We rapporteren een procedure om RNA met hoge integriteit te isoleren uit de ribonuclease-rijke muizenpancreas.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het isoleren van hoogwaardig RNA uit ribonuclease-rijk weefsel, zoals de alvleesklier van een muis, is een uitdaging. Aangezien een van de primaire functies van de alvleesklier het helpen bij de spijsvertering is, kan de alvleesklier van een muis wel 75 mg ribonuclease bevatten. We rapporteren aanpassingen van standaard phenol/guanidinethiocyanaat lysisreagens protocollen om RNA uit de alvleesklier van een muis te isoleren. Guanidinethiocyanaat is een sterk eiwitdenaturerend middel en zal de activiteit van ribonuclease onder de meeste omstandigheden effectief verstoren. Echter, cruciale aanpassingen aan standaard protocollen zijn noodzakelijk om RNA met succes uit ribonuclease-rijk weefsel te isoleren. Sleutelstappen omvatten een hoog lysisreagens naar weefsel verhouding, verwijdering van onverteerd weefsel voorafgaand aan fasescheiding en het opnemen van een ribonuclease remmer in de RNA oplossing. Door deze en andere aanpassingen te gebruiken, isoleren we routinematig RNA met een RNA Integrity Number (RIN) groter dan 7. Het geïsoleerde RNA is van geschikte kwaliteit voor routinematige genexpressie analyse. Aanpassing van dit protocol om RNA uit ribonuclease rijk weefsel, behalve de alvleesklier, zou gemakkelijk haalbaar moeten zijn.
Inleiding
Isolatie van RNA met hoge integriteit is vereist voor routine moleculaire biologische experimenten zoals Northern blotting 9, qRT-PCR 1 of genexpressieprofielen 5. De meeste hedendaagse werkwijzen RNA-isolatie zijn gebaseerd op modificaties van de guanidine thiocyanaat protocollen 2, 3. Guanidine thiocyanaat is een sterk eiwit denaturerend en effectief verstoren de activiteit van ribonuclease onder de meeste omstandigheden. De populaire methode van Chomczynski en Sacchi 3 gecombineerd fenol de guanidine thiocyanaat lysis oplossing ontsluiting tijd ongeveer 4 uur. Vele commercieel verkrijgbare RNA-extractie reagen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding
De volgende praktijken houden aan de door de Animal Care en gebruik Comite van de Instelling (IACUC) vastgesteld beleid.
- Het wordt aanbevolen om niet meer dan 6 muis pancreases isoleren in een bepaalde dag. Zijn alle chirurgische instrumenten schoon en autoclaaf, een set per dier.
- Label alle microcentrifugebuizen. Vier 2 ml buisjes per dier.
- Plaats 8 ml lysis reagens in 50 ml centrifuge buizen op ijs. Opmerking: Als het zuiveringssamenstel heeft een guanidine thiocyanaat fenol reagens dat geschikt is voor alvleesklier isolering lysis reagens gebruikt vanwege de grote hoeveelheden die nodig zijn ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De totale RNA opbrengst van 1 ml lysis homogenaat 20-40 ug. OD 260/280 ratio's zijn meestal rond de 2.0 en de RIN zijn consistent hoger dan 7,0. Als de RIN is ≤ 6, wordt de isolatie moeten worden herhaald. Soms wordt een RIN die hoger is dan 8,0 bereikt.
De twee meest gebruikte methoden van euthanasie muizen vóór verwijdering van de alvleesklier CO 2 stikken of inhalatie van isofluraan. Beide worden gevolgd door cervicale dislocatie. Omdat het mogelijk is dat het chemische mid.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het isoleren van RNA uit weefsels die zijn Ribonuclease rijk vormt een grote uitdaging voor de moleculaire biologie experimenten. Verschillende reagentia en kits zijn commercieel beschikbaar die zijn voornamelijk gebaseerd op het fenol guanidine thiocyanaat methode RNA-extractie. Guanidinethiocyanaat denatureert eiwitten en vermindert de activiteit van ribonuclease. Echter, de enorme omvang van ribonuclease in pancreas vereist extra aanpassingen aan standaardprotocollen van RNA isolatie. Een protocol wordt hiervoor geme.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo en Satyanarayana Rachagani voor hun nuttige opmerkingen, suggesties en het delen van hun protocollen. Dit werk werd ondersteund door subsidie U01CA111294 en an Idea Development Award van de Ohio State University Intramurale Research Program.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Gekoelde microcentrifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lyse reagens |
| Student Vannas veertangschaar | Fisher | 91500-09 | Te gebruiken voor het snijden van de pancreas uit aangehechte weefsels |
| Chirurgische schaar, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Te gebruiken voor het snijden van de huid van de muis |
| Blunt end pincet | Fisher | 1381239 | Te gebruiken om de pancreas vast te houden tijdens het dissekeren |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetisch middel |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhibitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | Algemene Rnase inactivator |
| HPLC-kwaliteit water | Fisher | W5-4 | Voor het wassen van homogenisatorbladen |
| Moleculaire biologie kwaliteit water | Hyclone | SH30538.03 | Elutie van RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purificatiekit |
| 2 ml microcentrifugebuisjes, gecertificeerd Rnase Dnase vrij | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifugeerbuisjes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipettenpunten | Rainin | GPL200F | Voor het reinigen van homogenisatorbladen |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrofotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillaire elektroforese-analyzer voor het meten van RNA-integriteit | |
| RNAlater | Ambion | RNA-stabilisatie reagens | |
| RNeasy spin kolommen | Qiagen | Spin kolommen als onderdeel van de miRNeasy Mini kit | |
| Muizen | Chales River | Strain C57BL/6 | Hun leeftijd varieerde van 4 tot 12 maanden. |
| Muizen | Jackson Lab | strain 129 | Hun leeftijd varieerde van 4 tot 12 maanden. |
Referenties
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
