Methodenartikel

Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

18.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51757

⸱

7 november 2014

 , 
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnamen van geïdentificeerde remmende interneuronen in de geanesthetiseerde muiscortex. Neuronen die ChR2 tot expressie brengen, worden geïdentificeerd door hun reactie op blauw licht. De methode maakt gebruik van standaard extracellulair opname-apparatuur en dient als een goedkope alternatief voor calcium-beeldvorming of visueel geleid patchen.

Samenvatting

Een grote uitdaging neurofysiologie is de responseigenschappen en functie van vele celtypen remmende kenmerken in de cerebrale cortex. We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van een stabiele, goed geïsoleerde single-unit registraties van geïdentificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muis cortex met behulp van een methode die is ontwikkeld door Lima en collega's 1. Opnames worden uitgevoerd in muizen die Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifieke neuronale subpopulaties. De leden van de bevolking worden geïdentificeerd door hun reactie op een korte flits van blauw licht. Deze techniek - aangeduid als "PINP", of fotostimulatie ondersteunde Identificatie van Neuronal Populaties - kan worden uitgevoerd met standaard extracellulaire opnameapparatuur. Het kan dienen als een goedkoop en toegankelijk alternatief calcium imaging of visueel geleide patches, voor de targeting extracellulaire registraties genetisch geïdentificeerde cellen. Here bieden wij een set van richtlijnen voor het optimaliseren van de methode in de dagelijkse praktijk. We verfijnd onze strategie specifiek voor het richten parvalbumine-positieve (PV +) cellen, maar hebben ontdekt dat het werkt voor andere soorten interneuron als goed, zoals somatostatine uiten (SOM +) en-calretinin uiten (CR +) interneuronen.

Inleiding

Het karakteriseren van de talloze celtypen die het zoogdierbrein vormen, is een centraal, maar lang ongrijpbaar doel van de neurofysiologie geweest. De eigenschappen en functie van verschillende remmende celtypen in de hersenschors zijn bijvoorbeeld onderwerpen van groot belang, maar zijn nog relatief onbekend. Dit komt deels omdat conventionele blinde in vivo opnametechnieken beperkt zijn in hun vermogen om verschillende celtypen te onderscheiden. Extracellulaire spikebreedte kan worden gebruikt om veronderstelde parvalbumine-positieve remmende neuronen te scheiden van excitatoire piramidecellen, maar deze methode is onderhevig aan zowel type I als type II fouten2,3. Als alternatief kunnen opgenomen neuronen worden gevuld, hersteld en gekleurd om later hun morfologische en moleculaire identiteit te bevestigen, maar dit is een pijnlijk en tijdrovend proces. Onlangs zijn genetisch geïdentificeerde populaties van remmende interneuronen toegankelijk geworden door middel van calciumbeeldvorming of visueel geleide patch-opnames. In deze benaderingen maakt virale of transgene expressie van een calcium reporter (zoals GCaMP) of fluorescente proteïne (zoals GFP) identificatie en karakterisering mogelijk van celtypen die worden gedefinieerd door promotorexpressie. Deze benaderingen gebruiken 2-foton microscopie, die dure apparatuur vereist, en zijn ook beperkt tot oppervlakkige corticale lagen vanwege de lichtverstrooiende eigenschappen van hersenweefsel.

Onlangs ontwikkelden Lima en collega's1 een nieuwe toepassing van optogenetica om elektrofysiologische opnames te richten op genetisch geïdentificeerde neuronale typen in vivo, genaamd “PINP” – of Fotostimulatie-geassisteerde Identificatie van Neuronale Populaties. Opnames worden uitgevoerd bij muizen die Channelrhodopsin-2 (ChR2) tot expressie brengen in specifieke neuronale subpopulaties. Leden van de populatie worden geïdentificeerd door hun reactie op een korte flits blauw licht. In tegenstelling tot veel andere optogenetische toepassingen, is het doel niet om de circuitfunctie te manipuleren, maar simpelweg neuronen te identificeren die behoren tot een genetisch gedefinieerde klasse, die vervolgens kunnen worden gekarakteriseerd tijdens normale hersenfunctie. De techniek kan worden geïmplementeerd met standaard extracellulaire opnameapparatuur en kan daarom dienen als een toegankelijke en goedkope alternatief voor calciumbeeldvorming of visueel geleide patchen. Hier beschrijven we een benadering voor PINPing van specifieke celtypen in de verdoofde auditieve cortex, met de verwachting dat de meer algemene punten bruikbaar kunnen worden toegepast in andere preparaten en hersengebieden.

In de cortex biedt PINP bijzondere belofte voor het onderzoeken van de in vivo responseigenschappen van remmende interneuronen. GABAerge interneuronen omvatten een kleine, heterogene subset van corticale neuronen4. Verschillende subtypen, gemarkeerd door de expressie van specifieke moleculaire markers, zijn recentelijk getoond om verschillende computationele rollen in corticale circuits uit te voeren5-9. Naarmate genetische tools verbeteren, kan het uiteindelijk mogelijk zijn om morfologisch en fysiologisch scheidbare typen te onderscheiden die binnen deze brede klassen vallen. We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnames van geïdentificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muiscortex. Deze strategie werd specifiek ontwikkeld voor het targeten van parvalbumine-positieve (PV+) cellen, maar we hebben gevonden dat het ook werkt voor andere interneurontypen, zoals somatostatine-expresserende (SOM+) en calretinine-expresserende (CR+) interneuronen. Hoewel PINPing conceptueel eenvoudig is, kan het in de praktijk verrassend onbuigzaam zijn. We hebben een aantal tips en trucs geleerd door middel van trial-and-error die nuttig kunnen zijn voor anderen die de methode proberen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het volgende protocol is in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen, zoals goedgekeurd door de Universiteit van Oregon Animal Care en gebruik Comite.

1. Acute Chirurgie

  1. Verdoven van het dier met een ketamine-medetomidine cocktail via intraperitoneale (ip) injectie (Tabel 1).
    OPMERKING: De muizen gebruikt in deze experimenten worden gegenereerd door het kruisen van een cre-afhankelijke ChR2-eYFP transgene Line10 bestuurder lijnen (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +) interneuron. Virale levering van ChR2 of aanverwante opsins moet even goed werken, in de veronderstelling soortgelijke uitdrukking niveaus worden verkregen.
  2. Voor het begin van de operatie, ervoor te zorgen dat het dier vertoont geen reactie op een zachte teen knijpen. Opnieuw toedienen anesthetica gehele experiment noodzakelijk om deze diepte van de anesthesie te handhaven. Als injecteerbare anesthetica, eventueel implanteren ip katheter onderhoud injecties.
  3. Houd het dier gehydrateerd met zoutoplossing of Ringer lactaat gehele experiment (ongeveer 3 ml / kg / uur), bij voorbeeld met behulp van een geschikt verdund verdoving cocktail voor onderhoud injecties (Tabel 1).
  4. Plaats het dier in een stereotaxisch of andere head-apparaat voor het houden. Zorg ervoor dat de schedel is goed beveiligd. Dit is essentieel voor het behoud van stabiele single cell opnames.
  5. Breng opthalamic zalf voor de ogen droog voorkomen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 36,5-37 ° C.
  6. Voer een cisternal drain voor extra opname stabiliteit. Met behulp van een scalpel, verwijdert weefsel uit de achterste gezicht van de schedel naar de cisterna magna bloot. Maak een kleine inkeping in de dura aan de cerebrospinale vloeistof af te tappen. Gebruik alleen het uiterste puntje van het mes, en vermijd contact opnemen met de kleine hersenen of hersenstam.
  7. Met de scalpel Voer een kleine craniotomie (~ 2 mm 2) over de corticale interessegebied (voor auditievecortex, ruwweg -2,3 mm posterior van bregma, 4,5 mm lateraal van de middellijn).
  8. Verwijder de dura en bedekken de blootgestelde cortex met een laag warm agarose 0,5-1 mm dik (1,5% agarose in zoutoplossing, 0,9% NaCl; toepassing bij ~ 37 ° C). Houd de agarose vochtig gedurende het experiment door het periodiek aanbrengen van enkele druppels zoutoplossing.

2. Opname Set-up

  1. Bereid een wolfraam elektrode (7-14 MQ, 127 micrometer diameter, 12 ° conische tip, epoxy-coating). Superlijm de elektrode een glazen capillaire buis en voeg krimpkous grip (figuur 1).
  2. Monteer de elektrode op een gemotoriseerde (of hydraulische) micromanipulator, ingesteld orthogonaal te reizen naar het corticale oppervlak. Schuif een draad grond onder de huid, tegen de schedel. Contact met de spieren aan de zijkant van het hoofd en de nek ze elektromyografische artefacten kunnen genereren.
  3. Versterken het elektrische signaal met een extracellulair versterkerli fi er geschikt voor single-unit opnemen, bij voorkeur uitgerust met een impedantie check mode. Monitor lopende stekelige activiteit (band pass 300 - 5.000 Hz) met twee oscilloscopen en een set actieve luidsprekers. Hier worden de opgenomen data continu gedigitaliseerd met een sampling rate van 10 kHz; spikes zijn offline gehaald.
  4. Vooraf de elektrode door de agarose totdat de punt het oppervlak van de cortex bereikt. Observeer deze stap door een microscoop. "Zero" deze positie op de micromanipulator.
  5. Om zo goed benaderen de diepte van opname visueel bevestigen dat de elektrode verlaat het corticale oppervlak op een diepte van nul herroeping de elektrode aan het einde van een penetratie.
    OPMERKING: een discrepantie tussen de manipulator lezen en de waargenomen elektrodepositie blijkt dat ten opzichte van het weefsel afgedreven. Dit kan worden veroorzaakt door instabiliteit van de hersenen of dier of manipulator drift.
    1. Als extra controle om te verzekeren datDeze zero set-point komt overeen met de oppervlakte van de cortex, monitor-stimulus evoked potentials veld en bevordert tegelijk door de eerste paar honderd micrometer van weefsel. Bij het bewaken van potentials veld, hoe lager de onderste band-pass filter cutoff van de extracellulaire versterker tot 10 Hz. Controleer of de polariteit van de plaatselijke veldpotentiaal keert ongeveer een diepte van ~ 100 urn, bij layer I / II grens 13. Dit is een betrouwbaar referentiepunt voor auditieve cortex, maar eventueel voor andere corticale gebieden.
  6. Monteer een optische vezel gekoppeld met een blauwe lichtbron (figuur 2) op een handmatige micromanipulator. Gebruik van de microscoop, plaats het uiteinde van de vezel nabij het oppervlak van de agarose mogelijk. Centreer de balk waar de elektrode het weefsel zullen betreden.
  7. Regel de uitvoer van de lichtbron met een besturingseenheid die in staat is een TTL (transistor-transistor logica) pulstrein opgegeven breedte en DUURn- bijvoorbeeld een Arduino (figuur 3), een computer I / O-kaart (zoals getoond), of een commercieel verkrijgbaar pulsgenerator.
    1. Bekijk het signaal op beide oscilloscopen.
  8. Meet totale lichtsterkte (mW) aan het uiteinde van de optische vezel met een energiemeter. Met deze waarde bestralingssterkte (mW / mm2) berekend door deling van de dwarsdoorsnede van de vezelkern. Begin met een intensiteit waarde in het gebied van 10-15 mW / mm2 en naar beneden worden zonodig totdat artefacten geëlimineerd.
  9. Controleer voor lichte voorwerpen met de elektrode in de agarose, klaar om het weefsel voeren. Start het zoeken pulstrein (bijvoorbeeld 30 msec lichtpulsen, 500 msec interstimulus interval (ISI)).
    1. Elimineer voorbijgaande lichte voorwerpen (figuur 4) door herpositionering van de optische vezel ten opzichte van de elektrode naar de hoek van invallend licht te veranderen. Als artefacten aanhouden, probeer het verminderen van het licht macht. In the zeldzame geval dat artefacten niet volledig kan worden geëlimineerd (alleen geminimaliseerd), verlenging van de duur van de zoektocht puls. Dit kan helpen bij het identificeren waar neuronale spikes.

3. Straight PINP-in '

  1. Vooraf de elektrode langzaam door de hersenen op een snelheid van ongeveer 1 um / sec. Gebruik een oscilloscoop om activiteiten te monitoren. Anderzijds leiden van de laserpulsen.
  2. Luister voor de zwakkeren 'hash' van licht opgewekte spikes op de audio-monitor, die aangeeft dat de elektrode nadert een ChR2 + cel en kan vaak worden waargenomen ruim voor het elektrische signaal is zichtbaar op de oscilloscoop. Vertragen het tempo van de vooruitgang.
    OPMERKING: Als de cel ligt direct in het pad van de elektrode, zal het licht opgewekte activiteit groter (en harder) groeien. Als de elektrode benadert één interneuron, zal de hash op te lossen in kleine, maar goed gedefinieerde pieken van uniforme grootte en vorm.
  3. Zodra liGHT-opgewekte spikes zijn groot genoeg om triggeren individueel op de oscilloscoop, beginnen doen. Stel de schaal op de horizontale as om de exacte vorm van de piek golfvorm observeren.
  4. Stoppen en wachten tot het weefsel om zich te vestigen. Weersta de verleiding om de elektrode dichter bij de cel te verplaatsen. Deze stap is essentieel voor een stabiele opname. Wanneer na enkele minuten de signaal-ruisverhouding te wensen overlaat - dat het weefsel geregeld, maar het is gebracht de cel dichter bij het uiteinde van de electrode - voorschot 5 urn verder en wacht opnieuw.
    1. Herhaal dit proces totdat de piek of het dieptepunt van de actiepotentiaal op betrouwbare wijze kan worden vastgelegd met een voltage drempel goed gezet boven het ruisniveau (bijvoorbeeld +/- 300 mV of hoger).
      OPMERKING: Er is weinig kans op vals-positieven of dubbelzinnigheid wanneer PINPing remmende interneuronen. De meeste cellen kunnen gemakkelijk volgen een reeks pulsen met een duur van 30 msec en inter-pulse interval 500 msec, of sneller, met een betrouwbare eerste piek latentie van 2,5 msec (Figuur 5). De meeste PV + cellen, in het bijzonder kunnen houden afvuren voor een volledige 1 sec (Figuur 6). Omdat dit remmende neuronen, disynaptic (indirect) de activering geen groot probleem.
  5. Tijdens het opnemen, monitoren continue activiteit op de eerste oscilloscoop. Houd in de gaten op de grootte en de vorm van spikes met behulp van de tweede oscilloscoop. Let op de kwaliteit van het geluid van de luidspreker.
    1. Aandachtig luisteren naar abrupte, die aangeven dat de cel ofwel tekening te dicht bij de elektrode (waar het risico loopt doorboord of beschadigd), of wegdrijven. Als de spikes worden groot en vervormd, terug uit; als ze kleiner worden, vooraf de elektrode. Beweeg langzaam in 2 micrometer stappen.
    2. Controleer de kwaliteit van de opname post-hoc door superpositie van alle spike golfvormen, afgestemd op het piekvermogen of trog. Varieer de spanning Thresvast te houden. Over een breed scala van drempelwaarden, moet er altijd maar één consistente spike vorm van uniforme hoogte (figuur 5a) zijn.
  6. Als op enig moment het signaal vervuild raakt met spikes van een naburig neuron, gaan we verder. Advance langzaam aan de off-kans dat de elektrode passeert buiten het bereik van de naburige cel, maar blijven afstand van het doel neuron. (Meestal is mislukt.)
  7. Beweeg de elektrode door de gehele diepte van cortex (900+ pm) in elke verdieping. Als er geen licht-responsieve neuronen worden aangetroffen na vele penetraties of, omgekeerd, worden opnames routinematig besmet met spikes uit naburige ChR2- cellen, probeer een nieuwe elektrode.
    OPMERKING: Zelfs binnen één partij, kan de impedantie en tip geometrie van de afzonderlijke elektroden aanzienlijk variëren. Beide factoren dragen bij aan het effectief "luisteren radius" van de elektrode, die groot genoeg is om het licht opgewekte spikes detecteren wh moet zijnile zoeken, maar voldoende beperkt tot opname één interneuron afzonderlijk schakelen.
  8. Test de impedantie van de elektroden naar wens. Om beschadiging van het weefsel te voorkomen, moet deze met de punt van de elektrode in het bovenste gedeelte van de agarose laag, ver buiten de hersenen. Binnen het bereik van 7-14 MQ, de exacte impedantie is niet zeker voorspeller van prestaties of opbrengst voor deze toepassing. Dat gezegd hebbende, het is een redelijke proxy voor het luisteren radius: lagere impedantie elektroden pick-up meer eenheden; hogere impedantie minder.
  9. Aan het einde van het experiment, inslapen de dierlijke institutioneel goedgekeurd middelen zoals anesthetische overdosis of cervicale dislocatie onder een diep niveau van verdoving.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van single-unit onderzoek van genetisch-geclassificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muis cortex, met behulp van een optogenetic methode ontwikkeld door Lima et al. 1. Tabel 1 details de voorgestelde verdoving cocktail, Ketamine-Medetomidine-Acepromazine (" KMA "). Figuur 1 toont een micro-elektrode wolfraam, klaar voor opname. Figuur 2 is een schema voor een eenvoudige LED besturi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel PINP is conceptueel eenvoudig, kan het een uitdaging in de praktijk zijn. Een belangrijke determinant van het succes is de keuze van de elektrode. De elektrische luisteren radius is de kritische parameter. Het moet voldoende groot zijn om licht opgewekte spikes detecteren wanneer de tip nog op enige afstand van een ChR2 + cel, zodat men de snelheid van vooraf dienovereenkomstig kan passen. Tegelijkertijd moet voldoende beperkt om goede isolatie enkele eenheid inschakelen. Dat wil zeggen dat de elektrode mag niet ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Whitehall Foundation en de NIH. We danken Clifford Dax (University of Oregon Technical Support Administration) voor zijn hulp en expertise bij het ontwerpen van een circuit voor lichtlevering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ChR2-EYFP LineJackson Colonies12569
Pvalb-iCre (PV) LineJackson Colonies8069
Sst-iCre (SOM) LineJackson Colonies13044
Cr-iCre (CR) LineJackson Colonies10774
AgaroseSigma-AldrichA9793Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)FST10066-15
Surgical ScissorsFST14084-09
ScalpelFST10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic OintmentFoster & Smith9N-76855
Homeothermic BlanketHarvard Apparatus507220F
Tungsten MicroelectrodesA-M Systems57720012 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass TubingWarner InstrumentsG150TF-3
Heat Shrink TubingDigiKeyA332B-4-ND
Zapit AcceleratorDVASKU ZA/ZAAGebruik met standaard Superlijm. 
Microelectrode AC Amplifier 1800AM Systems700000
MP-285 Motorized MicromanipulatorSutterMP-285
4-channel Digital OscilloscopesTektronixTDS2000C
Powered SpeakersHarmanModel JBL Duet
Manual ManipulatorScientificaLBM-7
800 µm Fiber Optic Patch CableThorLabsFC/PC BFL37-800
Power MeterThorLabsPM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-EDigiKeyXPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-NDLED-vermogen en -efficiëntie nemen voortdurend toe, dus we raden aan om de nieuwste producten te controleren (www.cree.com).
Arduino UNODigiKey1050-1024-ND

Referenties

  1. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
  2. Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
  3. Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
  4. Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
  5. Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
  6. Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
  7. Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
  8. Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
  9. Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
  10. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  11. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159(2005).
  12. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  13. Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
  14. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetische identificatiecorticale interneuronenfotostimulatie ondersteunde identificatieextracellulaire versterkerblauwe lichtstimulatiecortex van geanestheseerde muissingle unit isolatieelektrodevoortgangsignaal ruisverhouding

Gerelateerde artikelen