A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

Samenvatting

We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.

Samenvatting

Miniaturisatie van analytische procedures benchtop in de micro-schaal biedt aanzienlijke voordelen met betrekking tot reactietijd, kosten en integratie stappen voorbewerking. Gebruik makend van deze apparaten naar de analyse van DNA hybridisatie is belangrijk omdat het een technologie voor real time evaluatie van biomarkers in het point-of-care voor verschillende ziekten. Echter, wanneer de inrichting footprint vermindert de dominantie van verschillende fysische verschijnselen toeneemt. Deze fenomenen beïnvloeden de fabricage nauwkeurigheid en bedrijfszekerheid van de inrichting. Daarom is er een grote behoefte aan om de algemene prestaties verbeteren nauwkeurig fabriceren en gebruiken deze apparaten reproduceerbare wijze. Hier beschrijven we de protocollen en het wordt gebruikt voor de fabricage en de werking van een microfluïdische gebaseerd elektrochemische biochip voor een nauwkeurige analyse van DNA hybridisatie methoden. De biochip bestaat uit twee delen: een microfluïdische chip metdrie parallelle microkanalen van polydimethylsiloxaan (PDMS), en een 3 x 3 Arrayed elektrochemische micro-chip. De DNA hybridisatie gebeurtenissen worden gedetecteerd met behulp van elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS) analyse. De EIS analyse stelt bewaking variaties van de eigenschappen van het elektrochemische systeem dat dominant op deze lengteschalen zijn. Met de mogelijkheid om veranderingen zowel ladingsoverdracht en diffusie weerstand met de biosensor monitoren tonen we de selectiviteit naar complementaire ssDNA doelen, een berekende detectielimiet van 3,8 nM, en een 13% kruisreactiviteit met andere niet-complementaire ssDNA na 20 min incubatie. Deze methode kan de prestaties van geminiaturiseerde inrichtingen verbeteren door het ophelderen van het gedrag van diffusie op micro-schaal regime en doordat de studie van DNA hybridisatie.

Inleiding

Microfluïdische lab-on-a-chip (LOC)-apparaten bieden tal van voordelen in de klinische diagnostiek, bewaking van het milieu en biomedisch onderzoek. Deze apparaten maken gebruik van microkanalen te fluïdumstroming regio's van de chip waarbij een aantal verschillende werkwijzen kan plaatsvinden reagens zoals mengen, op basis van affiniteit binding, signaaltransductie en cel kweken ^1-4. Microfluidics biedt vele voordelen ten opzichte van conventionele klinische diagnostische hulpmiddelen zoals microwell plaat lezers of elektroforetische gel shift assays. Microfluïdische apparaten vereisen 2 tot 3 orden van grootte (nanoliter tegenover microliter) minder reagentia vergelijkbare assays. Daarnaast kunnen deze apparaten op de snelheid waarmee een biologische gebeurtenissen door de kleinere opsluiting van de soorten van de kanalen ^5,6 te verhogen. Ten derde kunnen de sensoren worden geïntegreerd binnen microfluïdische apparaten met behulp van lithografie en etsen technieken, die label-free detectio kan biedenn. Tenslotte, deze apparaten zijn goedkoop te produceren en vereisen weinig werk door de technicus te bedienen ^7-10.

Labelvrije detectie wordt typisch uitgevoerd met een optische of elektrische transducer. Optische apparaten beter detectieprestaties presenteren door lagere interferentie met analyten in het monster. Toch is hun prestaties aangetast wanneer de achtergrond van het monster dezelfde resonerende golflengte als de sensor ^11. Er zijn vele voordelen aan het gebruik van elektrische signalen aan biologische en chemische detectie uitvoeren in microfluïdische systemen. De fabricage is inherent minder ingewikkeld, omdat deze sensoren meestal alleen nodig patroon elektroden te bedienen. Bovendien kunnen elektrische signalen direct worden aangesloten op de meeste meetapparatuur terwijl andere modaliteiten een signaal transducer kan uitvoering van de signaal ^12-15 converteren. Elektrische sensoren veranderingen in impedanc algemeen metene ^16,17, capaciteit ¹⁸ of redox activiteit ^19. Er zijn echter nieuwe uitdagingen gepresenteerd als deze systemen worden verkleind. De belangrijkste uitdagingen te overwinnen zijn: monstervoorbereiding en mengen van fluïda (vanwege de geringe hoeveelheid monster en Reynoldsgetal), fysische en chemische effecten (zoals capillaire krachten, oppervlakteruwheid, chemische interacties tussen bouwmaterialen en analyten), lage signaal- ruisverhouding (door het gereduceerde oppervlak en volume) ^20-23 en mogelijke interferentie van elektro-actieve analyten in complexe biologische monsters (zoals bloed en speeksel). Nader onderzoek van deze effecten zal resulteren in richtlijnen voor een nauwkeurige fabricage en werking van deze inrichtingen op een reproduceerbare wijze die op hun prestaties zou verbeteren.

DNA hybridisatie detectie schaal gebruikt voor genetische aandoeningen ^24,25 en verschillende vormen van canc diagnosticerener ^26. Elk jaar, verschillende stammen van influenza geïdentificeerd bij patiënten die resultaten uit DNA hybridisatietechnieken ^27. Het influenzavirus alleen al goed voor 36.000 doden per jaar in de Verenigde Staten ^28. Deze voorbeelden zouden profiteren van een bench-top microfluïdische apparaat dat dezelfde assay technieken kunnen uitvoeren als een plaatlezer of gel shift assay met lage monstervolume en een fractie van de kosten zonder dat gevoeligheid of specificiteit. Door de vele voordelen van labelvrije elektrochemische detectie, is uitgebreid gebruikt voor de detectie van DNA hybridisatie ^29,30. Een opstelling waarbij macroschaal elektroden (in het millimeterbereik) gedompeld in bekers met de oplossing van belang kan worden gebruikt om gevoelige gegevens over de bindingskinetiek van enkelstrengs DNA-sequenties aan hun bijpassende complementaire sequenties verschaffen. Onlangs zijn er een aantal ontwikkelingen in de integratie van elektrochemische sensing in micr geweestofluidics voor DNA hybridisatie. Er zijn studies verricht naar hybridisatiekinetiek ³¹ en integratie van sensoren voor detectie ¹⁵ in microkanalen. Er bestaat echter nog steeds behoefte aan een snelle high throughput microfluïdische apparaat dat kan analyseren DNA hybridisatie in parallel zonder complexe opzuivering.

De in dit werk inrichting een platform dat voor meerdere interacties te screenen in parallel en zonder ingewikkelde opzuivering. Ons protocol presenteert hoe microfluïdisch-gebaseerde elektrochemische biochips worden microfabricated met micro-elektromechanische systemen (MEMS) technologie ^32,33. We beschrijven het fabricageproces van zowel de microfluïdische chip, gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) en de elektrochemische chip, bestaande uit een reeks elektroden. De chemische functionalisering van de biochip met ssDNA sondes is ook aan de orde. Ten slotte Abilheid van de biosensor specifiek ssDNA targets te detecteren en analyseren wordt aangetoond. Kortom, de microfluïdische gebaseerde elektrochemische biochip is een snelle en high-throughput analysetechniek. Het kan worden gebruikt om de interacties tussen biologische moleculen en houden transducers onderzoeken, en kan worden gebruikt in een verscheidenheid van lab-on-a-chip toepassingen.

Protocol

1 Microfabricage van de Microfluidic Chip

1. Bereid Elektrochemische Chip
   1. Patroon Gold Elektroden
      1. Spoel een lege 4 'siliciumwafel (prime Grade) met aceton, methanol en isopropanol ("AMI" clean). Spoel de isopropanol van de wafer met gedeïoniseerd water (DI), gevolgd door drogen met _N2 pistool.
      2. Groeien een 1 micrometer dik SiO ₂ passiveerlaag met plasma-geassisteerde chemical vapour deposition (PECVD) tool. Deponeer een 200 A dikke laag chroom gevolgd door een 2000 A dikke laag van goud met een DC sputteren tool.
      3. Spin "PR1" positieve fotolak (spinnen parameters: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) om een ​​uniforme film ~ 1,6 micrometer dik te maken. Pre-bak de wafer gedurende 1 min bij 100 ° C op een hete plaat.
      4. Maak de wafer 190 mJ / cm ² bij 405 nm door een fotomasker. Ontwikkel de wafer gedurende 30 seconden in 352 developer en spoel de wafer met DI en droog met _N2 pistool.
      5. Ets het goud met goud etsmiddel voor 1,5 min. Ets het chroom met chroom etsmiddel voor ~ 30 sec. Spoel de wafer met DI en droog met _N2 pistool.
      6. Strip de fotolak met "AMI" clean procedure.
         LET OP: STERK OXYDEREND en potentieel explosief.
      7. Reinig de wafer met 4: 1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ mengsel ("Piranha" clean) gedurende 1 minuut. Spoel de wafer met DI en droog met _N2 pistool.
   2. Patroon platina-elektroden
      1. Spin "PR2" positieve fotolak (spinnen parameters: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) om een ​​uniforme film ~ 1,4 micrometer dik te maken. Pre-bak de wafer gedurende 1 min bij 100 ° C op een hete plaat.
      2. Maak de wafer 30 mJ / cm ² bij 405 nm door een fotomasker. Bak de wafer gedurende 45 seconden bij 125 ° C op een hete plaat. Vloed blootde wafer 1000 mJ / cm ² bij 405 nm zonder fotomasker. Ontwikkel de wafer gedurende 2 minuten in 6: 1 AZ400K ontwikkelaar en spoel de wafer met DI en droog met _N2 pistool.
      3. Deponeer een 400 A dikke laag van titaan, gevolgd door een 1600 A dikke laag van platina met een elektronenbundel verdamping systeem.
      4. Til fotolak in een ultrasoon acetonbad voor 5 min, gevolgd door spoelen met aceton en isopropanol. Spoel de wafer met DI en droog met _N2 pistool.
2. Bereid Assay Channels
   1. Bereid Mold voor Assay Channels
      1. Spoel een lege 4 '' silicium wafer (test rangkwaliteit) met "AMI" clean procedure. Spoel de isopropanol van de wafer met DI gevolgd door drogen met _N2 pistool.
      2. Spin "PR3" negatieve fotolak (2-step spinnen parameters:. Stap een - 600 rpm, 120 rpm / sec, 10 sec Stap twee - 1.150 rpm, 383 rpm / sec,27 sec) om gelijkmatige film ~ 100 pm dik te maken. Pre-bak de wafer op een hete plaat (2 stappen bakken parameters:. Stap een - opvoeren van kamertemperatuur tot 65 ° C bij 300 ° C / hr ingedrukt gedurende 10 min Stap 2 - opvoeren tot 95 ° C bij 300 ° C / uur en vasthoudtemperatuur gedurende 30 min).
      3. Maak de wafer 2500 mJ / cm ² bij 405 nm door een fotomasker. Post-bak de wafer door verhoging tot 95 ° C bij 300 ° C / hr ingedrukt gedurende 10 minuten op een hete plaat. Ontwikkel de wafer gedurende 10 min in propyleenglycolmonomethylether Acetate (PGMEA) ontwikkelaar. Spoel de wafer met isopropanol en droog met _N2 pistool.
   2. Fabriceren Assay Channels
      1. Bereid 10: 1 polydimethylsiloxaan (PDMS) mengsel (20 g elastomeer, 2 g hardingsmiddel) en volledig ontgast in een vacuümkamer gedurende 20 minuten.
      2. Definieer een behuizing rond de mal wafer met aluminiumfolie en giet langzaam de niet uitgeharde PDMSin de mal.
      3. Bak de vorm met de PDMS in een kameroven (2 stappen bakken parameters:. Stap een - 5 min opvoeren van kamertemperatuur tot 80 ° C Stap 2 - houden op 80 ° C gedurende 17 min).
      4. Schil weg de PDMS uit de mal en leg ze op aluminiumfolie. Snijd de assay chips met een chirurg mes definiëren gaten met een biopsie stansgereedschap.

2 Monteer de Device

1. Handmatig uitlijnen van de PDMS-test kanalen met de werkende elektroden op de elektrochemische chip. PDMS stokken goed de elektrochemische chip, het afdichten van de kanalen en voorkomen lekkage.
2. Sluit een flexibele buis (OD 0,087 "en 0,015 ID ') een plastic elleboog of rechte connector tonen volgens een flexibele buis als adapter (OD 0,1875" en 0,0625 ID'). Bevestig connectors aan elk van de geperforeerde inlaten in de inrichting.
3. Sluit een spuit op het andere uiteinde vande slang en plaats de injectiespuit in een spuitpomp. Afwisselend veranderen de set van een spuit, een buis, en een connector volgens de vereiste procedure stap in hoofdstuk 3 en de bijbehorende oplossing.

3 Analyseer DNA hybridisatie

OPMERKING: Breng elke oplossing langzaam in het kanaal bij een stroomsnelheid van 200 ul / uur tot de hele kanaal gevuld.

1. Functionaliseren elke verticale microkanaalplaat met een ander ssDNA probe sequentie (uitgevoerd in parallel met de 3 separate verticale microkanalen):
   1. Vul elk microkanaal met een ander ssDNA probe incubatie-oplossing (10 mM fosfaatbuffer, 100 mM NaCl, 10 pM tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) en 1 uM probe ssDNA) en incubeer gedurende 1 uur, gevolgd door spoelen van het microkanaal met PBS.
   2. Vul het microkanaal met een oplossing die 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (MCH) in een buffer van 10 mM PBS, 100 mM NaCl en 1,395 mM TCEP en INCUverminder gedurende 1 uur, gevolgd door spoelen van de microkanaal met PBS.
2. Til de PDMS, 90 ° te draaien om een ​​horizontale oriëntatie, en leg neer op afzonderlijke rijen van reactiekamers bloot bij elke rij met een unieke teller en referentie-elektrode (figuur S1).
3. Vul de microkanalen met controlemeting oplossing van 4x geconcentreerde zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) buffer en incubeer gedurende 20 minuten.
4. Achtergrond meting: Vul de microkanalen met 5 mM ferricyanide / 5 mM ferrocyanide in PBS-oplossing en noteer de impedantie waarden van het elektrochemische systeem voor de verschillende frequenties (elektrochemische impedantie spectroscopie; EIS) met behulp van een potentiostaat verbonden met de werken, teller, en referentie-elektroden ( EIS parameters: frequentiebereik van 1 MHz tot 0,1 Hz, 10 frequentie gegevenspunten per decade, 25 mV amplitude, 5 mV polarisatie versus de referentie-elektrode). Herhaal deze meting voor elke werkelektrode in de microkanalen.
5. Meet DNA hybridisatie (voeren voor elke niet-complementaire en complementaire ssDNA doel).
   1. Vul de microkanalen met doel ssDNA meetoplossing 4x geconcentreerde SSC buffer die 1 uM van het doel ssDNA, en incubeer gedurende 20 minuten. Meet het DNA volgens stap 3.4.

Resultaten

Een bestuurbare en nauwkeurig fabricageproces voor de experimentele inrichting essentieel onderzoek. Het maakt het mogelijk onderzoekers om reproduceerbare en high throughput experimenten verkrijgen. Hier hebben we een hoge opbrengst, hoge reproduceerbaarheid microfabricage proces van een microfluïdische gebaseerde elektrochemische biochip (figuur 1) aangetoond. Met een laag uitvalpercentage, zijn enkele apparaten getoond bonding problemen die leiden tot oplossing lekkage. Om de elektrochemische activit...

Discussie

Onze procedures tonen de productie van een-microfluïdische gebaseerd elektrochemische biochip en het gebruik ervan voor DNA hybridisatie analyse. Door een hoge opbrengst gecontroleerde microfabricage te ontwikkelen we een inrichting bestaande uit microschaal kanalen geïntegreerd met een reeks elektrochemische transducers. We hebben gecontroleerde verwerking parameters voor de fotolithografie procedure van de elektrochemische chip en de microfluïdische kanaal mal bedacht door een iteratieve aanpak. Deze stappen geven ric...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4'' Silicon wafer	Ultrasil	4-5664	Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1")	Microchem		positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2")	Hoechst Celanse		positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3")	Microchem		negative photoresist
Gold etchant	Transene	TFA	No dilution
Chromium etchant	Transene	1020AC	No dilution
PDMS elastomer	Dow Corning	3097366 1004
PDMS curing agent	Dow Corning	3097358 1004
Biopsy punching tool	Healthlink	BP20
Tygon flexible tubing	Cole Parmer	R 3603	0.015"
Tygon flexible adapter	Cole Parmer	06417-41	0.0625"
1 ml syringe	Beckton-Dickenson	301025
Monobasic potassium phosphate	Fluka	1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Sigma	RES20765-A7
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Aldrich	C4706
6-mercapto-1-hexanol	Aldrich	451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer	Sigma	93017
Potassium hexacyanoferrate(III)	Aldrich	455946
Complementary ssDNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)	Oxford Instruments	PlasmaLab System 100	Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit	AJA International	ATC 1800-V	For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system	Denton	Custom-built	For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat	CH Instruments	660D
Syringe pump	KD Scientific	KDS230