieuwe materialen met flexibele eigenschappen met brede toepassingen in het biomedisch onderzoek en ontwikkeling ^11-13. Met behulp hoge throughput, polymeer micro-array technologie screening, heel snel geïdentificeerd een eenvoudige polyurethaan (PU134), geschikt onderhoud van humane stamcellen afgeleide hepatocyten. Dit polymeer bleek superieur aan dierlijke substraten met betrekking tot hepatocyt differentiatie en functie ^14-16. We hebben vervolgens geoptimaliseerd de coating voorwaarden, topografie en sterilisatieproces voor toegang tot effectenpolymeer prestaties in het stabiliseren hepatocytfunctie en levensduur. Dit heeft belangrijke implicaties met betrekking tot het begrijpen van de fundamentals van de levercel biologie voor cel-gebaseerde modellering en regeneratieve geneeskunde toepassingen.

De techniek die hier beschreven is een voorbeeld van hoe het oppervlak van een synthetisch polymeer kan worden geoptimaliseerd fenotype behouden. Wij geloven dat de combinatie van deze technologie met een efficiënte serumvrij hepatocyte differentiatie protocol heeft de potentie om een schaalbare productie van hepatocyten voor gebruik in in vitro modellen en regeneratieve medicijnen bieden.

Protocol

1 Synthese van PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethyleenglycol) -alt adipinezuur] diol)

Schema 1: Synthese van PHNAGD Schematische voorstelling van de synthese van PHNAGD.. PHNAGD werd bereid door reactie van 1,6-Hexanodiol, diethyleenglycol, neoppentyl glycol en adipinezuur. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethyleenglycol) -alt adipinezuur] diol.

1. Toepassen warmtebehandeling om de monomeren 1,6-hexaandiol, di (ethyleenglycol) en neopentylglycol bij 40 ° C gedurende 48 uur in een vacuümoven om het resterende water te verwijderen. Laat koude af tot kamertemperatuur onder vacuüm.
2. Voeg 22 mmol van elk monomeer en adipinezuur (55 mmol) om een ​​twee-hals rondbodemkolf uitgerust met een geroerde bar en verbonden met een Dean-Stark inrichting.
3. Plaats het geheel onder een vacuüm en verwarm het glassware bij 40 ° C gedurende 6 uur, om eventuele vochtopname tijdens de toevoeging van de chemische stof in de kolf voorkomen.
4. Voeg via een injectiespuit, druppel voor druppel, 0,0055 mol van de katalysator titanium (IV) butoxyde.
5. Roer het reactiemengsel bij 180 ° C, onder een _N2 atmosfeer gedurende 24 uur, en restolie water in de Dean-Stark val. Laat het product afkoelen tot kamertemperatuur.

2 Synthese van PU134

Schema 2: Synthese van PU134 Schematische voorstelling van de synthese van polyurethaan 134 PU134 werd bereid door reactie van 1,0 equivalent van een PHNGAD met 2,0 equivalenten van een 4,4-methyleenbis (fenylisocyanaat), gevolgd door de toevoeging van 1,0. equivalent van een 1,4-butaandiol ketenverlenger.

1. Meng een equivalent van de polyol PHNGAD (Mn ~ 1.800 Da, 3,2 mmol) met twee equivalenten van 4'4-methyleenbis (fenylisocyanaat) (6.4 mmol) in watervrij N, N-dimethylformamide (12 ml).
2. Roer het reactiemengsel bij 70 ° C, onder een _N2 atmosfeer.
3. Voeg via een injectiespuit druppelsgewijs de katalysator titanium (IV) butoxide (0,8% gew).
4. Na 1 uur, voeg een equivalent van de ketenverlenger 1,4-butaandiol (3,2 mmol). Verhoog de ​​temperatuur op 90 ° C en roer gedurende 24 uur onder een _N2 atmosfeer.
5. Na de reactie, verzamel het polyurethaan door precipitatie door toevoeging van diethylether (hexaan of water kan worden gebruikt) druppelsgewijs aan de reactieoplossing tot het neerslaan plaatsvindt.
6. Centrifugeer de oplossing bij 5300 g gedurende 5 minuten.
7. Giet het supernatant en drogen bij 40 ° C in een vacuüm oven totdat het oplosmiddel verdampt.
   Opmerking: Om ervoor te zorgen dat het eindproduct van de reactie hebben de juiste parameters betreffende de molecuulgewichtsverdeling, de functionele groups van het polymeer en het smelten en glasovergangstemperaturen kunnen diverse analytische technieken en methoden gebruikt, zoals gelpermeatiechromatografie of FITR spectroscopie.

3 Voorbereiding van de PU134 Solutions

1. Weeg 200 mg PU134 in een glazen fles.
2. Verdun PU134 een eindconcentratie van 2% in verschillende oplosmiddelen: chloroform, een combinatie van chloroform en tolueen in 1: 1 verhouding, tetrahydrofuran en combinatie van tetrahydrofuran en dichloormethaan in 1: 1 verhouding.
   Opmerking: De keuze van het juiste oplosmiddel varieert afhankelijk van het polymeer te gebruiken. Verschillende oplosmiddelen hebben verschillende kookpunten dat de oplosbaarheid van het polymeer beïnvloeden.
3. De oplossing wordt krachtig gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een schudder bij een snelheid van 200 mot / min, totdat de oplossing homogeen en geen neerslag waargenomen.

4 Coating van Glass Slides met PU134

1. Plaats een round 15 mm ² dekglaasje op de spin coater.
2. Solliciteer 50 ul van de PU134 oplossing voor elk gebruik van een pipet. Het volume van de oplossing PU134 derhalve voor gewenste dekglaasje grootte waarbij de volume verhouding proportioneel oppervlak.
3. Draai elk dekglaasje voor 7 sec bij 23 x g.
4. Droging dekglaasje bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur voorafgaand aan de sterilisatie.

5 Bestraling van Coverslip

1. Gamma-bestraald polymeer beklede dekglaasje door een dosis van 10 Grays met een klinisch bestraler voor 12 minuten.
2. UV-bestraling van polymeer coating dekglaasje met behulp van een 30 W, UV-lamp voor 16 minuten aan elke kant.
3. Plaats de polymeer beklede dekglaasje in een geschikt weefselkweekplaat volgens formaatschuif.

6 Scanning Electron Microscopy

1. Gouden jas polymeer dekglaasje door sputteren voor 200 sec in een atmosfeer van 5 x 10 ^-1 millibar druk.
2. Leg de microgRAFIEKEN van het polymeer gecoate dekglaasje met behulp van een scanning elektronenmicroscoop in versneld spanning van 20 kV in secundaire elektronen imaging-modus.

7 Atomic Force Microscopy Waarnemingen

1. Scan een gebied van 20 x 20 urn van het polymeer oppervlak.
2. Het opzetten van een scansnelheid van 1,32 Hz tot 1,60 Hz.
3. Het opzetten van een resolutie van 512 x 512 pixels in het gescande gebied.
4. Bereken het kwadratisch gemiddelde (RMS of Rq) van de bekleding met de gemiddelde hoogte afwijkingen uit de gemiddelde beeldgegevens vliegtuig, uitgedrukt als:
   
   Waarbij Zi is de huidige waarde Z en N is het aantal punten in het gegeven gebied.
5. 7.5 Bereken de afwijking of bedoel oppervlakteruwheid (Ra) van het beeld met behulp van,
   
   Waarbij Z (x) is de functie waarmee t beschrijfthij de oppervlakte profiel in termen van hoogte (Z) en de positie (x) van de steekproef over de evaluatie lengte "L" geanalyseerd. Ra staat voor de gemiddelde waarde van het oppervlak ten opzichte van het middenvlak.

8 Cell Culture en differentiatie

1. Cultuur en differentiëren van de menselijke embryonale stamcellen lijn (hESC) H9, zoals beschreven in het hooi ^17.
2. Maak cellen met een dissociatie reagens en replate ze op PU134 gecoate glaasjes op dag 9 van het differentiatieproces, in aanwezigheid van een serumvrij medium zoals beschreven in Szkolnicka ^18,19.
   Opmerking: Het gebruik van een enzymatische cel dissociatie voorkeur fysieke cel onthechting.

9 cytochroom P450 Functionele Assay

1. Meet CYP3A activiteit volgens de instructies van de fabrikant.
2. Incubeer hESC afgeleide hepatocyten op dag 13 of dag 19, en de media, zonder cellen - als een negatieve controle, met de juiste substrat 5 uur bij 37 ° C.
3. Verzamel supernatanten van cellen en media, voert de test volgens instructies van de fabrikant.
4. Meet het niveau van CYP activiteit genormaliseerd ten opzichte van het oppervlak ^(cm2).

10. Immunokleuring

1. Wash hESC afgeleide hepatocyten met PBS, gedurende 1 min, tweemaal herhalen.
2. Voeg ijskoude 100% methanol cellen vast, plaats in -20 ° C gedurende 10 minuten.
3. Was de cellen met PBS gedurende 5 minuten en herhaal twee keer.
4. Incubeer de cellen met PBS / T (0,1% tween) / 10% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
5. Zuig het PBST oplossing en voeg het juiste primaire antilichaam verdund in PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, incuberen bij 4 ° C onder zacht roeren O / N.
6. Was de cellen met PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA gedurende 5 minuten en drie keer herhalen.
7. Verdun het juiste antilichaam in PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, aan de cellen en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht schudden.
8. Was de cellen met PBS gedurende 5 minuten en drie keer herhalen.
9. Voeg Mowiol 488 (met DAPI 1: 1000) aan elk putje, voeg een dekglaasje zachtjes aantal luchtbellen verminderen. WINKEL gefixeerde cellen bij 4 ° C in het donker. Observeer kleuring met behulp van een microscoop met een geschikte filter en tl-lamp. De optimale primaire en secundaire antilichamen zijn vermeld in tabel 1.

Results

Polymer oplosmiddel beïnvloedt de topografie van het oppervlak polymeer beklede

Polyurethaan 134 werd opgelost in chloroform, alleen of in combinatie met tolueen of tetrahydrofuran of dichloormethaan en de glasplaatjes roterend bedekken met de verschillende formuleringen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en atomic force microscopie (AFM) werden gebruikt om kenmerken de fysische eigenschappen van het polymeer coatings (figuur 1). De verkregen middels tolu...

Discussion

Vele huidige methoden voor hepatocyten uit stamcellen genereren afhankelijk zonder gedefinieerde matrices van dierlijke oorsprong. Deze substraten kan kostbaar en zeer variabel zijn, beïnvloeden de celfunctie en stabiliteit, wat neerkomt op een aanzienlijke belemmering voor de toepassing. Daarom voerden we een scherm voor synthetische materiaal dat de kweek van stamcellen afgeleide hepatocyten ondersteunen. We hebben ook behoefte aan een eenvoudige polyurethaan (PU134), gevormd door polymerisatie PHNGAD, MDI en een exte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker	Edmun Bühler	KS-15
Irradiator	CIS Biointernational	IBL 637
Spin coater	Specialty Coating System	P-6708
Scanning Electron Microscope	Philips	XL30CPSEM
Atomic Force Microscope	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV bulb	ESCO
NanoScope analysis software	VEECO		version 1.20
Fluorescence microscope	Olympus	TH45200	Gebruik Volocity 4 Software
Tissue culture plates	Corning, UK	3527
glass slides	Scientific Laboratory Supplies	MIC3308
Diethylene glycol	Sigma–Aldrich	93171
1,6-hexanediol	Sigma–Aldrich	240117
Neopentyl glycol	Sigma–Aldrich	408255
Adipic acid	Sigma–Aldrich	9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide	Sigma–Aldrich	227056
Diethyl ether	Sigma–Aldrich	676845
titanium (IV) butoxide	Sigma–Aldrich	244112
1,4-butanediol	Sigma–Aldrich	493732
Vacuum oven	Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)	Sigma–Aldrich	101688
Tetrahydrofurane	Sigma–Aldrich	401757
Sputter coater	Bal-Tec SCD 050
Immunostainering
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Bewaar bij kamertemperatuur
PBST, PBS gemaakt met 0,1% TWEEN 20	Scientific Laboratory Supplies Ltd	EC607
Methanol	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Gemaakt in Tris HCl en glycerol volgens de instructies van de fabrikant
Celcultuur en functionele test
CYP3A activiteit pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013