Transplantatie van staarthuid is een krachtig model voor het bestuderen van T-cel-afhankelijke afstoting en tolerantie-inductie tijdens allogene immuunresponsen bij muizen. De voordelen van dit protocol zijn kleine invasieve chirurgie en gemakkelijke monitoring zonder dat de ontvangende muis hoeft te worden geofferd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Transplantatie van Tail Skin aan allogene CD4 T-cel responsen bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het onderzoek naar T-celreacties en hun gevolgen tijdens herkenning van allo-antigenen vereist een model dat het mogelijk maakt om onderscheid te maken tussen donor en gastheer T-cellen, het gemakkelijk controleren van het transplantaat en het aanpassen van het systeem om verschillende immunologische vragen te beantwoorden. Medawar en collega's vestigden in 1955 allogene staarthuidtransplantatie bij muizen. Sindsdien is het huidtransplantatiemodel voortdurend gewijzigd en aangepast om specifieke vragen te beantwoorden. Het gebruik van staarthuid maakt dit model gemakkelijk te scoren voor afstoting van het transplantaat, vereist geen uitgebreide voorbereiding of diepe anesthesie, is toepasbaar op dieren van alle genetische achtergrond, ontmoedigt ischemische necrose en maakt chemische en biologische interventie mogelijk.
In het algemeen zijn zowel CD4+ als CD8+ allogene T-cellen verantwoordelijk voor de afstoting van allograften, omdat ze niet-overeenkomende major histocompatibiliteitsantigenen van verschillende muizenstammen herkennen. Er zijn verschillende modellen beschreven voor het activeren van allogene T-cellen in muizen met huidtransplantatie. De identificatie van major histocompatibiliteitscomplex (MHC) klasse I en II moleculen in verschillende muizenstammen, inclusief C57BL/6 muizen, was een belangrijke stap in het begrijpen en bestuderen van T-cel-gemedieerde alloresponsen. In het hier beschreven staarthuidtransplantatiemodel is een drie-puntsmutatie (I-Abm12) in de antigeen-presenterende groef van het MHC-klasse II (I-Ab) molecuul voldoende om sterke allogene CD4+ T-celactivatie in C57BL/6 muizen te induceren. Huidtransplantaten van I-Abm12 muizen op C57BL/6 muizen worden binnen 12-15 dagen afgestoten, terwijl syngene transplantaten tot 100 dagen worden geaccepteerd. De afwezigheid van T-cellen (CD3-/- en Rag2-/- muizen) maakt huidtransplantaatacceptatie mogelijk tot 100 dagen, wat kan worden overwonnen door het overbrengen van 2 x 104 wildtype of transgene T-cellen. Adoptief overgedragen T-cellen prolifereren en produceren IFN-γ in I-Abm12-getransplanteerde Rag2-/- muizen.
Inleiding
Transplantatie van solide organen zoals huid, hart en nieren is nu een standaard procedure in de medische praktijk wereldwijd 1. Succesvol getransplanteerde organen kan door activering van de ontvanger immuunsysteem, die de major histocompatibility antigenen van de donor herkent worden afgewezen. Daarom getransplanteerde patiënten moeten de behandeling met immunosuppressieve geneesmiddelen 2. Allogene huidtransplantatie bij muizen werd vastgesteld Medawar en collega's in 1955 en is nuttig voor het identificeren van gerichte moleculen later beschreven major histocompatibility complex (MHC) klasse I en II. Sindsdien heeft de huidtransplantatie model voortdurend gemodificeerd en aangepast aan de rol van T-cel subsets en de relevantie van chemische en biologische interventie bij het onderdrukken van transplantaatafstoting 2-4 bestuderen. Huid van het oor en de romp zijn moeilijker te bereiden en zijn meer vatbaar voor hypoxie en necrose dan staartstuk 5; echter,transplantatie procedure gelijk. Naast het toezicht op de staart-huidtransplantaties is eenvoudig te wijten aan de karakteristieke haar textuur van de huid.
Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor MHC klasse II mismatch staart-huidtransplantatie dat zorgt voor de studie van de verschillende aspecten van CD4 + T-cel gemedieerde allograft afstoting en tolerantie bij muizen. De natuurlijke drie-puntmutatie in de MHC klasse II molecuul IA b (de zogenaamde IA BM12) 6-9 is voldoende om afstoting van de huid allotransplantaten induceren in C57BL / 6 muizen 8. De IA BM12 molecuul activeert CD4 + T-cellen met verschillende αβ-T-celreceptor (TCR) ketens van C57BL / 6 muizen, waaronder Vα2Vβ8 TCR-specifieke T-cellen werden geïdentificeerd om een TcR-transgene muizen 10 genereren. De adoptieve overdracht van Vα2Vβ8-TcR T-cellen is gebruikt om afstoting model vast te stellen bij immunodeficiënte C57BL / 6 RAG2 - / - muizen getransplanteerd met IA BM12 huid.
Genetische verschillen tussen donor en ontvanger beïnvloeden het resultaat van transplantaat-acceptatie en afwijzing. Er zijn verschillende soorten transplantaties: autografts zijn transplantaties van het ontvangende individu zelf; syngrafts en allotransplantaten respectievelijk transplantatie van genetisch identiek en genetisch niet verwante individuen. Aanvaarding van verschillende allogene orgaantransplantaties is aangetoond door chemische en biologische interventie bij patiënten en muismodellen 11,3,4. In een fundamentele aanpak, anti-CD3-antilichaam behandelde C57BL / 6 muizen bleek langdurige overleving van IA BM12 staart-huid (ongepubliceerde gegevens). Depletie van CD4 + en CD8 + T-cellen voor transplantatie in ontvangende muizen resulteerde in aanvaarding van MHC klasse I en II mismatched transplantaten (rev. in 12). Interessant afwijzing van huidtransplantaties afhankelijk van de aanwezigheid van CD4 + T-cellen (rev. in 12). In dit model, gericht op specifieke interacties tussen verschillende immune cellen door het blokkeren costimulatoire moleculen met antilichamen of onderdrukking van regulatoire T-cellen kan tolerantie (ongepubliceerde gegevens) induceren. Inderdaad, het blokkeren van zowel CD40 en CD28 leidde tot lange termijn huid allotransplantaat tolerantie 13,14.
Staart-huidtransplantatie is eenvoudig uit te voeren en gemakkelijk te controleren in vergelijking met transplantatie van andere organen. Bovendien staart-huidtransplantaten gemakkelijk te bereiden en zijn minder gevoelig voor ischemie dan andere huidweefsels. In tegenstelling tot geïnjecteerde anesthetica, het gebruik van anestheticum gas (isofluorane) tijdens transplantatie verkort zowel de procedure en ontvanger hersteltijd. Krullen van de staart-huidtransplantatie, wat kan leiden tot onvolledige wondgenezing en transplantaatafstoting, wordt voorkomen door toepassing van weefsellijm. Bovendien is de IA BM12 staart-huidtransplantatie model activeert CD4 uitsluitend + T-cellen in zowel immunocompetente en immunodeficiënte muizen (van dezelfde genetische achtergrond) de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken.
Dit protocol beschrijft een betrouwbaar, reproduceerbaar en gemakkelijk gevolgd muismodel waarmee chemische en biologische interventie. Het model is bedoeld voor het onderzoeken van afwijzing en tolerantie inductie van staart-huidtransplantaties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
In deze video publicatie en protocol, werden alle dierlijke procedures uitgevoerd in overeenstemming met het dier protocol door de kantonrechter Autoriteit Basel-Stadt, Zwitserland goedgekeurd. Voer alle procedures in steriele omstandigheden waar.
1. Voorbereiding van de Chirurgie
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en gaas voor gebruik.
- Verwarm de warme pad en organiseren chirurgische instrumenten op de tafel (tabel of Materials / Methoden).
- Open de vinger strip bandages. Vaseline op de wond pad met een wattenstaafje (zorg ervoor dat het gaas is volledig bedekt).
- Weeg de muizen en beheren analgesie Buprenorfine 0,05 mg / kg lichaamsgewicht. Let op: dit zal analgesie onmiddellijk na de transplantatie.
2. Voorbereiding van de Staart-huid voor transplantatie
- Euthanaseren donormuizen (bijv. IA BM12) per CO 2 stikken en disinfect de staarten met desinfectie oplossing voor excisie.
- Plaats de staart met de zwarte streep op een schone plastic bord en snijd hem overlangs in heel de middelste lijn, waardoor een oppervlakkige incisie waarbij slechts de huidlaag.
- Trek het vel van de staart met behulp aangrijpend tang.
- Zet de staart-huid in een 10 cm celkweek schotel gevuld met 10 ml HBSS.
3. Chirurgische Procedure
- Verdoven ontvangende muizen (bijvoorbeeld C57BL / 6) door inademing van een 3% oplossing isofluorane transparante inductie vak. NB: Het duurt 3-5 minuten voor de muis om chirurgische anesthesie vliegtuig te bereiken. Gebruik dierenarts zalf op de ogen tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- Plaats de muis op de warme pad en toepassing 1,5% isofluorane via een mondmasker en ezels elk dier reflex door teen knijpen.
- Scheer de dorsale site van de ontvangende muizen (bijv. C57BL / 6) en verwijder besmetten haren met een droog gaasje swab.
- Desinfecteer geschoren transplantatie site met aseptische oplossing.
- Knijp de huid met een tang in het midden / rechts site van het dorsale gedeelte en gebruik gebogen schaar om een ronde insnijding van ongeveer 1 x 0,6 cm maken.
- Als bloeden optreedt, dan is het reinigen van de wond met een steriel wattenstaafje.
- Evalueer de grootte van de incisie en snijd een transplantatie van de geschatte omvang van de staart-huid met behulp van de scalpel.
- Trim hoeken om de transplantatie te ronden.
- Laad de transplantatie op de scalpel, droge overmaat HBSS op een steriel wattenstaafje en plaats deze in het transplantaat bed van de ontvanger muis.
- Vermijd overlapping van donor en gastheer huid en weefsel toe te passen lijm op de contact zone uitsluitend.
- Breng een pleister zonder plooien rond de muis taille.
- Breng de lijm niet-elastisch verband om de pleister vast aan de muis (3 mm verschoven).
- Incise met de schaar ongeveer 3 mm in de bovenste ventrale plaats van het verband. Opmerking: Dit is om te voorkomen dat trapping van de tanden van de muis tijdens de herstelfase.
- Verwijder de narcose-mond-masker en houden de getransplanteerde muizen op de verwarming pad totdat wakker.
- Terug getransplanteerde muizen om hun kooien wanneer volledig hersteld en beoordelen hun mobiliteit zodat het verband niet te strak.
- Steriliseren alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol, alvorens volgende operatie.
4. Postoperatieve zorg
- Add-paracetamol bevattende siroop aan het drinkwater (4 mg / ml) en toedienen gedurende 7 dagen.
- Terug muis om het dier kamer als het eenmaal is hersteld.
- Nauwlettend toezien op muizen voor klinische symptomen, zoals depressie of andere gedragsveranderingen (eten of immobiliteit), abnormale verschijning (gebrek aan verzorging) of houding (pilo-erectie of gebogen houding) voor de tijd dat het verband op zijn plaats is (1 week).
5. Bandage verwijderen (6-7 dagen na transplantatie)
- Anesthetize muizen door inhalatie van een 3% isofluorane oplossing in een doorzichtige doos inductie (zie hierboven).
- Knip verband en gips met slagader schaar en verwijder voorzichtig hen. Opmerking: vermijd het uitrekken van de transplantatie plaats.
- Bewaken van de getransplanteerde muizen op klinische tekenen (zie 4.3) en de score voor de afwijzing van huidtransplantaties (tabel 1). Opmerking: Het transplantaat score systeem maakt gebruik van de verschillende haartexturen op de staart-huid in vergelijking met de dorsale huid. Het uiterlijk van de transplantatie en de afwijzing is ingedeeld in 3 klassen. Allogene huid (MHC II mismatch, bijvoorbeeld, IA BM12) enten van C57BL / 6 immunocompetente muizen worden meestal binnen 12-15 dagen na de transplantatie (eigen gegevens en 15-20) verworpen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In een eerste benadering werden C57BL / 6 muizen getransplanteerd met IA BM12 allografts en IA b syngrafts. Na bandage verwijdering, ent manifeste tekenen van wondgenezing zonder sluiting van het contact zone in C57BL / 6 muizen (figuur 1A). Na verwijdering bandage, CD4 + T-cellen gemedieerde ontsteking leidde tot het ontstaan van necrotische gebieden (rode stippen) en afstoting van allografts IA BM12 in C57BL / 6 muizen binnen 13 dagen na transplantatie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Huidtransplantatie is een veel gebruikte werkwijze voor het bestuderen afstoting en tolerantie afhankelijk van T-cellen. Aangezien de huid transplantatie model werd opgericht, hebben diverse aanpassingen en wijzigingen zijn toegepast. In de beschreven procedure, is IA BM12 staart-huidtransplantatie uitgevoerd met behulp van narcosegas (isofluorane). Het gebruik van gas verdoving vermindert de tijd van uitvoering en muizen herstel, dat de stress vermindert op getransplanteerde muizen. De procedure maakt gebrui...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door SNF-subsidies PPOOA-_119204 en PPOOP3_144918 aan S.W.R. We danken E. Palmer en B.T.H. Hausmann voor muizen en technische expertise.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Betadine standaardoplossing | Mundipharma | ||
| Wattenstaafje | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan, UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast vingerpleisters | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl weefselkleefstof | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic, 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Steriele gaas, 5 x 5 cm, 8 lagen | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Fijne tang met smalle patroon | FST | 11003-12 | |
| Fijne iris schaar gebogen | FST | 14095-11 | |
| Fijne iris schaar | FST | 14094-11 | |
| Mayo schaar | FST | 14010-15 | |
| Slagader schaar met bolspits 11,5 cm | FST | 14080-11 | |
| Weefseltang | FST | 11021-14 | |
| Chirurgisch mes nr. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Koolstofstaal |
| Chirurgische mesgrepen | Swann-Morton LTD | ||
| Spuit, 1 ml | ARTSANA | Wegwerp | |
| Temgesic, buprenorfine | ESSEX Chemie AG | 0,3 mg/ml | |
| Weefselkwekerij schotels 10 cm, 60,1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warmtepad | Solis | Type 223 |
Referenties
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al. New perspectives of immunosuppression. Transplantation proceedings. 45 (3), 1224-1231 (2013).
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current protocols in immunology. , (2009).
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
