Methodenartikel

Gladde blaasspier Strip Contractiliteit als een methode om te evalueren Lower Urinary Tract Farmacologie

DOI:

10.3791/51807

⸱

18 augustus 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit handschrift bevat een eenvoudige, maar krachtige, in vitro methode voor het evalueren van de gladde spieren contractiliteit in reactie op farmacologische middelen of zenuwstimulatie. Belangrijkste toepassingen zijn het testen van geneesmiddelen en begrip weefsel fysiologie, farmacologie en pathologie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een in vitro werkwijze voor gladde blaasspier contractiliteit meten, en het gebruik ervan voor het onderzoeken fysiologische en farmacologische eigenschappen van de gladde spiercellen en veranderingen bij pathologie. Deze methode verschaft belangrijke informatie voor het begrijpen blaasfunctie terwijl overwinnen belangrijke methodologische moeilijkheden in in vivo experimenten, zoals chirurgische en farmacologische manipulaties die stabiliteit en overleving van de preparaten beïnvloeden, het gebruik van menselijke weefsels en / of het gebruik van dure chemicaliën. Het biedt ook een manier om de eigenschappen van elke component blaas (bijvoorbeeld gladde spier, mucosa, zenuwen) bij gezonde en pathologische condities te bestuderen.

De urineblaas wordt verwijderd uit een verdoofde dier, geplaatst in Krebs oplossing en snijd in reepjes. Strips worden geplaatst in een kamer gevuld met warme Krebs oplossing. Het ene uiteinde is een isometrische tensio bevestigdn transducer tot contractie kracht te meten, wordt het andere uiteinde op een vaste stang bevestigd. Weefsel wordt gestimuleerd door het direct toevoegen van verbindingen aan het bad of elektrisch veld stimulatie elektroden zenuwen, vergelijkbaar triggering blaas contracties in vivo te activeren. We demonstreren het gebruik van deze methode om spontane gladde spier samentrekking evalueren tijdens de ontwikkeling en na een experimentele ruggenmergletsel, de aard van neurotransmissie (transmitters en receptoren betrokken), factoren die bij modulatie van gladde spieractiviteit, de rol van individuele componenten blaas, en soorten en orgel responsverschillen farmacologische agentia. Daarnaast kan het worden gebruikt voor het onderzoeken van intracellulaire routes betrokken bij contractie en / of relaxatie van de gladde spieren, drug structuur-activiteitsrelaties en evaluatie van transmitter afgifte.

De in vitro gladde spier samentrekking werkwijze wordt veelvuldig gebruikt for dan 50 jaar, en heeft de gegevens die aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van blaasfunctie en op farmaceutische ontwikkeling van verbindingen die momenteel klinisch gebruikt voor blaas beheer ontvangen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De blaas gladde spieren ontspant urine opslagruimten, en contracten met urine eliminatie ontlokken. Ontspanning wordt gemedieerd door intrinsieke gladde spieren eigenschappen en met tonisch vrijkomen van noradrenaline (NE) van de sympathische zenuwen, die bèta-adrenerge receptoren (β 3 AR in menselijke) in de detrusor activeert. Plassen wordt bereikt door het remmen van de sympathieke input en het activeren van de parasympathische zenuwen die los ACH / ATP om de gladde blaasspier 1 contracteren. Tal van pathologische omstandigheden, met inbegrip van de hersenen en / of het ruggenmerg letsel, neurodegeneratieve ziekten, diabetes, obstructie van de blaas of interstitiële cystitis, kan diepgaand veranderen blaasfunctie, met ernstige gevolgen voor de kwaliteit van het leven 2 van de patiënt. Deze omstandigheden veranderen de contractiliteit van de gladde spieren door het beïnvloeden van een of meer bestanddelen van de blaas: de gladde spier, de afferente of efferente zenuwen en / of demucosa.

Verscheidene in vivo en in vitro methoden blaasfunctie studie ontwikkeld. In vivo, cystometry de primaire meting van blaasfunctie. Hoewel dit een intact preparaat dat het verzamelen van informatie volgens vlakbij fysiologische omstandigheden toelaat, zijn er een aantal gevallen waarin het gebruik van gladde spierstrips voorkeur. Deze omvatten situaties waarin chirurgische en / of farmacologische manipulaties het voortbestaan ​​en de stabiliteit van de in vivo voorbereiding, of gevolgen zou hebben wanneer de studies vereisen het gebruik van menselijk weefsel of dure chemicaliën. Deze werkwijze maakt ook het onderzoek van de effecten van geneesmiddelen, leeftijd en pathologie van elke component van de blaas, dwz gladde spierweefsel, slijmvliezen, afferente en efferente zenuwen.

Blaas strips zijn gebruikt door de jaren heen door vele groepen aan een aantal wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Ze werden gebruikt om te evaluate veranderingen in myogene spontane activiteit geïnduceerd door pathologie. Deze activiteit wordt geacht bij te dragen aan de urgentie en frequentie symptomen van overactieve blaas (OAB), en daarom een doelwit voor geneesmiddelen ontwikkeld voor OAB 3-9. Blaas strips werden ook gebruikt om myogene en neuronale factoren die gladdespiertonus moduleren teneinde ontdekken ionkanalen en / of receptoren en / of intracellulaire routes die kunnen worden gericht om ofwel relaxatie of contractie van de gladde spieren induceren onderzoeken 3,10- 13. Andere studies hebben zich geconcentreerd op de aard van neurotransmissie, waaronder zenders en receptoren betrokken en veranderingen bij pathologie 14,15. Bovendien is de methode gebruikt voor vergelijkingen tussen weefsels van verschillende species 16 en 18, tussen organen 19-21 en geneesmiddelresistentie van structuur-activiteitsrelaties 22-24. Een uitbreiding van deze werkwijze is gebruikt om MEASURe het effect van drugs op de zender vrijlating uit efferente zenuwen 25. Verder verscheidene weefsels (blaas, urethra, maagdarmkanaal, GI) geoogst uit dieren of mensen (bij operaties of orgaan donorweefsel goedgekeurd voor onderzoek) en van verschillende dierlijke modellen, waaronder ruggenmergletsel (SCI), obstructie van de blaas (BOO), of interstitiële cystitis (IC) kan worden onderzocht met behulp van deze techniek.

In dit document illustreren wij het gebruik van deze werkwijze, samen met de nodige experimentele protocollen toe verschillende bovengenoemde wetenschappelijke vragen te beantwoorden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures die hier beschreven worden goedgekeurd door de IACUC commissie aan de Universiteit van Pittsburgh.

1 Solutions

  1. Bereid Krebs oplossing volgens het recept. Samenstelling in mm: 118 NaCl, KCl 4,7, CaCl2 1.9, MgSO4 1.2, NaHCO3 24,9, KH 2 PO 4 1.2, dextrose 11,7.
  2. Beluchten Krebs met 95% O2, 5% CO2 en plaats deze in een 37 ° C waterbad gedurende het experiment te gebruiken. Plaats opzij ~ 200 ml beluchte Krebs oplossing bij kamertemperatuur te worden gebruikt voor weefsel dissectie.
  3. Meet pH (~ 7.4) en osmolariteit (~ 300 mOsm) van cellenbeton Krebs.

2 Experimental Set-up (Schematische figuur 1A)

  1. Vul belucht (95% O 2, 5% CO 2) kamers met 10 ml Krebs.
  2. Start de circulerende water pomp om de kamers tot 37 ° C te verwarmen; zet de benodigde apparatuur: versterker (s), stimulator (s) en opname software.
  3. Kalibreren transducers met een 1 g gewicht.

3 Tissue (Figuur 1B)

Verwijder de blaas van een volwassen naïeve vrouwelijke Sprague Dawley ratten (200-250 g; ~ 10-12 weken oud) de volgende stappen:

  1. Bereid dissectie gebied en de nodige instrumenten: elektrische scheerapparaten, pincet met tanden, scalpel, ontleden schaar, microscissors, twee ontleden verlostang (auteurs liever Dumont pincet 3 #), weefsel clips (of zijden hechtdraad), een Sylgard gecoate dissectie schotel met Krebs en weefsel dissectie pinnen.
  2. Verdoven van het dier met isofluraan inhalatie (4% in O 2) in de inductie kamer. Gebruik veterinaire zalf op de ogen tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose. Permanent toezicht op de mate van anesthesie door het observeren van de ademhaling, reactie op externe stimuli, en het verlies van de achterste ledematen reflex trekken.
  3. Wanneer het dier wordt verdoofd scheren de onderbuik eenrea. Expose de bekkenorganen via een middellijn incisie in de buik. Identificeer de blaas en plasbuis. Verwijder de blaas door te snijden op de blaashals nabij proximale urethra. Plaats weefsel direct in de Sylgard gecoate schotel gevuld met belucht Krebs oplossing.
  4. Verwijder zo nodig extra weefsel op dit moment: urethra, stukken van gastrointestinale (GI) kanaal en / of prostaatkanker, etc.
  5. Offeren van het dier met behulp van IACUC goedgekeurde methoden (bijvoorbeeld verdoving overdosis of CO 2 stikken, gevolgd door een tweede methode).
  6. Plaats weefsel kunnen ontleden door de blaas koepel, hals en ureters, de weefsel voor verdere dissectie stabiliseren. Laat het weefsel niet te rekken. Verwijder vet, bindweefsel, proximale urethra en ureters indien aanwezig.
  7. Open de blaas van de basis dome een vlakke plaat te maken, serosa omlaag / luminale omhoog (figuur 1B). Plaats ontleden pinnen op elke hoek van het weefsel. Verwijder blaas dome en nek weefsel.
  8. Indien het doel van het experiment is de bijdrage van de mucosa (urotheel en lamina propria - zie diagram figuur 1C) bepalen de gladde spiercontractie, vergelijk eigenschappen van detrusor strips met en zonder het slijmvlies gehecht. Voor deze, voorafgaand aan het snijden van het weefsel in reepjes, verwijder voorzichtig de mucosale laag met behulp van iris lente schaar en fijn pincet onder een stereomicroscoop. Na afloop van het experiment, bevestig de strips voor H & E kleuring om volledige verwijdering van de mucosa bevestigen. Merk op dat deze procedure gemakkelijker muis blaas dan in rat blaas.
  9. Snijd het weefsel in de lengte van de basis tot de koepel in reepjes van ca. 2 x 8 mm (Figuur 1B). Bind of bevestig een tissue clip aan beide uiteinden van elke strip.
    OPMERKING: Een rat blaas kan meestal in 4 stroken worden gesneden, maar het aantal stroken kunnen toenemen of afnemen afhankelijk van de dier / blaasgrootte.
  10. Breng de strips aan de experimental kamers. Bevestig een uiteinde van elke strook een krachtopnemer, waarbij de weefselsamentrekking meet, en de andere een vast glas / metaal staaf.
    OPMERKING: Tissue kamers variëren in grootte (0,2 ml tot 20 ml of groter). Typische kamers voor knaagdieren blazen zijn 5-20 ml, hetgeen voldoende hoogte voor de strips volledig worden ondergedompeld in een oplossing te voorzien. Sommige kamers zijn uitgerust met een ingebouwde stimulatie-elektroden, anderen niet. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat alle aansluitingen van de elektroden in goede staat zijn, anders elektrisch veld stimulatie is niet betrouwbaar.
  11. Breng een bepaalde hoeveelheid kracht om elke strook door voorzichtig rekken het weefsel tot basislijn spanning 1 g (~ 10 min) bereikt. Aanvankelijk weefsel neigt ontspannen welke opgeslagen als een afname van basislijn spanning. Was weefsel ongeveer elke 15 minuten met de warme beluchte Krebs en pas de basislijn spanning 1 g na elke wasbeurt. Laat weefsel equilibreren ~ 1-2 uur of tot basislijn spanning stal (dwz geen verdere ontspanning weefsel).
  12. Test levensvatbaarheid van weefsel door toevoeging van KCl (80 mM) rechtstreeks aan het bad ~ 5 minuten of totdat een plateau respons bereikt. Reacties op hoge concentraties KCl kan worden herhaald tijdens het experiment en aan het einde van het experiment en gebruikt voor het normaliseren reageren op andere geneesmiddelen of tussen stroken (zie normalisatie onder gegevensanalyse sectie).
  13. Was weefsel meerdere keren (3-5x) met de warme beluchte Krebs zodat het weefsel terugkeren naar pre-behandelingsomstandigheden.

4 Stimulatie protocollen

  1. Om de effecten van pathologie spontaan myogene activiteit of gladde spieren te onderzoeken, gebruiken gladde spier strips van verschillende diermodellen zoals SCI, BOO of neonaten. Figuur 2 illustreert het gebruik van deze methode om veranderingen in blaas spontane activiteit tijdens ontwikkeling te onderzoeken en na SCI. Bovendien kunnen farmacologische middelen worden gebruikt sp modulerenontaneous activiteit. Figuur 3 illustreert het effect van de KCNQ kanaal modulatoren, flupirtine en XE991, spontane activiteit en gladde spiertonus.
  2. Voor farmacologische gladde spierstimulatie constructie concentratie respons curven door het toevoegen van stoffen uit geconcentreerde voorraad oplossingen direct aan het bad met vaste tussenpozen. Drugsgebruik en voertuig in evenwijdige stroken om rekening te houden met het voertuig en de time effecten.
    1. Maak voorraadoplossingen van gewenste testverbindingen bij 1000x de uiteindelijke werkconcentratie. Voor carbachol (CCH), een muscarine receptor agonist, bereiden volgende aandelen: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Eindconcentraties in het bad 10 -8 M tot 10 -5 M (figuren 4C, D). Voor neuromedine B (NMB), een bombesin receptor subtype 1 agonist, bereiden volgende aandelen: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M en de uiteindelijke concentraties in het bad zijn 10 -11 M tot 10 -6 M. Zowel Cch en NMB verwachting weefsel contractiliteit te verhogen.
    2. Voor een 10 ml weefselbad, voeg 10 ul van elk CCH voorraadoplossing als de respons een plateau (Figuur 4C, D) bereikt. In evenwijdige stroken commentaar gelijke hoeveelheden van het voertuig (water). Evenzo, voeg 10 ul van elk neuromedin B voorraadoplossing om ~ 5 min.
      NB: Let op de prikkelende effect van NMB en CCH op gladde spieren in stroken van verschillende soorten in figuur 4.
    3. Onderzoek de ontspanning eigenschappen van de gladde spieren in de pre-gecontracteerd weefsel met een prikkelende stof, meestal CCH of KCl.
    4. Een agonist respons blokkeren, voorbehandelen weefsel gedurende 10-20 min met de antagonist weefselpenetratie vóór stimulatie met agonist mogelijk.
  3. Voor neurale stimlatie van de gladde spieren, ook wel elektrisch veld stimulatie (EFS), volg de stappen 1 tot 3.13 en verder zoals hieronder beschreven. EFS beoogt selectief activeren zenuwen of gladde spier. Parameters voor stimulatie moet zorgvuldig worden gekozen om direct gladde spierstimulatie voorkomen.
    1. Vast stimulatieparameters: type stimulus (enkelvoudige pulsen of treinen), duur (pulsduur en treinduur), de frequentie en intensiteit, zoals beschreven in de onderstaande stappen en weergegeven in figuren 5A, B.
      1. Voor enkele puls stimulatie, set pulsduur, inter-stimulus interval en het aantal stimuli gewenst. Gebruikelijke stimulatie duur parameters zijn enkel pulsen van 0,05-0,3 msec duur afgeleverd op de gewenste tijdstippen (Figuur 5A). Volg stap 4.3.1.4 voor stimulus intensiteit.
      2. Voor trein stimulatie, stel de trein duur en onder de trein interval. Typische waarden voor blaasweefsel worden 3-10 sec afgeleverd ten minste 1 min elkaar (figuur 5B). Als weefsel vermoeidheid optreedt (EFS weeën afnemen tijdens controleperiode), verhoging van de inter trein interval.
      3. Bepaal de frequentie van trein stimuli (aantal pulsen in een reeks - Figuur 5B). Voer een frequentie response curve variërend 0,5-50 Hz. Typische frequenties voor blaas 10-20 Hz, die reproduceerbaar en stabiel contracties gemedieerd door ATP en ACh geven. Neem de frequentieafhankelijke respons op stimulatie in EFS muis blaas stroken in figuur 5 tonen hoe deze methode kan worden gebruikt om de bijdrage van cholinerge mechanismen en purinerge neurotransmissie beoordelen.
      4. Vast intensiteit van de stimulus: systematisch de intensiteit (spanning) van de stimulus tot de amplitude van de contractie een plateau bereikt (bij gebruik van treinen houdt de frequentie constant).
      5. Stel de intensiteit van de stimulus afhankelijkdoel van het experiment. Wil men het neuraal opgewekte contracties verhogen, dan submaximale intensiteit zodanig dat de amplitude van de contractie ~ 50% van de maximale contractie. Als het doel is om de neuraal opgewekte contracties verminderen, stel de intensiteit tot ~ 80% van de maximale amplitude om weefsel vermoeidheid te voorkomen.
    2. Zodra stimulatie parameters (duur, frequentie en intensiteit) zijn gevestigd, zodat ~ 20-30 min voor EFS- opgewekte contracties gestabiliseerd drugstests.
      OPMERKING: (; 0,5-1 uM TTX) Om de selectiviteit van EFS voor neurale transmissie, blok neurale transmissie met de Na +-kanaal blocker, tetrodotoxin verifiëren. Voer deze stap aan het begin van het experiment zoals TTX wast relatief eenvoudig. Voer in het eind van het experiment (zie stap 4.3.5 hieronder.).
    3. Bereid voorraad oplossingen tegen 1000x de laatste werkende concentraties voor: alfa, bèta-methyleen ATP (ABMA, een purinergische receptor activatoren desensibilisator) 10 -2 M, atropine (een muscarine receptor antagonist) 10 -3 M (figuur 5C). Observeer andere voorbeelden in figuur 6. De 5HT4 receptor agonist, cisapride (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), verhoogt weefsel contractiliteit en SB-203186 (3 x 10 -3 M), een 5HT4 receptor antagonist, keert effecten cisapride's.
    4. Om de effecten van ABMA en atropine op EFS (figuur 5C) te testen, voeren twee controle frequentieresponscurves. Voeg 10 ul van 10 -2 M ABMA het bad voor een uiteindelijke concentratie van 10 uM. Hierdoor wordt het weefsel samentrekken door directe stimulatie van purinerge receptoren in de gladde spier. Na de reactie keert terug naar de basislijn, herhaal frequentie response curves. Voeg 10 ul van 10 -3 M atropine een definitieve concentration van 1 uM. Na ~ 10 min (nodig voor de atropine aan muscarine receptoren te blokkeren), herhaal frequentie response curves. Parallel strips 10 ul van het voertuig, water, bij elke stap.
      OPMERKING: Bij andere voorbeelden in figuur 6, voeg 10 ul van elk cisapride voorraadoplossing met vaste tussenpozen (elke 15 min ~; zie bespreking), gevolgd door 10 ul van SB-203186 voorraadoplossing direct naar bad en monitoring van de gevolgen EFS geïnduceerde contractie. Parallel strips 10 ul van het voertuig, DMSO. Houd rekening met de effecten van cisapride, een 5HT4 receptor agonist, op EFS opgewekte contracties in de menselijke blaas en ileum weefsels in figuur 6. Daarnaast acht het effect van DMSO, het voertuig voor cisapride, on-EFS opgewekte contracties in de menselijke blaas en ileum weefsels .
    5. Aan het einde van de EFS protocol verifiëren de selectiviteit van EFS door blokkering neurale transmissie met de Na + kanaal blokker, tetrodotoxine (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Als TTX resistent weeën nog steeds aanwezig zijn, is het raadzaam om de duur en intensiteit van de stimulus in de daaropvolgende experimenten passen.
  4. Voor het bepalen van de effecten van drugs op pre-of post-synaptische plaatsen (Figuur 7A) volgt u de stappen 1 tot en met 4.3.2. Vestigen reproduceerbare reacties op carbachol en EFS, voeg dan drug X.
  5. Na afloop van het experiment, wip of los stroken Dep ze voorzichtig op een stuk vloeipapier extra vocht weg en meet het gewicht elke strook met behulp van een balans. Meet ook het weefsel lengte met behulp van een schuifmaat om dwarsdoorsnede te bepalen. Deze informatie wordt gebruikt voor normalisatie van data (zie paragraaf 5.4).

5 Data Analysis

Analyseren van gegevens met behulp van adequate software (bijvoorbeeld WinDaq, LabChart).

  1. Voor spontane activiteit, selecteer een venster van ten minste 30 seconden, tot het hoogtepunt van het geneesmiddel geïnduceerde respons en measure amplitude en frequentie van myogene activiteit (figuur 3).
    1. Gebruik snelle Fourier transformatie analyse om de frequentiespectrum bijdragen tot contractiele responsen en vaststellen of er verschillen zijn tussen de verschillende delen van de blaas (bijvoorbeeld dome versus nek) of ontwikkeling, pathologie en drugs 8.
  2. Voor effecten op gladde spieren selecteer een venster van ten minste 10-30 sec vóór en tijdens de piek van het geneesmiddel geïnduceerde respons en meet de amplitude van de contractie.
  3. Voor effecten op neuraal opgewekte contracties meten amplitude, duur en gebied onder de kromme van contracties (3 minimum) vóór en tijdens de piek van de geneesmiddel-geïnduceerde reactie.
    LET OP: Het is noodzakelijk om zowel de amplitude en de omgeving te meten onder de curve van de EFS-geïnduceerde contracties omdat purinergische en cholinerge componenten hebben verschillende kinetiek. De purinergische component is snel en van voorbijgaande aard (ATP activeert purinergic ionotrope kanalen zoals P2X1 die snelle influx van calcium toe, dan ongevoelig ze), dus meer naar de top amplitude respons en minder op het gebied dragen onder de curve. De cholinerge component is langzamer en aanhoudende (ACh activeert metabotropische muscarinereceptoren, die meer tijd nodig hebben om intracellulaire wegen die uiteindelijk activeren ion kanalen die de gladde spieren depolariseren een contractie induceren activeren). Zo wordt de muscarine component gevangen beter door het meten van de oppervlakte onder de curve.
  4. Normaliseren van de gegevens te kunnen resultaten over strips en farmacologische behandelingen te vergelijken. De gekozen voor normalisatie parameter mag niet worden beïnvloed door de test verbindingen, pathologische aandoening bestudeerde of experimenteel ontwerp. Onder deze parameters gebruikt strip gewicht, dwarsdoorsnede, KCl responsen (figuur 4B),% van de maximale respons (Figuur 7B) of% van de maximale respons op andere contractiele agens(Bijv, CCH) of ontspannen middelen (bv, papaverine).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spontane myogene activiteit

Spontane myogene activiteit is een belangrijk kenmerk van glad spierweefsel dat verandert met de postnatale ontwikkeling 6-9 en pathologie (bijvoorbeeld, SCI, BOO) 3-5 ondergaat. Omdat deze activiteit wordt geacht bij te dragen tot de symptomen van overactieve blaas (OAB) 2, een evaluatie van receptoren, intracellulaire wegen en farmacologische agentia die moduleren, van groot belang voor de ontwikkeling v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige in vitro gladde spier samentrekking methode die kan worden gebruikt om een aantal belangrijke wetenschappelijke vragen blaas fysiologie en pathologie, en helpen de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van blaas dysfuncties pakken. We hebben het gebruik van deze methode geïllustreerd voor de beoordeling van ontwikkelings-, pathologische en farmacologische eigenschappen van de gladde blaasspier contractiliteit (figuren 2-4), neurotr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door NIH R37 DK54824 en R01 DK57284 subsidies aan LB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Tissue Bath System met ReservoirRadnoti, LLC159920geïsoleerde weefselbaden
Warm water recirculatorpompKent Scientific Corporation TPZ-749om weefselbaden op 37 °C te houden
Computer
Data Acquisiton SystemDataQ InstrumentsDI-710-UHOm gegevens te bekijken, op te nemen en te analyseren
Transbridge Transducer VersterkerWorld Precision InstrumentsSYS-TBM4MTransducer versterker
Grass stimulatorGrass TechnologiesModel S88Stimulator
Anesthesie systeemKent Scientific Corporation ACV-1205SOm het dier te anesthetiseren
AnesthesieboxHarvard Apparatus500116Om het dier te anesthetiseren
AnesthesiemaskersKent Scientific Corporation AC-09508Om het dier te anesthetiseren
Materialen en chirurgische instrumenten
SylgardDow Corning Corp184 SIL ELAST KITOm weefsel vast te pinnen, te disseceren en te snijden
PetrischaalCorning3160-152Om weefsel te disseceren/snijden
Insect PinsENTOMORAVIA Austerlitz Insect PinsSize 5Om weefsel vast te pinnen
Bench PadVWR International56617-014Absorbtieve onderleggers voor werkbanken
Rat chirurgische KitKent Scientific Corporation INSRATKITOm weefsel te verwijderen en te disseceren
2 Dumont #3 ForcepsKent Scientific Corporation INS500064Om weefsel te verwijderen en te disseceren
Weefsel ForcepsKent Scientific Corporation INS500092Om weefsel te verwijderen en te disseceren
ScalpelKent Scientific Corporation INS500236Om weefsel te verwijderen en te disseceren
ScalpelbladKent Scientific Corporation INS500239Om weefsel te verwijderen en te disseceren
Professionele Clipper Braintree Scientific, Inc.CLP-223 45Om vacht te verwijderen
SutuurdraadFine Science Tools18020-50Weefsel vastbinden
Weefsel ClipsRadnoti, LLC158802Weefsel aan een staaf/transducer bevestigen
1 g gewicht Mettler Toledo11119525Voor transducer kalibratie
Chemicaliën
Krebs-oplossing:
Natriumchloride
Kaliumchloride
Monobasicum kaliumfosfaat
Magnesiumsulfaat
Dextrose
Natriumbicarbonaat
Calciumchloride
Magnesiumchloride		 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		Om Krebs-oplossing te bereiden
IsofluranHenry Schein029405Om het dier te anesthetiseren
 ZuurstoftankMatheson Tri Gasox251Te gebruiken met anesthesiesysteem
Carbogen Tank (95% Zuurstof; 5% Kooldioxide) Matheson Tri GasMoxn00hn36DOm Krebs-oplossingen te beluchten

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Meting van de contractiliteitisometrische spanningstransducerelektrische veldstimulatiefarmacologische stimulatieweefsellevensvatbaarheidstestenspontane contractiliteitneurotransmissieanalysesoortvergelijkingevaluatie van geneesmiddelrespons

Gerelateerde artikelen