Isolatie van lymfeklieronstcellen is een meervoudige procedure die enzymatische vertering en mechanische disaggregatie omvat om fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische en bloed-endotheelcellen te verkrijgen. In de beschreven procedure wordt een korte vertering gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de degradatie van oppervlaktemarkeringen van vitale lymfeklersonstcellen te minimaliseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Secundaire lymfatische organen, inclusief lymfeklieren, zijn samengesteld uit stromacellen die een structurele omgeving bieden voor homeostase, activering en differentiatie van lymfocyten. Verschillende subsets van stromacellen zijn geïdentificeerd door de expressie van het adhesiemolecuul CD31 en glycoproteïne podoplanine (gp38), T-zone reticulaire cellen of fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische endotheelcellen, bloedendotheelcellen en FRC-achtige pericyten binnen de dubbel-negatieve celpopulatie. Voor alle populaties worden verschillende functies beschreven, waaronder het scheiden en bekleden van verschillende compartimenten, het aantrekken en interactie met verschillende celtypen, het filteren van de afvoervloeistoffen en de contractie van de lymfatische vaten. In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen een aanvullende rol beschreven van stromacellen bij het orkestreren en reguleren van cytotoxische T-celreacties die mogelijk gevaarlijk zijn voor de gastheer.
Lymfeklieren zijn complexe structuren met veel verschillende celtypen en vereisen daarom een geschikte procedure voor het isoleren van de gewenste celpopulaties. Momenteel zijn protocollen voor het isoleren van lymfklierstromacellen afhankelijk van enzymatische vertering met verschillende incubatietijden; echter, stromacellen en hun oppervlaktemoleculen zijn gevoelig voor deze enzymen, wat resulteert in verlies van oppervlaktemarkerexpressie en celdood. Hier wordt een kort enzymatisch verteringsprotocol gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disrupatie voorgesteld om een levensvatbare suspensie van enkelvoudige lymfklierstromacellen te verkrijgen met behoud van hun oppervlaktemolecuulexpressie.
Inleiding
Lymfeklieren zijn gespecialiseerde compartimenten waar adaptieve immuunrespons tegen buitenlandse en zelf-antigenen worden geïnitieerd en gecoördineerd. De hier gepresenteerde betreft hier een korte enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische pipetteren om lymfeklier enkele celsuspensie te verkrijgen en toegang tot levensvatbare lymfeknoop stromale cellen die de oppervlakte-expressie van verscheidene moleculen kunnen onderhouden.
Lymfeklier stromale cellen vormen het skelet van de lymfeklieren en aan drie belangrijke functies: ten eerste ze filteren lichaamsvloeistoffen antigenen, pathogenen en hun pathogeen geassocieerde moleculaire patroon (PAMPs), alsook cytokines en gevaar geassocieerde moleculaire patroonvoorbeeld (DAMPs) aanwezig in het lichaam. Ten tweede, ze trekken en instrueren antigen presenterende cellen (APC) en lymfocyten te werken en initiëren adaptieve immuunreacties; en derde zij structureel omgeving voor de homeostase en differentiatie van lymfocyten 1-3. Tijdens ontsteking lymfeknoop stromale cellen groeifactoren, cytokines en chemokines, passen zwelling daardoor organiseren de interactie tussen dendritische cellen (DCs), T-en B-cellen. De orkestratie van immuunresponsen alleen mogelijk door de complexe structurele architectuur opgebouwd uit verschillende stromale cel populaties.
Lymfeklier stromale cellen zijn CD45 negatieve cellen en kan worden onderscheiden door de expressie van CD31 of GP38 in fibroblastische en endotheelcellen 1 -6. Gp38 + CD31 - T zone definieert reticulaire cellen (TRC, ook bekend als FRC: fibroblast reticulaire cellen), gp38 + CD31 + definieert lymfatische endotheelcellen (LEC), gp38 - CD31 + definieert bloed endotheelcellen (BEC). Verdere karakterisering van de subpopulaties onthulde het bestaan van andere lymfeknoop stromacellen. Er werd een kleine pericyte-achtige celpopulatie kenmerk in degp38 - CD31 - bevolking 7. Derhalve aanpassing van de isolatie moet voordelig voor identificatie en karakterisatie van de functionele eigenschappen van verschillende lymfeknoop stromacellen.
Vóór de ontwikkeling van lymfeknoop stromacellen digestie protocollen de studie van lymfeknoop stromacellen beperkt tot in situ metingen waarbij weefselsectie en microscopie. Niettemin structurele en functionele studies toonden belangrijke kenmerken van lymfeknoop stromale cellen. Lymfeknoop stromale cellen geassocieerd met podoplanin, collageen en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten een complex 3 dimensionale structuur genoemd leidingsysteem, dat lymfe en bijbehorende laag molecuulgewicht eiwitten vervoert van de subcapsulaire sinus van de lymfeklieren van de hoge endotheliale vormen venulen in de T-cellen zone 8. DCs zijn in nauw contact met stromacellen en kunnen worden waargenomen uitsteekt in de buisvormige conduit structuur om te proeven van vocht en detecteren antigenen 8. De interactie van de lymfeklier stromale cellen (TRC's en LEC's) met DC's wordt gemedieerd door de introductie en presentatie van chemokines CCL21 en CCL19 9,10. CCL19 en CCL21 zijn erkend door de CCR7 receptor faciliteren DC en T-cellen om te migreren naar de lymfeklieren T-cel zone 4,11. Ondanks het gebruik van gelijkaardige chemokines, DC's en T-cellen hebben verschillende migratieroutes naar de lymfeklieren 12. Later, middels enzymatische digestie van de lymfeklieren en isoleren van pure lymfeknoop stromacellen, functionele studies naar de rol van de verschillende lymfeknoop stromale cellen en hun vermogen tot interactie met DCs en T / B-cellen 6,13. Eerst de overspraak tussen IFN-γ producerende effector T-cellen en de lymfeknoop stromale cellen induceert de productie van de metaboliet stikstofoxide aangetoond dat T-cel responsen en proliferatie temperen in de secundaire lymfoïde organen 14-16. Ten tweede, lymfe node stromale cellen gemeld de differentiatie van regelgevende DC subsets ondersteunen via de productie van IL-10 17, en naïeve T cel homeostase moduleren via productie van IL-7 6,18. Ten derde, TLR expressie in lymfeknopen stromale cellen suggereert dat stromale cellen gevoelig voor signaal afgeleid van een infectie of zelf-moleculen model bij weefselbeschadiging. Inderdaad, de behandeling van lymfeklier stromale cellen met de ligand van TLR3 poly (I: C) induceert een bescheiden opregulatie van major histocompatibility complex klasse I expressie en opregulatie van co-remmende eiwit, PD-L1, maar niet die van costimulatoire moleculen, waardoor dramatische veranderingen in perifere weefsels antigenen expressie 19. Verschillende groepen hebben aangetoond lymfeklier stromale cellen brengen perifere weefsel antigenen en veroorzaken tolerantie van zelf-reactieve T-cellen 19,21-27. Daarom begrijpen van de interactie tussen lymfeknoop stromale cellen en andere migrerende en resident lymfeknoopcellen zal helpen om nieuwe targetmoleculen om activering of onderdrukking van de immuunrespons mogelijk te maken tijdens de ontsteking te vinden. Daarom wordt de uitvoering van de gepubliceerde enzymatische scheiding van de lymfeklier nodig.
Eerder verschenen protocollen maken gebruik van verschillende combinaties van collagenase-gebaseerde enzymatische digestie met lage mechanische belasting 6,19,20. Er kunnen lange incubaties met spijsverteringsenzymen of andere combinatie van enzym digestie verschillende oppervlaktemoleculen die nodig is om de activeringsstatus analyseren en nieuwe lymfeknoop stromale cellen te identificeren degraderen. Afhankelijk van het type van de stromale cel analyse, kan het protocol Link Protocol Fletcher of meer geschikt. In de beschreven procedure wordt een iets kortere enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om oppervlaktemerker afbraak van levensvatbare lymfeknoop stromacellen minimaliseren. Deze procedure maakt het mogelijk zeer reproduceerbare isolatie enonderscheid lymfeklier stromale cel populaties met lage variabiliteit en meer dan 95% levensvatbaarheid. De vers geïsoleerde lymfeknopen stromale cellen kunnen direct worden gebruikt voor oppervlakte marker expressie, eiwitanalyse, en transcriptionele studies, alsmede het instellen van stromale cellijnen functionele assays in vitro.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
In deze video publicatie en protocol, werden procedures waarbij dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de dier-protocol door de kantonrechter Autoriteit Basel-Stadt, Zwitserland goedgekeurd.
1 lymfeklieren Voorbereiding en Spijsvertering
- Verwarm water in een bekerglas tot 37 ° C op een magnetische roerder met verwarmingsplaat.
- Bereid Basic Medium als volgt: DMEM medium (zonder pyruvaat) aangevuld met 2% FCS, 1,2 mM CaCl2 en Pen / Strep (100 eenheden van penicilline, 100 ug van streptomycine).
- Steriliseren alle dissectie instrumenten worden gegeven.
- Euthanaseren lymfeklier donormuizen per CO 2 stikken en aseptisch ontleden de lymfeklieren. Niet ontleden de omliggende vet. OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor perifere huid-drainerende lymfeklier (lies, arm, oksel).
- Plaats lymfeklieren in een steriele petrischaal met 2 ml ijskoud basismedium.
- Verstoren van de lymfeklier capsule met behulp van twee 25 op 1 ml spuit wordt bevestigd G naalden.
- Breng de verstoorde lymfeknoop weefsel in een 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem bevattende 750 pi basic medium aangevuld met 1 mg / ml collagenase IV en 40 ug / ml DNAse I.
- Voeg een steriele magneetroerder in elke buis.
- Plaats buis in het bekerglas met 37 ° C voorverwarmd water en roer de buizen met een lage snelheid (1 ronde / sec) gedurende 30 minuten.
- Haal de buis uit de magneetroerder met verwarming plaat en laat lymfeklier fragmenten af te wikkelen.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof verrijkt met "non-stromale cel" zorgvuldig. OPMERKING: Als de analyse van T, B, dendritische cellen en CD45 - gp38 - CD31 - voorzien, sparen de fractie "niet-stromale cellen".
- Wash resterende lymfeklieren weefsel eenmaal met 750 pi basismedium. OPMERKING: Deze stap is alleen noodzakelijk als het werken met immuun-competente muizen.
- Laat lymfeklier fragmenten af te wikkelen.
- Verwijder denon-stromale cel-drijvende fractie.
- In de lymfeknoop fragmenten 750 ul basismedium gesupplementeerd met 3,5 mg / ml collagenase D en 40 ug / ml DNase I.
- Plaats tube terug in de beker die de 37 ° C voorverwarmd water.
- Verteren lymfeklier weefsel gedurende 5 min, terwijl langzaam roeren.
- Gedesaggregeerde lymfeklieren weefselfragmenten door pipetteren en het mengen van 700 ul voor 10 cycli bij maximale snelheid met behulp van een geautomatiseerd meerkanaalspipet. OPMERKING: Dit verstoort lymfeklier weefsel om de spijsvertering te verbeteren.
- Plaats de buis terug in het bekerglas met 37 ° C voorverwarmde water.
- Digest lymfeklieren weefselfragmenten voor nog eens 10 min, terwijl langzaam roeren.
- Disaggregeren lymfeklieren weefselfragmenten door pipetteren en mengen voor 99 cycli bij maximale snelheid met behulp van een geautomatiseerd meerkanaalspipet.
- Voeg 7,5 ul 0,5 M EDTA onderhoud van enkele celsuspensie waarborgen.
- Gedesaggregeerde lymfeklier weefsel fragmenten door pijptting en mengen voor 99 cycli bij maximale snelheid met behulp van een geautomatiseerd meerkanaalspipet.
- Voeg 750 ul basisch milieu en passeren de cellen door een 70 pm nylon mesh.
- Centrifugeer celsuspensie 5 min bij 1500 xg, 4 ° C.
- Stromale cellen kunnen nu gebruikt worden voor verdere analyse.
2 Kleuring van lymfeknooptest stromale cellen
- Gebruik van een combinatie van anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31 antilichamen TRC, LEC, BEC en DN-cellen succesvol herkennen.
- Incubeer de gedigereerde lymfeklier weefsel met Live / Dead tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) in 100 pl HBSS bevattende 2 % FCS gedurende ten minste 20 min, 4 ° C, in het donker.
- Was de cellen toevoegen van 500 l HBSS bevattende 2% FCS
- Centrifugeer celsuspensie 3 min bij 1500 xg, 4 ° C.
- Re-schorten in 100 ul van HBSS dat 2% FCS.
- Voer de gekleurde cellen in een doorstroomcytometer equippversie met de volgende optica: excitatiebron met drie lasers: blauw (488 nm, luchtgekoelde, 20 mW solid state), rood (633 nm, 17 mW HeNe) en violet (405 nm, 30 mW solid state) .
- Gate CD45 - cellen hematopoietische cellen uitsluiten.
- Gate singlets (FSC-W) en levende cellen (LEEF / DEAD tracker) om doubletten en dode cellen te sluiten.
- Plot gp38 tegen CD31 visualiseren TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) en DN (gp38 - CD31 -) cellen (zie figuur 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het huidige protocol is een aangepaste spijsvertering protocol gepubliceerd door Link et al., 2007 6 met een kortere spijsvertering tijd (45 min max) als gevolg van mechanische desaggregatie met een geautomatiseerde meerkanaalspipet. Bovendien is de procedure is gestandaardiseerd, minimaliseert degradatie van oppervlaktemerkers op verschillende lymfeknoop stromale cellen en maakt de behandeling van meer dan een monster tegelijk.
Collagenase IV en Collagenase D in Links pr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De studie lymfeknoopma- stromacellen werd onlangs onderzoek te richten door de ontwikkeling van twee gepubliceerde protocollen digestie 6,13. Beide protocollen zijn voldoende om enkele lymfeknoop stromacellen krijgen maar verschillen in het gebruik van verteringsenzymen en de tijd van de spijsvertering. Aangezien stromale cellen en hun oppervlak markers zijn gevoelig voor enzymatische digestie en mechanische belasting is een geoptimaliseerd protocol vereist.
De isolatie van levens...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Sanjiv Luther en collega's voor nuttige discussies bij het vaststellen van het huidige protocol voor lymfeklierdigestie. Dit werk werd ondersteund door SNF-subsidies PPOOA-_119204 en PPOOP3_144918 aan S.W.R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Eindconcentratie 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Eindconcentratie 1,2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 eenheden per mg drooggewicht, gebruik bij een eindconcentratie van 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | gebruik bij 3,5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | gebruik bij 40 µg/ml |
| Roermagneten | FAUST | 5 mm lang-2 mm ø | |
| Polystyreen buisjes met ronde bodem 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magneetstomer met verwarmingsfunctie | IKA-RCT-standaard | 9720250 | |
| Petrischalen 100 mm, steriel | TPP | 6223201 | |
| 25 G naalden | Terumo | ||
| anti muis CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti muis CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti muis Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti muis CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel | Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti muis CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti muis CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti muis CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti muis I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti muis CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
Referenties
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35(2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
