Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

Samenvatting

Er werd een benadering ontwikkeld voor het identificeren van optimale virale concentratiecondities voor kleine watermonsters met behulp van spikes van humaan adenovirus. De hier beschreven technieken worden gebruikt om concentratieparameters voor andere virale doelen te identificeren en worden toegepast op grootschalige virale concentratie-experimenten.

Samenvatting

Kleinschalige concentratie van virussen (monstervolumes 1-10 L, hier gesimuleerd met aangevulde 100 ml watermonsters) is een efficiënte, kosteneffectieve manier om optimale parameters voor virusconcentratie te identificeren. Virussen kunnen uit water worden geconcentreerd door middel van filtratie (elektropositief, elektronegatief, glaswol of grootte-uitsluiting), gevolgd door secundaire concentratie met runderextract om virussen van filteroppervlakken te ontgrendelen, en tenslotte tertiaire concentratie die resulteert in een 5-30 ml volume virusconcentraat. Om optimale concentratieprocedures te identificeren, werden twee verschillende elektropositieve filters geëvalueerd (een glas/cellulose filter [1MDS] en een nano-alumina/glas filter [NanoCeram]), evenals verschillende secundaire concentratietechnieken; de celite-techniek waarbij drie verschillende celite-deelgroottes werden geëvalueerd (fijn, medium en groot), gevolgd door een vergelijking van deze techniek met die van de gevestigde organische flocculatiemethode. Verschillende elutie-additieven werden ook geëvalueerd op hun vermogen om de afgifte van adeno-virus (AdV) deeltjes van filteroppervlakken te verbeteren. Fijne celite-deeltjes herstelden vergelijkbare niveaus van AdV40 en 41 als de gevestigde organische flocculatiemethode wanneer virale spikes werden toegevoegd tijdens secundaire concentratie. Het glas/cellulose filter herstelde hogere niveaus van zowel AdV40 als 41, vergeleken met een nano-alumina/glasvezelfilter. Hoewel niet statistisch significant, herstelde de toevoeging van 0,1% natriumpolyfosfaat gewijzigd runderextract eluaat 10% meer AdV-deeltjes vergeleken met ongewijzigd runderextract.

Inleiding

Human enterale virussen zijn belangrijke verwekkers van water overgebrachte ziekten ^1-3, maar zijn over het algemeen aanwezig in lage aantallen in vervuilde milieu wateren, het maken van hun detectie moeilijk zonder concentratie. Procedures gebruikt om virussen te concentreren typisch een filtratiestap, gevolgd door elutie filter en secundaire concentratie van het filter eluaat. Een gemeenschappelijke filtratie procedure berust op het gebruik van geladen membranen zoals elektropositieve filters (onlangs besproken in ^4,5). Deze filters vertrouwen op het vastleggen van virussen gesuspendeerd in water met behulp van elektrostatische interacties tussen het filter oppervlak (positief geladen) en gerichte virusdeeltjes (negatief geladen). Twee elektropositieve filters die commercieel verkrijgbaar zijn vertrouwen op deze technologie, de glas / cellulose en nano-alumina / glasvezelfilters. De glas / cellulose filter kosten tot 10 keer die van de nano-alumina / glasvezel, die het gebruik van het glas / ce beperkenllulose filters voor routine-virus monitoring. Recente studies hebben gesloten verschillen zijn nominale tussen deze twee filters in het herstel van enterovirussen van omgevingstemperatuur water ^6,7, rechtvaardigt het gebruik van een goedkopere filter alternatief. Andere filter opties zoals elektronegatieve en glaswol filters werden onderzocht, maar ze hetzij de voorbehandeling van bronwater (elektronegatieve filters) of niet in de handel verkrijgbaar (glaswol filters). De ontwikkeling van het virus concentratie procedures is vooral gericht op het optimaliseren van de primaire concentratie technieken (filters) om virus terugvorderingen verbeteren van water. Echter, secundaire concentratie procedures, waarbij het ​​volume van eluant verminderen meestal van 1 L tot volumes milliliters, kunnen ook een belangrijke impact op virus terugvorderingen ^8.

Secundaire concentratie van enterale virussen berust meestal op een uitvlokkingsmiddel zoals sommige soorten rundvlees extract (organische floccuning) of magere melk flocculatie ^9-12 om virusdeeltjes uit de filter oppervlakken te verwijderen. Recentelijk andere secundaire concentratieprocedure met vleesextract combinatie met de toevoeging van celiet (fijne deeltjes) blijkt belofte voor terugwinnen adenovirus, enterovirus en norovirus ^8,13,14. Celite concentratie werken onder dezelfde beginselen die van de biologische flocculatie werkwijze die virusdeeltjes hechten aan en vrijkomen uit deeltjes (vlokken of celite) Door het veranderen van de pH van de suspensie-oplossing. Vergelijkingen tussen deze twee secundaire concentratie technieken zijn geëvalueerd in het herstel van spiked adenovirus (adv) typen 40 en 41 ^8. Deze studie concludeerde dat de twee secundaire concentratie technieken waren statistisch vergelijkbaar in het herstel van adenovirussen. De biologische flocculatie methode vereist een 30 min. incubatie bij pH 3,5, terwijl de celite techniek vereist een kortere incubatie (10 min) bij pH 4,0. De organische flocculation vereist ook het gebruik van dure laboratoriumapparatuur (centrifuges) tot vlokken deeltjes verzamelen tijdens tertiaire concentratie, de celite techniek daarentegen worden alleen elementaire laboratoriumapparatuur (vacuümfiltratie) om celite deeltjes scheiden van suspensie.

Bepaalde combinaties van filters en secundaire elutietechnieken kan ook van invloed virus terugvorderingen. Een onderzoek werd geconcludeerd dat bepaalde combinaties van primaire (elektropositief filters) en secundaire concentratie technieken (celliet of organische flocculatie) had een belangrijke impact op herstel van adenovirus ^13. Deze bevindingen suggereren dat optimalisatie nodig om optimaal te herstellen doelwit virus uit een bepaalde watermatrix bij gebruik van deze technieken. Optimalisatie is een tijdrovend, lastig proces veel onderzoekers actief te vermijden, omdat tal van variabelen zal worden geëvalueerd (filter type / merk pH elutieoplossing, celliet / organische flocculatie).

Hiervoor study, een procedure die is ontwikkeld om optimale omstandigheden voor virus concentratie identificeren van water met behulp van spiked menselijk adenovirusstammen 40 en 41. Vermoedelijk, omdat elk type virus toont een unieke capside morfologie en specifieke capside lading, kan het nodig zijn concentratie protocollen worden geoptimaliseerd voor elk virus richten met het oog op een optimale virale herstel te bereiken. Deze studie geeft een aanpak voor adv 40 en 41 concentratie door: 1) het evalueren virus terugvorderingen in leidingwater met behulp elektropositief filter schijven gevolgd door 2) evaluatie van een gevestigde biologische flocculatie methode versus de celliet techniek als een secundaire concentratie, en 3) de evaluatie van elutiebuffers voor tertiaire concentratie.

Protocol

1. Voorbereiding van glaswerk en behuizingen Filter

1. Tenzij anders vermeld, steriliseren alle glaswerk, filterhuizen en oplossingen bij 121 ° C gedurende 15 min. Om de steriliteit te verzekeren, hebben betrekking op alle openingen of blootgestelde oppervlakken met ofwel aluminiumfolie of-tape vastgemaakt papier voorafgaand aan sterilisatie.
2. Assembleren filtratieinrichting door het aanbrengen van filterhuis (47 mm diameter) aan 1 L zijarm erlenmeyer. Verzamel filters nodig: 47 mm diameter elektropositief / elektronegatief disc filters.
3. Bereid 1 liter 1,5% vleesextract (flocculanten, produceert vlokken deeltjes bij pH van de oplossing wordt verlaagd tot 3,5 of non-flocculatie, die niet bij pH 3,5 heeft aggregaat), met 0,05 M glycine, door oplossen van 15 g vleesextract in 1 liter gedeïoniseerd water en toevoegen van 3,75 g glycine.
   OPMERKING: Niet-uitvlokkend rundvlees extracten zal de toevoeging van celliet voorafgaand aan tertiaire concentratie vereisen.
4. Voeg elutie additief natrium Polyphosphate rundvlees extract in een concentratie van 0,1%.
5. Voeg 1 M zoutzuur, druppelsgewijs, te mengen rundvlees extract, pH oplossing om de gewenste pH. Autoclaaf vleesextract gedurende 15-30 min bij 121 ° C.
6. Meet 0,1 g fijne, middelgrote of grote deeltje celliet (voor gebruik met niet-flocculanten rundvlees alleen extract).
7. Bereid vacuum / zuig door het aanbrengen van compatibele slang aan Erlenmeyer zijarm kolf en om het vacuüm uitlaat.

2. Voorbereiding van Solutions en Virus Stock

1. Bereid 1 L 1 M HCl.
2. Bereid 1 L 1 M NaOH.
3. Bereid 1x PBS-oplossing (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K ₂ PO ₄ en 4,3 mM NaH _{2PO 4).}
   1. Stel de pH van 1x PBS tot 9,0 met 1 M NaOH.
4. Bereiden en verdun voorraad virus tot 10 ⁴ -10 ⁵ meest waarschijnlijke aantal (MPN) ml ^-1 door het mengen van 1 ml van de virus met 9 ml PBS (pH7), zoals eerder beschreven ^8,13. Bewaren bij -80 ° C in 1 ml porties.
   1. Steriliseren virus voorraad door spuit filtering (0,22 pm poriegrootte) om mogelijke verontreinigingen te verwijderen.
5. Gedechloreerd Tap Water
   1. Maatregel 1 L steriel leidingwater met een steriele maatcilinder en giet het in een 2 L beker die magnetische roerstaaf.
   2. Voeg 0,7 g natriumthiosulfaat en meng tot granules lossen. Stel de pH van het leidingwater om 7-7,5 indien nodig met behulp van 1 M HCl of 1 M NaOH-oplossing.
   3. Dooi virus spike (1 ml) en voeg gehele volume van spike tot 1 L van gedechloreerd steriel leidingwater. Meng gedurende 10 min.
   4. Bereid een methode leeg (gedechloreerd leidingwater zonder adenovirus) met elk experiment en proces op dezelfde wijze als het verrijkte monster.

3. Bereiding van Millipore filterinrichting

1. Verwijder steriele deksel over het filterhuis. Verzekereneen goede fit tussen filterhuis bovenste kom en onderste filter scherm om monster lekken tijdens filtratie te voorkomen.
2. Verwijder steriele afdekking van 1 L erlenmeyer. Zorg ervoor dat de kurk van de filter unit past precies in de bovenste opening van de Erlenmeyer, het creëren van een goede afdichting.
3. Verwijder de bovenste kom van filtereenheid uit lagere filter scherm, en plaats 47 mm elektropositief filter schijf vierkant op het scherm met een steriel pincet. Bevestig filterhuis kom naar onderkant scherm en sluit het door het draaien tegen de klok in.

4. Tap Water Filtration (Primary Concentratie)

1. Meet 100 ml van het virus spiked kraanwater met steriele maatcilinder.
2. Giet 100 ml van het virus spiked kraanwater in filterhuis die ofwel een 47 mm geplooid glas / cellulose filter of een nano-alumina / glasvezel schijf filter.
3. Laat het water langzaam passeren filter. Pas lichte vacuüm om de resterende resten te verwijderen of leidingwater uit filter oppervlak.
4. Bij gebruik van trypsine behandeling, voeg 5 ml van 0,25% trypsine aan Oppervlaktefilter en incubeer gedurende 5 min.
5. Was trypsine uit filter oppervlak met behulp van 50 ml steriel gedeïoniseerd water.

5. Virus elutie uit Filter

1. Verwijder filter behuizing van 2 L Erlenmeyer, en de plaats op 250 ml side-arm kolf.
2. Meet 100 ml van rundvlees extract met behulp maatcilinder. Giet langzaam 100 ml van rundvlees extract in filterhuis.
3. Laat vleesextract te gieten door het filter, vastleggen vleesextract in een klein (250 ml) Erlenmeyer kolf. Toepassing vacuüm te trekken door middel van resterende rundvlees uittreksel uit filter.

6. Celite Secundaire Concentratie

1. Transfer kolven met de uitgewassen virussen aan een roer plaat. Voeg steriele magnetische roerstaaf en plaats op roerplaat, mengen tot lichte vortex creëren.
2. Voeg 0,1 g celitepoeder tot 100 ml van rundvlees extract en laat celliet te verspreiden. Plaats steriele pH-sonde in rundvlees extract.
3. Voeg druppelsgewijs 1 M HCl tot vleesextract om pH 4,0 te bereiken. Laat roerend gedurende 10 min.
4. Plaats 47 mm voorfilter op filterbehuizing (zoals eerder beschreven) met een 2 L Erlenmeyer kolf.
5. Pour vleesextract / celite mengsel van 100 ml gedurende voorfilter. Laat rundvlees extract door te gieten. Oefen lichte vacuüm te trekken door middel van resterende rundvlees uittreksel uit filter.
6. Plaats metalen buis clip aan het einde van het filterhuis uitloop. Bevestig steriele 15 ml polypropyleen collectie buis metalen buis clip. Plaats filterhuis terug in erlenmeyer.
7. Voeg 5 ml 1x PBS, pH 9,0 over celite verzameld op de pre-filter.
8. Laat PBS te druppelen door middel van pre-filter. Oefen lichte vacuüm te trekken door middel van de resterende PBS in 15 ml collectie buis.

7. Biologische Flocculatie Secundaire Concentratie

1. Breng de bekers die het geëlueerde virus naar een roerplaat. Voeg steriele magnetische roerstaaf tot 100 ml van rundvlees extract en meng tot lichte vortex creëren.
2. Plaats steriele pH-sonde in rundvlees extract.
3. Voeg 1 M HCl druppelsgewijs aan rundvlees-extract en de pH op 3,5. Meng gedurende 30 min.
4. Giet het eluaat in 250 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 2500 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
5. Giet supernatant maar zorg er voor dat u de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 5 ml 1x PBS, pH 9.
6. Centrifugeer de suspensie bij 4000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet het supernatant en de pellet weggooien.
7. Stel de pH 7-7.5, filter gesteriliseerd door 0,22 urn spuitfilter en bevriezen bij -80 ° C.

8. Virale Nucleïnezuur Extraction

1. Extract virale nucleïnezuren met een geschikte commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.

9. AdV 40/41 qPCR

1. Gebruik primers en probes, evenals reactiemengsel en thermische cycli profielen gepubliceerd ^8,13.
   OPMERKING: Geschatte detectiegrens van de test is ongeveer 5 qPCR eenheden per reactie.
2. Componenten van PCR-amplificatie mengsels Voeg bij concentraties als volgt: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCI, 4,5 mM _MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 uM primers en 1 pM probe en 0,5 pl polymerase zodat eindvolume van 45 pl kunnen passende aantal putten toegevoegd in een 96-wells PCR reactieplaat.
3. Belasting 45 pi PCR amplificatie mengsel aan elk geschikte putje van een 96 putjes, snelle reactie PCR plaat.
4. Voeg 5 ul geëxtraheerd DNA monster aan geschikte putjes van de PCR-plaat.
5. Bedek plaat met hittebestendige deksel afdichting, draai de plaat om eventuele druppels verhuizen naar onderkant van PCR-plaat putten.
6. Stel PCR amplificatiecycli als follows: 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min.

10. Gegevens Analyses

1. Analyseer drievoudige metingen van de seriële 5-voudige verdunningen van de monsters overspant 1: 5 tot 1: 625 verdunning assortiment naar de meest waarschijnlijke aantal (MPN) van de virale deeltjes te bepalen, zoals eerder beschreven ^8,13.
2. Analyseer seriële 5-voudige verdunningen van adenovirus experimentele spikes spanning 1: 5 tot 1: 15.625 verdunning assortiment naar de meest waarschijnlijke aantal (MPN) van de virale deeltjes te bepalen.
3. Met behulp van de EPA MPN rekenmachine (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), passen de rekenmachine om rekening te houden met het type van verdunning (1: 5 of 1:10), het aantal verdunningen uitgevoerd, en het aantal repliceren monsters in verdunningsreeks.
4. Voer ₁₀ log transformatie van de gegevens, gevolgd door het normaliseren van een volume-eenheid (bijvoorbeeld 1 ml, 100 ml, etc. ). Bereken terugvorderingen voor gegeven experiment door te delen aantal virale deeltjes in het monster concentraten met aantal virale deeltjes in experimentele spikes.
5. Evalueer het effect van de verschillende experimentele variabelen (bijvoorbeeld verschillende soorten celite, pH-trajecten, verschillende filter en verschillende secundaire concentratietechnieken) op AdV terugwinning door het uitvoeren van parametrische en niet-parametrische statistische testen (bijvoorbeeld gepaarde t-test, één of twee -weg ANOVA) afhankelijk van de verdeling van de gegevens en de experimentele opzet.

Resultaten

Celliet selectie

Drie verschillende types van celite werden getest voor de selectie van de best presterende variant. Celites met fijne tot middelgrote deeltjes die de hoogste adenovirus terugvorderingen. Het gebruik van grotere celites resulteerde in lagere realisaties zowel AdV40 en 41 (tussen 32% -100%) (Figuur 1). Gemiddeld terugvorderingen van adenovirus 40 waren 144% ± 52% (fijn), 115% ± 28% (gemiddeld) en 82% ± 53% (groot) deeltje celites en voor AdV41, 132% ± 39...

Discussie

Elektropositief filters zijn nuttig bij het concentreren van virussen uit het water; maar deze filters kunnen verschillen in hun structuur en samenstelling die op hun beurt kunnen veranderen hun doeltreffendheid. Compounding dit probleem, capside structuren en kosten variëren tussen de virusstammen die concentratie vereisen technieken worden afgestemd op optimaal herstel ¹⁵ te verzekeren. Door eenvoudige aanpassingen van de bestaande concentratie technieken (bijv elektropositieve filters, vleesextrac...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adenovirus 40 stock	ATCC	VR-931
Adenovirus 41 stock	ATCC	VR-930
Sodium Thiosulfate	Fluka Chemical Co.	72051
Celites #577	Fluka Chemical Co.	22142
NanoCeram 47 mm	Argonide	N/A
1MDS 47 mm	3M	6408502
AP-20 Prefilter 47 mm	Millipore Corp.	AP2004700
Glycine	Sigma	50046-1KG
Sodium Polyphosphate	Acros Organics	390930010
Trypsin	Gibco	25200
PBS	Sigma	P5368
Hydrochloric Acid	Fisher	A481-212
BBL Beef Extract	BD Biosciences	212303
Difco Beef Extract	BD Biosciences	211520
ABI 7900 Real-time PCR system	ABI	N/A
Stainless Steel Filter Housing	Millipore Corp.	XX2004720
Blood DNA Extraction Kit	Qiagen	51104
EPA MPN Calculator			http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html