Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Single-molecule microscopie is in opkomst als een krachtige aanpak van het gedrag van signaalmoleculen, in het bijzonder met betrekking tot die aspecten (bv.., Kinetiek, naast elkaar bestaan van verschillende staten en bevolkingsgroepen, voorbijgaande interacties), die typisch zijn verborgen in ensemble-metingen, zoals analyseren die verkregen met standaard biochemische methoden of microscopie. Aldus thermische, zoals receptor-receptor-interacties, kunnen worden gevolgd in real time in een levende cel met hoge resolutie spatiotemporal. Dit protocol beschrijft een methode waarbij merken met kleine en lichte organische fluoroforen en totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie direct visualiseren enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen. Deze aanpak maakt het mogelijk om precies receptoren lokaliseren, meten van de grootte van de receptor complexen, en vangen dynamische evenementen zoals transient receptor-receptor interacties. Het protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe u perform een single-molecule experiment, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en beeldanalyse. Als voorbeeld, de toepassing van deze methode twee G-eiwit-gekoppelde receptoren te analyseren, dwz., Β 2-adrenerge en γ-aminobutyric acid type B (GABA B) receptor, wordt gerapporteerd. Het protocol kan worden aangepast aan andere membraaneiwitten en verschillende celmodellen, transfectie en etikettering strategieën.
Inleiding
Receptoren op het celoppervlak zin de extracellulaire omgeving en reageren op verschillende stimuli, zoals geurstoffen, ionen, kleine neurotransmitters en hormonen groot eiwit. De vloeibare aard van cellulaire membranen maakt bewegingen van receptoren en andere membraaneiwitten. Dit is essentieel voor de vorming van eiwitcomplexen en het optreden van transiënte eiwit-eiwit interacties, zoals die gebruikt door receptoren te assembleren in functionele eenheden en transduceren signalen in de cel interieur. Bijvoorbeeld, G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's), die de grootste familie van celoppervlak receptoren 1 vormen, zijn voorgesteld om di-/oligomers, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Dekglaasje reiniging
LET OP: Brei onder een afzuigkap.- Gebruik schone pincet om dekglaasjes (24 mm diameter) te plaatsen in een dekglaasje houder dat individuele dekglaasjes scheidt.
- Plaats de houder met dekglaasjes in een beker en voeg chloroform totdat de dekglaasjes worden gedekt. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie om verdamping en ultrasone trillingen te verminderen in een badsonicator gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Neem het dekglaasje houder uit de beker en laat de dekglaasjes droog.
- Herhaal stap 1.1.2 met 5 M NaOH-oplossing in plaats van chloroform.
- Neem....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De beschreven protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere membraaneiwitten. Als voorbeeld, worden representatieve resultaten verkregen met β 2-adrenerge en GABA B-receptoren gemeld 10. Aangezien fluorescente signalen van enkele moleculen zwak, minimalisering van de achtergrond fluorescentie is de eerste cruciale stap succesvolle resultaten. Derhalve is het belangrijk om uitgebreid gereinigd dekglaasjes (Figuur 2A) gebruikt als monster autofluorescenti.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beschreven protocol maakt analyse van de ruimtelijke ordening, mobiliteit en grootte van celoppervlak receptor-complexen bij individuele molecuul. Vergeleken met het gebruik van fluorescente proteïnen, labeling met kleine organische fluoroforen, die helderder en fotostabiel zijn, heeft het voordeel van het toestaan uitgebreide visualisatie van een enkele receptor deeltjes. Aangezien extreem lage expressieniveaus worden verkregen (<0,45 receptor deeltjes / um 2) de eigenschappen van receptoren en ander.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De ontwikkeling van dit protocol werd ondersteund door subsidies van de European Research Council (Advanced Grant TOPAS aan M.J.L.) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 aan D.C. en SFB487 aan M.J.L.). T.S. werd ondersteund door de Alexander von Humboldt Stichting.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | VOORZICHTIG: giftige en irriterende stof evenals een mogelijk carcinogeen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | VOORZICHTIG: sterke base en zeer corrosief reagens |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glazen dekglas | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm dikte |
| 0.2 mm steriele filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cellen | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovarium cel lijn |
| 6-well celkweekplaat | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Fenol-rood vrij medium |
| Foetaal bovien serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicilline - streptomycine | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsine-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorofoor-geconjugeerd benzyiguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Maak een 1 mM stam oplossing in DMSO. Bewaar bij -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Beeldvorming buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterieel gefilterd | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Beeldvormingskamer | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, voor microscopie |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objectief | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperatuurregelaar | Pecon | Tempcontrol 37-2 digitaal | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
Referenties
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol To....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
