Het muismodel voor nier-ischemie-reperfusie-letsel dat hier wordt beschreven, bestaat uit een rechter nierectomie die controleweefsel biedt en het klemmen van de linker niersteel om ischemie te induceren, wat resulteert in acute nierbeschadiging. Dit model maakt gebruik van een midline laparotomie-aanpak met alle stappen die via één incisie worden uitgevoerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Renale ischemie reperfusie schade: een muismodel van letsel en Regeneratie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Renale ischemie reperfusie schade (IRI) is een veel voorkomende oorzaak van acute nierschade (AKI) bij patiënten en occlusie van nierbloedstroming onvermijdelijk tijdens niertransplantatie. Experimentele modellen die nauwkeurig en reproduceerbaar recapituleren renale IRI zijn cruciaal in het ontleden van de pathofysiologie van AKI en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen. Hier gepresenteerd is een muismodel van renale IRI die resulteert in reproduceerbare AKI. Dit wordt bereikt door een middellijn laparotomie benadering voor de operatie met een incisie waardoor zowel een rechter nefrectomie die controleweefsel en klemmen van de linker renale pedikel ischemie van de linker nier te induceren verschaft. Door zorgvuldige controle van de klem positie en de lichaamstemperatuur gedurende de periode van ischemie dit model behaalt reproduceerbare functionele en structurele schade. Muizen opgeofferd 24 uur na een operatie aan te tonen verlies van de nierfunctie met verhoging van het serum of plasma creatinine niveau als structurele nierschade met acute tubulaire necrose evident. De nierfunctie verbetert en acute weefselschade lost tijdens 7 dagen na renale IRI zodat dit model kan worden gebruikt om renale regeneratie te bestuderen. Dit model van renale IRI is gebruikt om de moleculaire en cellulaire pathofysiologie van AKI en een analyse van de latere nier-regeneratie te bestuderen.
Inleiding
Ischemie-reperfusie schade (IRI) is een veel voorkomende vorm van letsel voor meerdere organen, waaronder de nieren, het hart en de hersenen. Nier IRI kan leiden tot acute nierschade (AKI) bij patiënten en geen specifieke behandeling beschikbaar is. AKI als gevolg van IRI heeft een ingewikkelde pathogenese waarbij zowel het aangeboren en adaptieve immuunrespons 1. Een experimenteel model van renale IRI biedt de mogelijkheid om de belangrijkste cellen en mediatoren betrokken bij de pathogenese van AKI en de daaropvolgende regeneratie nier die volgt de daaropvolgende dagen ontleden. Verder is de effecten van nieuwe therapeutische middelen bij ziekteprocessen kan worden beoordeeld.
De algemene doelstelling van het experimentele model van renale IRI beschreven is hier om zowel acute functionele en structurele nierschade veroorzaken. Sommige onderzoekers hebben een model dat de inductie van bilaterale IRI 2 omvat gebruikt. Hoewel de bilaterale renale IRI model is van het gebruik, de eenzijdige renAl IRI model heeft het voordeel van een recht nefrectomie wordt aangebracht op het moment van de operatie. De rechter nefrectomie weefsel dient als waardevol controle weefsel in studies met een voorbehandeling stap die ofwel induceert of onderdrukt de expressie van een gen of eiwit. Zo hebben we dit model gebruikt om de voorconditionering effecten van heem arginaat (HA) injectie 24 uur vóór renale IRI 3 beoordelen. De succesvolle inductie van de cytoprotectieve enzym heem-oxygenase-1 (HO-1) door HA voordat IRI werd bevestigd in de rechter nefrectomie controleweefsel 4. HA verminderde renale IRI in oude muizen gedeeltelijk via een HO-1 afhankelijk mechanisme. Zo hebben wij het model dat in macrofaag depletie studies om de rol van macrofagen bij nier IRI 5 onderzoeken. Immunohistochemische analyse van de rechter nefrectomie weefsel kan worden gebruikt om de doeltreffendheid van de ablatie methode bevestigen. De rechter nefrectomie weefsel kan derhalve worden gebruikt om zowel bevestigen en kwantificeren van de mate van induction of remming van het molecuul van belang in elk afzonderlijk proefdier. Dit model zal van belang zijn voor onderzoekers die het gebruik van drugs of andere verbindingen om de expressie van genen of eiwitten enz. voorafgaand aan de inductie van het renale IRI moduleren.
Andere studies hebben flank incisies gebruikt om de nieren. De hier beschreven model gebruikt een middenlijn abdominale chirurgie zowel rechts nefrectomie uitgevoerd en induceren ischemie reperfusie van de linker nier. Deze chirurgische aanpak zorgt voor een uitstekende visualisatie van het chirurgische veld met inbegrip van de renale steeltjes en kleurveranderingen die renale pedikel klemming volgen. Onze gepubliceerde ervaringen met het model 4-6 geeft aan dat muizen snel te herstellen van de operatie met een bijna 100% overlevingskans.
Tenslotte kinetische analyse van het model over een periode van 7 dagen aangeeft dat dit model vertoont herstel van zowel nierfunctie en tubulaire integeresignificante tubulaire cel proliferatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING:. Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften opgelegd door de Dieren (Wetenschappelijke Procedures) Act 1986 Procedures werden uitgevoerd met behulp van steriele (autoclaaf) chirurgische instrumenten en verbruiksgoederen. Terwijl het muizenmodel van renale IRI gepresenteerde hier werd uitgevoerd op een 8 weken oude mannelijke Balb / c muis kan reproduceerbaar worden uitgevoerd op een verscheidenheid van muizen stammen van beide geslachten meestal tussen 7 jaar - 15 weken, waarbij de optimale leeftijd wezen 8 weken. De in de resultaten representatief gedeelte gegevens werden verkregen van zowel Balb / c en FVB muizen. De toepassing van verwarmde zoutoplossing wordt gebruikt om de darmen en operatiegebied vochtig maar moet zorgvuldig worden gecontroleerd en een minimum als de overmatige toepassing van vloeistoffen gehouden kan leiden tot een artefactuele verlaging van het serum of plasma creatinine niveaus, hetgeen een belangrijke experimentele uitlezing.
1. Animal Voorbereiding en Laparotomie
- Verdoven de muis met ketamine hydrochloride (70 mg / kg) en medetomidine hydrochloride (1 mg / kg) intraperitoneaal en bevestigen diepte van anesthesie door verminderde reflexen bijv. teen knijpen. De duur van de resulterende verdoving vliegtuig is 4 uur. Dit is voldoende om de gehele chirurgische procedure uit te voeren en geen aanvullende verdoving vereist.
- Verwijder het haar rondom de incisie gebied, ervoor zorgen dat het gebied vrij is van losse haren, en ontsmetten de buikhuid met behulp van een verdunde chloorhexidine-oplossing.
- Plaats de muis op een verwarmde chirurgische pad in liggende positie en bevestig de bovenste en onderste ledematen naar het pad met behulp van low-tack plakband. Zorg ervoor dat de bovenste ledematen worden onderhouden in een normale positie long compressie te voorkomen. Tijdens de gehele procedure toe op de muis voor brandwonden. Indien mogelijk is het aanbevolen dat een niet-elektrische warmtebron worden gebruikt.
- Dien de pijnstiller buprenorfine hydrochloride (0,06 mg / kg)subcutaan en oog smeermiddel op de ogen om het hoornvlies te voorkomen drogen. Analgetica zijn preoperatief toegediend om de post-operatieve herstel.
- Met behulp van weefsel scheiden van een schaar of een scalpel maak een middellijn laparotomie incisie en botweg de huid van het buikvlies te scheiden. Hierdoor kan de huid en het buikvlies afzonderlijk worden gehecht gedurende wondsluiting. Een incisie van de avasculaire linea alba wordt gemaakt die toegang geeft tot de buikholte.
- Om een duidelijk beeld van het operatiegebied te creëren plaatst u een oprolmechanisme en leg de muis.
2. Ureter Division en rechts Nephrectomy
- Duw de darmen naar de linkerkant van de buikholte met autoclaaf gesteriliseerde wattenstaafjes bevochtigd met zoutoplossing om de rechter nier en ureter bloot. Bedek de darmen met vochtig gordijnen om uitdroging te voorkomen.
- Til de rechter ureter met schuine pincet. Ligeren de juiste ureter tweemaal gebruik 6/0 silk-gevlochten hechtdraad. Voor de lange termijn experimenten, gebruik absorbeerbare hechtingen voor alle abdominale chirurgie.
- Verdeel de urineleider tussen de hechtingen. Terwijl de vesico-ureterale junctie urine moet voorkomen dat lekken in het buikvlies van de blaas de urineleider wordt afgebonden als bescherming tegen eventuele lekkage na operatie bij langdurige experimenten.
- Om gemakkelijker toegang te verlenen bij het uitvoeren van de juiste nefrectomie, duw de lever en naar rechts met een vochtig wattenstaafje en plaats te houden met behulp van vochtige gaas naar rechts nierslagader en ader bloot.
- Bot ontleden het bindweefsel en vet langs de mediale zijde van de rechter nier tot aan de rechter nierslagader en ader.
- Maak een kanaal onder de nierslagader en ader door het zorgvuldig te schuiven de schuine pincet onder de bloedvaten. Leid de forceps onder de uiteinden gesloten en verwijder voorzichtig de uiteinden open om de vorming van het kanaal te vergemakkelijken.
- Herhaal stap 2.6 tot de uiteinden van de tang zijn zichtbaar door het bindweefsel boven de renale slagader en ader. Eenmaal zichtbaar wrijf de uiteinden van de tang tegen de toppen van een andere set van schuine pincet om voorzichtig breken het bindweefsel.
- Met de nierslagader en ader duidelijk toegankelijke ze kunnen nu worden afgesloten. Schuif schuine pincet onder de nierslagader en ader met de tips gesloten. Eenmaal op zijn plaats opent de uiteinden van de tang en begeleiden de hemostatische klem applicator tussen de tips en stevig een hemostatische klem toe te passen op de nierslagader en de ader dicht bij de nieren. Als alternatief kan de nierslagader en ader kan worden afgebonden met behulp van 6/0 zijden gevlochten hechtdraad.
- Verdeel het afgesloten renale slagader en ader nabij de nieren, die nu kan worden verwijderd met de resterende hechtende bindweefsel.
- Verwijder eventuele gaas gebruikt om de lever te houden en vervang de darmen met wattenstaafjes.
3. Linker nier ischemie en reperfusie
- Duw de darmen naar de rechterkant van de buikholte met wattenstaafjes om de linker nier en urineleider bloot te leggen en afdekken met vochtige doeken. Indien nodig kan de alvleesklier kan worden afgebogen met vochtig gaas om gemakkelijker toegang te verlenen.
- Gebruik stompe dissectie voorzichtig breken bindweefsel anterior en posterior links renale slagader en ader, en vervolgens een kanaal onder de schepen in een soortgelijke wijze als in ureter sector en rechter nefrectomie beschreven stap 2.4.
- Induceren ischemie van de linker nier door een micro serrafine clip op de nierslagader en ader. Succesvolle ischemie kan visueel worden bevestigd door een geleidelijke gelijkmatige verdonkering van de nier. Bloedvaten naast de linker renale slagader en ader soms leveren de nier. Indien aanwezig, zal deze extra bloedvaten ook moeten worden afgesloten met behulp van micro serrafine clips om succesvolinduceren ischemie van de gehele nier.
- Vervang de darmen en zorgvuldig te verzekeren dat er geen abrupte wendingen die kan leiden tot intestinale ischemie compromitterende resultaten. Tijdelijk te sluiten het buikvlies met een enkele hechting.
- Na ischemie inductie onmiddellijk het muis in een homeothermic deken met een rectale thermistor aangesloten op een regeleenheid die de lichaamstemperatuur zal handhaven op 37 ° C voor de vereiste duur van ischemie. Om de geschikte lengte van ischemie noodzakelijk definiëren om de gewenste mate van nierbeschadiging en nierfalen induceren wordt aanbevolen dat een titratie van elke stam en chirurgische operator worden uitgevoerd.
- Kort voor het einde van de ischemische periode heropenen het peritoneum en zorgvuldig plaats de darmen toegang tot de klem toestaan en bekijk de nieren. Insertie van het oprolmechanisme, zoals in de video is niet nodig en is alleen uitgevoerd voor de presentatie.
- Verwijder de clamp na de periode van ischemie heeft gesloten. Onmiddellijk na het verwijderen van de nier snel kleur zal veranderen van een donker kastanjebruin op een gezonde donkerroze aangeeft succesvolle reperfusie.
- Wederom garanderen dat de darmen niet gedraaid voor het afsluiten van het peritoneum met een festonsteek met 6/0 gevlochten zijden hechtdraad. Sluit vervolgens de huid met behulp van metalen huid clips.
- Om het risico van postoperatieve infectie minimaliseren, breng een antiseptische zoals jodium / alcohol oplossing van het operatiegebied.
4. Post-operatieve herstel en verzorging
- Gedeeltelijk omgekeerde anesthesie met atipamezolhydrochloride (2 mg / kg) subcutaan toedienen en vloeistoffen met een subcutane injectie van 1 ml zoutoplossing verwarmd om uitdroging na chirurgie te voorkomen.
- Monitoren muizen zorgvuldig tot zij het bewustzijn hebben hersteld, lijken alert en in staat zijn om zichzelf rechts.
- Toestaan muizen te herstellen in een verwarmde doos bij 29 ° C, loc bewaardated in een rustige omgeving, gedurende 24 uur. Muizen zal een verminderd vermogen om thermoregulate door de anesthesie en daarom noodzakelijk dat zij gehuisvest bij een verhoogde temperatuur effectieve herstel mogelijk. Bevochtigd voer kan worden verstrekt aan vocht en voeding inname bevorderen.
- Voor de lange termijn herstel experimenten doorlopend analgetica en verwijder de huid clips 7 dagen na de operatie.
5. Beoordeling van functionele en structurele Kidney Injury and Regeneration
- Bloed kan worden verzameld uit de staartader bij experimenten of cardiale punctie bij de euthanasie aan het eind van het experiment. Meet de nierfunctie door serumcreatinine, met behulp van een creatinase gebaseerde methode, en bloed ureum stikstof (BUN) op een biochemische centrifugale analyzer zoals eerder 7 beschreven. De nierfunctie van normale gezonde muizen moet worden vastgesteld vóór de oprichting van een model van nierfalen, want dit kan sterk variëren depending op de gebruikte analysemethode bijvoorbeeld de Jaffe reactie en creatinase gebaseerde methoden voor het meten van creatinine geven verschillende resultaten.
- Onderzoek nierstructuur door histopathologie op paraffine ingebedde nierweefsel secties gekleurd met Hematoxyline en eosine (H & E) of Periodic Acid Schiff (PAS). Leg tussen 5-10 beelden op 200x vergroting binnen de buitenste strook van de buitenste medulla (OSOM) voor elke muis. Een beoordeling van de schade in het OSOM aangezien deze regio is gewond geraakt bij dit model, want het is zeer kwetsbaar voor hypoxie.
- Gebruik een van de twee scoringssystemen hieronder beschreven om acute tubulaire necrose (ATN) of regeneratie meten. Representatieve morfologie van de classificaties die in deze systemen wordt geïllustreerd in Figuur 1.
- Gebruik een eenvoudige binaire systeem te scoren ATN. Op basis van de cellulaire integriteit en morfologie merk en tel buisjes als ofwel levensvatbare (intacte cel morfologie) of necrotische (gecompromitteerd cel integriteit, abnormale cel morfologie of verlies van cellen).
- Druk het aantal necrotische tubules als percentage van het totale aantal buisjes (necrotische tubuli%).
- Classificeren regeneratie met een ander systeem op basis van cel-integriteit, morfologie en kernen nummer. Mark en tel buisjes zo gezond, necrotische, gewonde of het herstel volgens de in de volgende stappen genoemde criteria.
- Net als bij de ATN scoresysteem (beschreven in stap 5.4) merk buisjes met intacte normale cellen zo gezond terwijl buisjes met een verminderde cel-integriteit, abnormale cel morfologie of openlijke cel verlies worden gescoord als necrotische.
- Classificeren buisjes als gewond als ze een verdunde cytoplasma met enkele kernen. Daarentegen wijst buisjes die meer kernen met meer normale celmorfologie en winnen.
- Uiten elk buisje kwalificatie als een percentage van het totale aantal tubulus.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tubulaire schade en herstel kan worden beoordeeld door H & E of PAS kleuring van coupes volgende renale IRI. Buisjes binnen de OSOM worden geclassificeerd als gezond, verwond, necrotische of herstellen volgens celmorfologie, integriteit en kernen nummer (Figuur 1). De functionele en structurele schade in dit model is afhankelijk van de duur van de ischemie. Een geleidelijke verhoging van de ernst van de nierfunctiestoornis, beoordeeld door plasma creatinine en BUN, is duidelijk als de duur van de is...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Nier IRI is een belangrijke oorzaak van AKI met geen specifieke behandeling beschikbaar. De experimentele studie van renale IRI is zeer informatief met eerder werk demonstreren de rol van macrofagen, dendritische cellen, lymfocyten, regulatoire T-cellen en andere cellen en mediatoren in de inductie van zowel de acute schade en genezingsfase 5,8 geweest - 16. Daarnaast heeft renale IRI gebruikt om het effect van verschillende therapeutische middelen 4,17-19 beoordelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende of tegenstrijdige belangen te onthullen.
Dankbetuigingen
Het huidige onderzoek werd ondersteund door subsidies van Kidney Research UK (ST4/2011), de Cunningham Trust (CT11/14) en de Mrs EA Hogg's Charitable Trust.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tissue schaar | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
| Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
| S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
| Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
| Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
| Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Standard Heat Matt | |||
| Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| Lacri-Lube | Allergan | ||
| Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
| Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml oplossing | ||
| Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
| Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
| Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
Referenties
- Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
- Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
- Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
- Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
- Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
- Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
- Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
- Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
- Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
- Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
- Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
- Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
- Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
- Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
