RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Samenvatting

We rapporteren een procedure om RNA met hoge integriteit te isoleren uit de ribonuclease-rijke muizenpancreas.

Samenvatting

Het isoleren van hoogwaardig RNA uit ribonuclease-rijk weefsel, zoals de alvleesklier van een muis, is een uitdaging. Aangezien een van de primaire functies van de alvleesklier het helpen bij de spijsvertering is, kan de alvleesklier van een muis wel 75 mg ribonuclease bevatten. We rapporteren aanpassingen van standaard phenol/guanidinethiocyanaat lysisreagens protocollen om RNA uit de alvleesklier van een muis te isoleren. Guanidinethiocyanaat is een sterk eiwitdenaturerend middel en zal de activiteit van ribonuclease onder de meeste omstandigheden effectief verstoren. Echter, cruciale aanpassingen aan standaard protocollen zijn noodzakelijk om RNA met succes uit ribonuclease-rijk weefsel te isoleren. Sleutelstappen omvatten een hoog lysisreagens naar weefsel verhouding, verwijdering van onverteerd weefsel voorafgaand aan fasescheiding en het opnemen van een ribonuclease remmer in de RNA oplossing. Door deze en andere aanpassingen te gebruiken, isoleren we routinematig RNA met een RNA Integrity Number (RIN) groter dan 7. Het geïsoleerde RNA is van geschikte kwaliteit voor routinematige genexpressie analyse. Aanpassing van dit protocol om RNA uit ribonuclease rijk weefsel, behalve de alvleesklier, zou gemakkelijk haalbaar moeten zijn.

Inleiding

Isolatie van RNA met hoge integriteit is vereist voor routine moleculaire biologische experimenten zoals Northern blotting ^9, qRT-PCR ¹ of genexpressieprofielen ^5. De meeste hedendaagse werkwijzen RNA-isolatie zijn gebaseerd op modificaties van de guanidine thiocyanaat protocollen ^{2, 3.} Guanidine thiocyanaat is een sterk eiwit denaturerend en effectief verstoren de activiteit van ribonuclease onder de meeste omstandigheden. De populaire methode van Chomczynski en Sacchi ³ gecombineerd fenol de guanidine thiocyanaat lysis oplossing ontsluiting tijd ongeveer 4 uur. Vele commercieel verkrijgbare RNA-extractie reagentia zijn gebaseerd op het Chomczynski en Sacchi methode ^3.

Ribonuclease rijke weefsels zoals mens of muis pancreas ook een extra uitdaging voor het isoleren van RNA. Muis alvleesklier kan tot 75 mg ribonuclease ⁶ bevatten die zal worden uitgebracht During verstoring van de pancreas weefsel resulteert in weefsel autolyse. Modificaties van de guanidine thiocyanaat protocollen zijn met succes gebruikt om RNA te isoleren uit pancreas met hoge integriteit ^{2, 4, 7, 10.} Infusie van RNA stabilisatie reagens in muis pancreas vergemakkelijkt isolatie van RNA met hoge integriteit ^{4, 7, 10,} infusie evenwel van oplossingen in de alvleesklier vereist grote vaardigheid, gespecialiseerde instrumenten zoals een dissectie microscoop en verstoren weefselarchitectuur tijdens de procedure kan tot cellysis nodig. Perfunderen weefsel met RNA stabilisatie reagens kunnen interfereren met andere toepassingen, waaronder eiwitisolatie en histologische kleuring. Bovendien is deze techniek niet geschikt voor het isoleren van RNA van humane pancreas. Andere protocollen vereisen de voorbereiding van specifieke oplossingen door de onderzoeker ^2.

Wij rapporteren een protocol om RNA te isoleren met een hoge integriteit van de muis pancreas. The protocol gebruikt elementen van eerder gepubliceerde werkwijzen en is grotendeels gebaseerd op de standaard fenol / guanidine-thiocyanaat gebaseerde lysis reagens protocollen. Het is niet de voorbereiding van gespecialiseerde oplossingen vereisen evenmin infusie van reagentia nodig in de alvleesklier. Kritische stappen voor een succesvolle RNA-isolatie zijn voorzien van een high fenol /-guanidine gebaseerd lysisreagens om weefsel ratio, het verwijderen van onverteerd weefsel voorafgaand aan de scheiding en het opnemen van een ribonucleaseremmer fase naar de resulterende RNA oplossing. Door deze en andere modificaties, wij doorgaans isoleren RNA met RIN groter dan 7 wordt gebruikt voor normale genexpressie analyse.

Protocol

1. Bereiding

De volgende praktijken houden aan de door de Animal Care en gebruik Comite van de Instelling (IACUC) vastgesteld beleid.

1. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 6 muis pancreases isoleren in een bepaalde dag. Zijn alle chirurgische instrumenten schoon en autoclaaf, een set per dier.
2. Label alle microcentrifugebuizen. Vier 2 ml buisjes per dier.
3. Plaats 8 ml lysis reagens in 50 ml centrifuge buizen op ijs. Opmerking: Als het zuiveringssamenstel heeft een guanidine thiocyanaat fenol reagens dat geschikt is voor alvleesklier isolering lysis reagens gebruikt vanwege de grote hoeveelheden die nodig zijn per isolatie.
4. Verdeel ongeveer 10 ml van de volgende oplossingen in 15 ml centrifugebuizen voor schoonmaak blades de homogenisator is. Ethanol, 70% (2 tubes), HPLC-kwaliteit water (1 tube) en HPLC-kwaliteit water met ongeveer 200 pl RNase Away of gelijkwaardig ribonuclease inactivator.

2. Chirurgie, alvleesklier Dissection en homogenisering

1. Plaats 1-2 ml van isofluraan in een pot met een gaasje of papieren handdoeken. Muizen worden op een platform dat hen verhindert het bereiken van de bron van de isofluraan geplaatst. Voeg verse isofluraan aan de pot voorafgaand aan verlamming van elke muis.
2. Plaats voorzichtig de muis in de pot met de isofluraan. Cap de pot en toezicht houden op de gevolgen van de anesthesie door voorzichtig draaien van de pot heen en weer. Het dier wordt verdoofd zodra het in staat in zijn 'eigen te staan.
3. Ter bevestiging van de anesthesie, verwijder het dier uit de pot en een stevige teen knijpen toepassing. Als de muis niet reageert op de teen knijpen, ga dan naar stap 2.5.
4. Als de muis reageert op de teen knijpen, herhaal de stappen 2,2-2,3.
5. Plaats de verdoofde dier op de bank top in buikligging. Ontwrichten baarmoederhals van de muis door strak plaatsen van de linkerhand op de baarmoederhals van de muis. Onsing de rechterhand grijpen de staart van de muis en snel omhoog trekken op ongeveer een hoek van 45 ° naar de baarmoederhals ontwrichten.
6. Beveilig het karkas aan een oppervlak (een niveau stukje piepschuim bedekt met keukenpapier) door het doorboren van elk van het dier vier poten in het platte vlak met behulp van 25 gauge injectienaalden.
7. Met behulp van steriele chirurgische instrumenten, snijd de buik van de muis open en snel te verwijderen van de alvleesklier van de muis. Gebruik de tang om de alvleesklier te houden en knip het uit de milt en de dunne darm met behulp van de lente schaar. Wees voorzichtig de alvleesklier niet te rekken tijdens het verwijderen van de muis. Verstoring van het weefsel kon ribonuclease vrijgeven. Opmerking: De tijd die nodig is om de pancreas van de muis verwijderd kritisch. De vakman moet kunnen de alvleesklier ontleden in ongeveer 1 min. of minder.
8. Plaats het gehele alvleesklier in een 50 ml buis met 8 ml ijskoude lysis reagens. Doe het buisje dicht en even schudden om de ti onderdompelenssue in het reagens en doorgaan naar de volgende stap zonder vertraging. De verhouding van lysis reagens om weefsel kritisch. Zie paragraaf resultaten voor een vergelijking van de RNA integriteit geïsoleerd met verschillende volumina lysis reagens.
9. Gehomogeniseerd, 5 sec. Het is belangrijk om de homogenisator messen op de bodem van de centrifugebuis zodat het weefsel wordt getrokken in de messen voor efficiënte homogenisatie.

3. Verwijdering van Onverteerd Tissue

Opmerking: Na homogenisatie zullen kleine stukjes weefsel in de lysis reagens blijven. Het is belangrijker om snel lyseren het weefsel verlaten wat weefsel in plaats van onverteerd dan homogeniseren en risico afbraak van RNA.

1. Overdracht 2 ml lysis reagens dat de gelyseerde alvleesklier een 2 ml microcentrifugebuis. Verzamel twee microcentrifugebuizen van homogenaat per isolement. Gooi de resterende homogenaat of bewaar bij -80 ° C voor toekomstige studies.
2. Centrifuge bij 4 ° C, 12.000 x g gedurende 5 min om de onverteerd weefsel pellet. Dit is een cruciale stap als overdracht van onverteerd weefsel in latere oplossingen van RNA zal het monster waarschijnlijk besmet met ribonuclease (stap 5.13).
3. Breng 1 ml van het supernatans in een 2 ml microcentrifugebuis. Ga verder met de isolatie onmiddellijk slaan repliceren buis bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Plaats alle buisjes met homogenaat op nat ijs terwijl het doorgaat met de volgende stap.
4. Gooi de resterende lysisreagens in een geschikte chemische afvalbak.

4. Reiniging van de Homogenizer Blades

1. Alvorens over te gaan naar de volgende isolatie, het reinigen van de homogenisator messen door ze in 10 ml 70% ethanol. Activeer de homogenisator voor ongeveer 20 sec tot enige stukjes weefsel dat in de bladen mag worden gevangen te verwijderen.
2. Gebruik een 200 ul pipet tip om alle stukken die nog in de homogenisatie-bladen te verwijderen.
3. Herhaal stap 4.1 in water, algemeen Rnase inactivator en 70% ethanol. Droog de homogenisator as met een schone Kim vegen.
4. Herhaal stap 2.1 voor de pancreas isolatie van de overblijvende dieren, waarbij RNA geïsoleerd uit elk dier afzonderlijk plaats bundeling van RNA.

5. RNA Isolation

De volgende sectie is gelijk aan de zuivering kit protocol. Het voordeel van de zuivering kit is dat het totale RNA waaronder kleine RNA isoleert.

1. Als het gebruiken van bevroren homogenaat oplossing, ontdooien op nat ijs en laat het staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
2. Voeg 200 ul van chloroform, de dop op de buis en schud krachtig met de hand gedurende 15 sec. Laat de buis staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
3. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 xg, 4 ° C.
4. Breng de bovenste waterlaag in een microcentrifugebuis. Voeg 1,5 volumes isopropanol en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
5. Transfer tot 700 ul van het monster in een spin kolom die is geplaatst in een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifugeer bij 8000 xg gedurende 15 seconden bij KT.
6. Gooi de doorstroom.
7. Herhaal stap 5,5-5,6, met de rest van het monster.
8. Voeg 700 ul buffer RWT aan de spin kolom. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 8.000 x g. Gooi de doorstroom.
9. Pipetteer 500 ul buffer RPE in de spin kolom. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 8.000 xg om de kolom te wassen. Gooi de doorstroom.
10. Voeg 500 ul buffer RPE de spin kolom. Centrifugeer gedurende 2 min bij 8000 xg om de kolom te drogen.
11. Breng de spin kolom een ​​1,5 ml microcentrifugebuis. Pipet 80 ul-ribonuclease gratis water direct op de spin kolom membraan. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8000 xg om het RNA te elueren.
12. Voeg 1 ul Rnase-remmer aan het RNA-oplossing. Bewaren bij -80 ° C of overgaan tot 5.13.
13. Om de integriteit van het RNA valideren eerst berekenen RNA concentration en 260/280 verhouding met behulp van een spectrofotometer.
14. Verdun een deel van de RNA oplossing tot ongeveer 500 ng / pl met moleculaire biologie kwaliteit water.
15. Bepaal de RNA integriteit (dwz, RIN) met behulp van capillaire elektroforese analyse. Ongeveer 5 ui RNA oplossing is voldoende voor de analyse.
16. Aliquot de RNA-oplossing (zie figuur 2) en bewaar bij -80 ° C.

Resultaten

De totale RNA opbrengst van 1 ml lysis homogenaat 20-40 ug. OD 260/280 ratio's zijn meestal rond de 2.0 en de RIN zijn consistent hoger dan 7,0. Als de RIN is ≤ 6, wordt de isolatie moeten worden herhaald. Soms wordt een RIN die hoger is dan 8,0 bereikt.

De twee meest gebruikte methoden van euthanasie muizen vóór verwijdering van de alvleesklier CO ₂ stikken of inhalatie van isofluraan. Beide worden gevolgd door cervicale dislocatie. Omdat het mogelijk is dat het chemische mid...

Discussie

Het isoleren van RNA uit weefsels die zijn Ribonuclease rijk vormt een grote uitdaging voor de moleculaire biologie experimenten. Verschillende reagentia en kits zijn commercieel beschikbaar die zijn voornamelijk gebaseerd op het fenol guanidine thiocyanaat methode RNA-extractie. Guanidinethiocyanaat denatureert eiwitten en vermindert de activiteit van ribonuclease. Echter, de enorme omvang van ribonuclease in pancreas vereist extra aanpassingen aan standaardprotocollen van RNA isolatie. Een protocol wordt hiervoor geme...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Power Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizer
5424R	Eppendorf		Gekoelde microcentrifuge
Trizol reagent	Invitrogen	15596018	Lyse reagens
Student Vannas veertangschaar	Fisher	91500-09	Te gebruiken voor het snijden van de pancreas uit aangehechte weefsels
Chirurgische schaar, 6 inch	Fisher	08-951-20	Te gebruiken voor het snijden van de huid van de muis
Blunt end pincet	Fisher	1381239	Te gebruiken om de pancreas vast te houden tijdens het dissekeren
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetisch middel
Rnase out (40 U/µl)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhibitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	Algemene Rnase inactivator
HPLC-kwaliteit water	Fisher	W5-4	Voor het wassen van homogenisatorbladen
Moleculaire biologie kwaliteit water	Hyclone	SH30538.03	Elutie van RNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Purificatiekit
2 ml microcentrifugebuisjes, gecertificeerd Rnase Dnase vrij	USA Scientific Plastics	1620-2700
15 ml centrifugeerbuisjes	Falcon	352099
70% ethanol	Fisher
100% ethanol	Fisher
200 µl pipettenpunten	Rainin	GPL200F	Voor het reinigen van homogenisatorbladen
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrofotometer
Bioanalyzer	Agilent		Capillaire elektroforese-analyzer voor het meten van RNA-integriteit
RNAlater	Ambion		RNA-stabilisatie reagens
RNeasy spin kolommen	Qiagen		Spin kolommen als onderdeel van de miRNeasy Mini kit
Muizen	Chales River	Strain C57BL/6	Hun leeftijd varieerde van 4 tot 12 maanden.
Muizen	Jackson Lab	strain 129	Hun leeftijd varieerde van 4 tot 12 maanden.