Methodenartikel

Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

DOI:

10.3791/51748

⸱

9 augustus 2014

 ,  , 
1University Clinics for Child and Adolescent Psychiatry, University of Zürich

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verbeterde in vitro neurotoxiciteitstesten zouden helpen bij het identificeren van nieuwe neuroprotectieve verbindingen. De bruikbaarheid van een real-time impedantie-gebaseerde celanalysator om cytotoxiciteit en cytoprotectie in neuronale cellijnen te bepalen en om de betrokkenheid van tweede boodschapperroutes te bepalen, waardoor inzicht wordt verkregen in het mechanisme van neuroprotectie, wordt gepresenteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel hersenen gerelateerde aandoeningen hebben neuronale celdood betrokken bij hun pathofysiologie. Verbeterde in vitro modellen voor neuro-of neurotoxische effecten van drugs en ​​downstream pathways die betrokken zou helpen inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen van neuroprotection / neurotoxiciteit en kan mogelijk de ontwikkeling van geneesmiddelen te vergemakkelijken bestuderen. Echter, veel van de bestaande in-vitro-toxiciteit testen hebben grote beperkingen - de meeste beoordelen neurotoxiciteit en neuroprotection op een enkel tijdstip, niet toe te staan ​​om het tijdsverloop en de kinetiek van het effect waarnemen. Bovendien zou de mogelijkheid om informatie over de downstream signaling pathways betrokken bij zenuwbescherming in real-time verzamelen van groot belang zijn. In het huidige protocol beschrijven we het gebruik van een real-time impedantie gebaseerde cell analyzer neuroprotectieve effecten van serotonine 2A (5-HT2A) receptor agonisten in een neuronale cellijn onder-label vrij en real-time condit bepalenionen met impedantiemetingen. Verder tonen we aan dat remmers van second messenger pathways kan worden om downstream moleculen betrokken bij de neuroprotectieve effect bakenen. We beschrijven ook de bruikbaarheid van deze techniek te bepalen of een effect op celproliferatie bij tot een waargenomen neuroprotectieve effect. Het systeem maakt gebruik van speciale micro platen aangeduid als E-platen die bevatten afwisselend gouden micro-elektrode arrays aan de onderkant van de putjes, die als mobiele sensoren. De impedantie uitlezing wordt gemodificeerd door het aantal hechtende cellen, cellevensvatbaarheid, morfologie en hechting. Een dimensieloze parameter genaamd Cell Index is afgeleid van de elektrische impedantiemetingen en wordt gebruikt om de status cel bevindt. Over het algemeen, de real-time-impedantie gebaseerde cel analyser zorgt voor real-time, label-free beoordeling van neuroprotectie en neurotoxiciteit, en de evaluatie van de second messenger pathways betrokkenheid, bij te dragen aan meergedetailleerd en high-throughput worden mogelijke neuroprotectieve verbindingen in vitro, voor het selecteren therapeutische kandidaten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronale celdood speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele hersenen gerelateerde aandoeningen 1. De beschikbaarheid van betrouwbare en high-throughput in vitro de toxiciteit testen is van cruciaal belang om een beter inzicht te krijgen in de mechanismen van neurotoxiciteit en te helpen selecteren neuroprotectieve moleculen als therapeutische kandidaten in de ontwikkeling van geneesmiddelen 2. Er zijn veel beperkingen meest gebruikte in vitro neurotoxiciteit assays.They beoordelen neurotoxiciteit / neuroprotectie op een tijdpunt niet toestaan ​​kinetische resolutie; vaak gebruik etiket of probe die kan interfereren met de signaalwegen en beperken aanvullende studies in dezelfde celpopulatie en die vaak arbeidsintensief, en in veel gevallen niet voorzien mechanistisch inzicht. In de onderhavige studie tonen we het nut van een real-time impedantie gebaseerde cell analyzer neurotoxiciteit en neuroprotectie in een neuronale cellijn in real-time en onder bepalen labelvrijeomstandigheden en om inzicht te geven in downstream mechanismen door middel van analyse van de second messenger pathways betrokken bij de werking.

Eerdere studies hebben de geldigheid van de real-time cell analyzer bevestigd cytotoxiciteit en effecten op celproliferatie in cellijnen vastgesteld in vergelijking met standaard technieken 3,4,5,6. Zo werd een goede correlatie waargenomen tussen uitlezingen van de standaard cellevensvatbaarheid WST-1 test en Cell Index waarden op verschillende tijdstippen onder basale omstandigheden proliferatie en na twee verschillende toxische paradigma in HeLa-cellen 3. In A549 en MDA-MB-231 cellen proliferatie en cytotoxiciteit uitgelokt met de microtubuli stabilisator paclitaxel toonde zeer vergelijkbaar waarden wanneer beoordeeld door Cell Index metingen en het standaard gebruikte sulforhodamine B (SRB) test 4. In de neuronale cellijn van geïmmortaliseerde hippocampale neuronen werden HT-22 Cell Index metingen gevalideerd op hun vermogen to detecteren celproliferatie, glutamaat cytotoxiciteit en celbescherming tegen de gebruikte 3-(4,5-dimethyl-2-yl) 2,5-difenyltetrazolium-bromide (MTT) test 5. In dezelfde studie de MTT assay resultaten en Cell Index metingen ook goed gecorreleerd meten neuronale progenitorcellen proliferatie, cytotoxiciteit na groeifactoren ontbering en redden van cytotoxiciteit door de pan-caspase inhibitor QVD 5. Cytotoxiciteit geïnduceerd in NIH 3T3 cellen door Vandetanib (vasculaire endotheliale groeifactor receptor en epidermale groeifactor receptor remmer) een vergelijkbaar resultaat gemeten Cell Indexwaarden of neutrale rode opname test 6.

We hebben onlangs gebruikt de real-time cell analyzer systeem neuroprotectieve effecten van serotonine 2A beoordelen (5-HT2A) receptor agonist (±) -2,5-dimethoxy-4-joodamfetamine hydrochloride (DOI) in een neuronale cellijn ( SK-N-SH cellen) en gescreend op de betrokkenheid van second boodschapper paden door het monitoren van de effecten van hun chemische remming van de waargenomen neuroprotection 7. Interessant is dat de 5-HT2A receptor zowel hallucinogene nonhallucinogenic agonisten (zoals DOI en lisuride, respectievelijk), die zowel de gemeenschappelijke en specifieke second messenger pathways 8 kan activeren.

De voordelen van de voorgestelde techniek is dat het mogelijk maakt om real-time informatie over celoverleving verzamelen gedurende de dag, af te bakenen tweede messenger pathways betrokken, de mogelijke bijdrage van proliferatie effecten neuroprotectie beoordelen en om een ​​optimale tijd selecteren extra eindpunt studies op dezelfde celpopulatie. Een schematisch diagram van de werkstroom in het huidige protocol is weergegeven in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bereiding 1

  1. Plaats station de real-time cell analyzer in een weefselkweek incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2. Voer alle celcultuur behandeling en farmacologische behandelingen in een weefselkweek kap onder steriele omstandigheden.
  2. OPMERKING: neuronale cellijnen vereisen verschillende temperatuur instellingen in vergelijking met standaard voorwaarden voor cultuur, moet dienovereenkomstig worden aangepast. Voor zwak hechtende cellijnen gebruikt bekledingsmiddelen om de interactie van cellen met de gouden micro-elektroden in de bodem van de putjes van de E-plaat 96 te vergemakkelijken.
  3. Bereid 1000x voorraadoplossingen van de farmacologische samenstelling voor celkweek behandeling (neuroprotectieve middelen of second messenger pathways remmers in het geschikte oplosmiddel - dimethylsulfoxide of steriel water) en opgeslagen bij -20 ° C. Gebruik het oplosmiddel voertuig de volgende behandelingen.
  4. Cultuur humane neuroblastoma SK-N-SH cellen in DMEM / F12 medium aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) (proliferatie medium) in culturele flesjes met 175 cm2 oppervlak dichtheid van ongeveer 75%. Houd celpassagegetal binnen een bereik (van ongeveer 10 passages) om de consistentie tussen de experimenten vast te stellen in termen van snelheid van celproliferatie en de respons op cytotoxiciteit. Lagere passage nummers voorkeur.
  5. Was de hechtende SK-N-SH cellaag met PBS en trypsinize met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer de cellen bij 170 xg gedurende 5 minuten tot trypsine te verwijderen. Resuspendeer de cellen in 10 ml proliferatie medium. Tel de cellen met Scepter celgetalmeter en stel het aantal cellen tot 300.000 cellen / ml door verdunning van cellen met proliferatie medium.

2 Plating en verspreiding van SK-N-SH cellen

  1. Voeg 100 ul proliferatie medium aan elk putje van de E-Plate 96 en laat het gedurende 30 minuten in de weefselkweek kap bij RT in evenwicht. Plaats de E-Plate 96 in real-time cell analyzer station in de CO2 incubator bij 37 ° C.
  2. Start de real-time cell analyzer software. Op de pagina Opmaak selecteert de putten in het experiment en het invoeren in de invoervakken de informatie over het type cel, mobiele nummer, namen en concentraties van chemische verbindingen gebruikt voor cel behandeling.
    OPMERKING: Voor de toepassing van dit protocol ten minste 4 replica's worden aanbevolen voor elke behandeling.
  3. Op het schema software pagina bepalen "stappen" in het experiment, door het selecteren van het aantal sweeps meetcel Index en de interval tussen de slagen voor elke stap. Sinds Stap 1 is vooraf bepaald voor de achtergrond meten, selecteert u "Voeg een stap" en zet stap 2 om de Cell Index meet elke 15 minuten voor 96 uur.
    OPMERKING: Voor behandelingen, waarbij effecten met snelle kinetiek worden verwacht, stelt veegt met kortere tussenpozen.
  4. Klik op Start om het automatisch vooraf Stap initiëren 1en meet de achtergrond impedantie van de media. Deze waarde wordt automatisch afgetrokken door de software op elk gegevenspunt als de cellen worden toegevoegd aan de putjes.
  5. De eerder bereid in stap 1.5) celsuspensie van 300.000 cellen / ml in proliferatie medium. 30.000 cellen / putje voor celtoxiciteit / neuroprotectie studies en 15.000 cellen / putje voor celproliferatie studies. Neem de E-Plate en voeg 100 ul celsuspensie per putje voor cel toxiciteit / neuroprotection studies en voeg 50 ul celsuspensie en 50 ul proliferatie medium per putje voor celproliferatie studies. Het aantal cellen per putje te worden geoptimaliseerd voor elke cellijn empirisch.
  6. Zwenk de E-Plate 96, zelfs voor beplating van de cellen. Laat de E-plaat 96 voor 30 min in weefselkweek kap bij kamertemperatuur om de cellen gelijkmatig bezinken naar de bodem van de putjes.
  7. Plaats de E-plaat 96 in de real-time mobiele analyzer station en start stap 2 op het schema pleeftijd. Monitor Cell Index waarden gedurende het experiment door het bekijken van de cel bochten op de Plot-pagina en de ruwe Cell Index gegevens over de Cel Index pagina van de software.

3 serumdeprivatie

  1. 24 uur na plating de cellen, te pauzeren het experiment, en verwijder de e-Plate 96 van de real-time mobiele analyzer station. Verdun tweede messenger remmers van 1000x aandelen met DMEM / F12 serumvrij medium - 200 x de eindconcentratie. Behandel cellen met 1 pl remmers van second messenger pathways worden getest voor hun betrokkenheid bij neurotoxiciteit / neuroprotection 30 minuten voor het begin van de cytotoxiciteit, de respectieve paden remmen. Zet de E-Plate 96 naar het station en hervatten experimentele Cell Index metingen.
  2. Na 30 minuten te pauzeren het experiment. Verwijder voorzichtig proliferatie medium volledig uit de E-Plate 96 wells met een pipet (of multi-channel pipet), het verzorgen van het aanhangend cellaag niet te verstorendoor het richten van de rand van de pipetpunt om de hoek van de put. Voeg 200 ul / putje serumvrij DMEM / F12 medium (serum deprivatie medium). Zorgen voor snelle uitwisseling van celkweekmedium mechanische agitatie van de cellen te minimaliseren.
  3. Verdun verbindingen worden getest op hun neuroprotectieve effecten van 1000x stock met serumvrij DMEM / F12 medium 200 x de eindconcentratie. Voeg 1 ul verbindingen worden getest op hun neuroprotectieve effecten en 1 pl remmers van second messenger pathways in de afzonderlijke putjes volgens proefopzet.
  4. In cellen voor proliferatie studies niet medium veranderen. Verdun te testen verbindingen van 1000x stock 200 x de eindconcentratie in proliferatie medium, behandel met 1 ul per putje en blijven cultuur in proliferatie medium.
  5. Hervat het experiment voort te zetten met de Cel Index metingen om de 15 minuten voor 96 uur zoals eerder ingesteld.

4 Data Abestudeert de analyse

  1. Voor neurotoxiciteit / neuroprotection gegevens normaliseren Cell Index om het laatste tijdstip voordat farmacologische behandeling of medium verandering om de variatie tussen de experimenten te verminderen door "genormaliseerd Cell Index" te selecteren en "normaliseren tijd" op het perceel pagina.
  2. Markeer de putten op de Plot-pagina voor de experimentele condities van de rente en klik op "Add" om de genormaliseerde Cell Index curves plotten. Let op de kinetiek van de neurotoxische / neuroprotectieve effect, of van second messengers remming als genormaliseerde Cell Index curves als functie van de tijd.
  3. Neem de cel Index curves voor de geteste geneesmiddel behandelingen proliferatie medium als functie van de tijd te beoordelen of een effect op de proliferatie is betrokken bij de neuroprotectieve / neurotoxische effect.
  4. Exporteer de experimentele informatie voor alle Cell Index tijdstippen van de Cel Index software pagina in een Excel-bestand met statistische evaluatie van de resultaten starten
    OPMERKING: Als een eerste stap in de statistische analyse van een reeks van gemodificeerde MATLAB programma's die de Welch t-test te gebruiken, met de p-waarde uitgezet semilogarithmically, gebruik maken van omgekeerde as tegen de tijdschaal (verstrekt als aanvullende code-bestanden). Deze programma waarmee de aanwezigheid van p-waarden over het tijdsverloop van een volledige real-time cell analyzer experiment en daarmee de selectie van tijdstippen voor gedetailleerdere statistische analyse steun. Zie het aanvullend materiaal voor gedetailleerde informatie over de programma's.
  5. Voor statistische analyse van de verschillen in de cel Index waarden onder verschillende behandeling omstandigheden op specifieke tijdstippen, selecteer Cel Index waarden bij respectieve tijdstippen van de geëxporteerde Excel-bestand. Analyseer de Cel Index waarden voor de geselecteerde tijdstippen met one-way of twee-weg variantie-analyse (ANOVA), gevolgd door een post-hoc test met statistische software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serumdeprivatie leidt tot afname Cell Index waarden, die continu kan worden bewaakt met de real-time cell analyzer

Neurotoxische stimuli om de cellen leidt tot een afname in Mobiele Index waarden die kunnen worden gemonitord in real-time de gepresenteerde techniek en de dynamiek van die afhankelijk van de specifieke neurotoxische stimulus en de celtype onderzocht. Figuur 2 toont de stijging cel Index toen SK-N-SH cellen worden gekweekt in medium prolif...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol presenteert het nut van een real-time mobiele analyzer om continu en onder-label-vrije omstandigheden de neuroprotectieve / neurotoxische effecten van verbindingen in neuronale cellijnen te beoordelen en om inzicht te krijgen in de tweede boodschapper die betrokken zijn bij de werking.

Hoewel het nut real-time cell analyzer tot cytotoxiciteit en de effecten van geneesmiddelen op celproliferatie studie wordt algemeen erkend, slechts enkele studies in neuronale verwante ce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Publicatiekosten voor de huidige video-artikel werd gesponsord door "ACEA Biosciences".

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiële ondersteuning voor de experimenten die in het onderzoek worden gepresenteerd, werd verstrekt door het Marie Heim-Vögtlin programma van de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting.

We danken mevrouw Johanna Nyffeler voor het ontwikkelen van een reeks aangepaste MATLAB-programma's voor het screenen op statistisch significante verschillen in real-time cell analyzer’s gegevens en Dr. Yama Abassi voor de nuttige discussie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
xCELLigence  RTCA SP system bundleACEA BiosciencesNr: 00380601030Bestaat uit RTCA Analyzer, RTCA SP Station en RTCA Control Unit
E-plate 96ACEA BiosciencesNr: 05232368001Voor het kweken van de cellen, geplaatst in de RTCA SP Station
SK-N-SH cellenATCC (in samenwerking met LGC Standards)HTB-11Kan worden vervangen door een andere belangrijke neuronale cellijn
DMEM/F12 Sigma-AldrichD8437Cellenkweekmedium
Foetaal bovien serumLife Technologies16140-063Aanvulling op proliferatie, maar geen serumvrij medium
Weefselkweekflacon T175Sarstedt83.1812.302Voor het kweken van cellen, die later op de E-Plate 96 worden geplaatst
0,05% Trypsin-EDTALife Technologies25300-054Voor het trypsiniseren van cellen gekweekt in weefselkweekflessen
Scepter 2.0 celtellerMerck MilliporePHCC20060Automatische celteller
Fosfaat-gebufferde zoutoplossingLife Technologies10010-015Voor het wassen van de cellen
(±)-DOI hydrochlorideSigma-AldrichD1015-HT2A agonist voor celkweekbehandeling
LY-294002 hydrochlorideSigma-AldrichL9908PI3-K remmer voor celkweekbehandeling
Lisuride maleaatTocris Bioscience4052Verbinding met 5-HT2A agonistische activiteit voor celkweekbehandeling
DimethylsulfoxideSigma-AldrichD4540Voor het oplossen van LY-294002 en lisuride maleaat

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
  2. Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Protection Agency. (2007).
  3. Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
  4. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  5. Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
  6. Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
  7. Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
  8. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  9. Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
  10. Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
  11. Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Real time impedantieanalysesecond messengerroutesbeoordeling van neuroprotectiemeting van de celindexE Plate technologielabelvrije monitoringserotonine 2A receptorbijdrage aan proliferatiestatistische analyse

Gerelateerde artikelen