Muizen hoornvliestransplantatie: een model om de meest voorkomende vorm van een orgaantransplantatie Bestudeer

Samenvatting

Muizen zijn gebruikt als een model voor het bestuderen van vele vormen van transplantatie, inclusief hoornvliestransplantatie. We beschrijven in dit rapport een muismodel voor zowel acute als late-term hoornvliestransplantatie.

Samenvatting

Hoornvliestransplantatie is de meest voorkomende vorm van orgaantransplantatie in de Verenigde Staten met tussen de 45.000 en 55.000 procedures die jaarlijks worden uitgevoerd. Hoewel er verschillende diermodellen bestaan voor deze procedure, zijn muizen de soort die het meest wordt gebruikt. De redenen voor het gebruik van muizen zijn de relatieve kosten van het gebruik van deze soort, het bestaan van veel genetisch gedefinieerde stammen die de studie van immuunresponsen mogelijk maken, en het bestaan van een uitgebreid scala aan reagentia die kunnen worden gebruikt om reacties in deze soort verder te definiëren. Dit model is gebruikt om factoren in het hoornvlies te definiëren die verantwoordelijk zijn voor de relatieve immuunprivilegestatus van dit weefsel dat hoornvliesallotransplantaten in staat stelt om acute afstoting te overleven in de afwezigheid van immunosuppressieve therapie. Het is ook gebruikt om die factoren te definiëren die het belangrijkst zijn bij de afstoting van dergelijke allotransplantaten. Bijgevolg is veel van wat we weten over de mechanismen van zowel acceptatie als afstoting van hoornvliesallotransplantaten te danken aan studies die een muurmodel van hoornvliestransplantatie gebruiken. Naast het beschrijven van een model voor acute hoornvliesallotransplantaatabstoting presenteren we ook voor het eerst een model van late hoornvliesallotransplantaatabstoting.

Inleiding

Hoornvliestransplantatie is een van de meest succesvolle en voorkomende soorten transplantaties uitgevoerd bij mensen. De redenen waarom deze operatie wordt uitgevoerd zijn een gevolg van letsel, infectieziekten ^1, of andere vormen van niet-infectieuze ziekten hoornvlies ^2. Uit cijfers van de Eye Bank Association of America geven aan dat meer dan 46.000 werden uitgevoerd in 2011 (zie website: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Een indicatie van het succes dat één jaar uitval allogene corneale transplantaten van 10 tot 15% en 5 jaar het succes dan 70% ^3-8. Zoals veel studies hebben aangetoond, is het succes van corneale transplantaten direct gerelateerd aan het feit dat het oog een immunologisch begunstigde plaats. Factoren die verantwoordelijk zijn voor de cornea hoedanigheid immune privilege site zijn indien zowel bloed- en lymfevaten in de cornea, een relatieve afwezigheid van antigen presenterende cellen, factoren die door het hoornvlies dat te onderdrukkens immune effector funtions ^9-15, lage expressie van MHC antigenen ^16, en de expressie van FasL ^17-20.

Ondanks deze factoren predisponeren deze enten voor succes, ze ondergaan afwijzing ^3-7. Een goed begrip van de mechanismen die deze afwijzing bemiddelen alsook het testen van verschillende therapieën om afstoting te voorkomen, is van cruciaal belang. Daartoe beschrijven wij hier een muizenmodel van hoornvliestransplantatie die in gebruik voor meer dan 20 jaar hoornvliestransplantatie bestuderen in een gecontroleerde experimentele omgeving. Aangezien transplantatie responsen vertonen talrijke factoren daarbij samenwerken die uiteindelijk bepalen of de getransplanteerde weefsel of valt, is het niet mogelijk om het belang van deze factoren in een in vitro model te begrijpen. Bijgevolg zijn studies met behulp van intacte dieren nodig om te bepalen welke factoren belangrijk om ofwel succes of failu zijnre van getransplanteerde weefsel.

Terwijl andere diersoorten zijn gebruikt voor hoornvliestransplantatie studie, het murine model heeft verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van andere soorten. De eerste is het bestaan ​​van vele stammen van muizen die bepaalde transgenen tot expressie of zijn gen-gerichte expressie van specifieke immunologische factoren waarvan de functie in transplantatie beter worden bestudeerd ontbreekt. Daarnaast zijn er vele reagentia (zowel recombinante factoren en antilichamen die factoren neutraliseren) die specifiek zijn voor muizen die niet bestaan ​​voor vele andere diersoorten. Vanwege het bestaan ​​van deze factoren, is dit model uitgebreid gebruikt om relevante factoren die bij acute corneale transplantaatafstoting reacties ^{15, 17,18,20 -29} identificeren. Bovendien zijn veel van de bij hoornvliestransplantatie factoren bekend functioneel transplantatie van andere weefsels zijn.

Protocol

OPMERKING: Alle dieren die in deze procedure worden behandeld in overeenstemming met de Association for Research in Vision en Oogheelkunde verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research evenals de vastgelegd door het dier toezichtscommissie op Saint Louis University richtlijnen.
OPMERKING: Chirurgische instrumenten en oplossingen voorafgaand aan de operatie gesteriliseerd microbiële infectie van het oog beperken. Opgemerkt moet worden dat terwijl de dieren ervaren wat pijn van deze procedure hebben we geen analgetica dienst. De reden hiervoor is dat alle analgetica en anti-inflammatoire sinds hoornvliestransplantatie reacties omvatten ontsteking, zou het gebruik van anti-inflammatoire geneesmiddelen ons vermogen te bepalen welke factoren zijn betrokken bij corneale transplantaatfalen compromitteren.

1. Anesthesie

1. Plaats donor en ontvanger muizen onder narcose door IP injecties van ketamine (86.98 mg / kg) en xylazine (13.04 mg / kg).
2. Houd de ontvanger muis onder verdoving gehele procedure duurt gewoonlijk 30 minuten tot een uur. Bijgevolg voortdurend de muis op tekenen van weer bij bewustzijn.
3. Breng puralube zalf voor het oog die geen operatie ondergaat nadat het dier verdoofd tot droog voorkomen.

2. Cornea enten

1. Het verkrijgen van de donor knop hoornvlies.
   1. Zodra het dier volledig verdoofd, bereiken adequate mydriasis door toediening van een enkele oogdruppels van 1% tropicamide en 2,5% fenylefrine hydrochloride.
   2. Plaats de kop van de donor dier horizontaal op een bord geplaatst op een stevige beweegbare steun. Bevestig de kop met een strook tape in de nek te zorgen dat het oog in een horizontale positie tijdens de hele operatie.
   3. Met behulp van een 2 mm diameter trephine, wiens tip werd geverfd met methyl blauw, uitLangs de centrale cornea transplantaat website.
   4. Met een scherp mes, dringen de cornea en injecteer Healon in de voorste kamer te verdiepen om de kans op beschadiging van de donor endotheel en onderliggende lens verminderen.
   5. Accijnzen de donor transplantaat met Vannas schaar en plaats in een schotel met Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing tot gebruik.
   6. Nadat de donor transplantaat het is verwijderd, euthanaseren de donor muis via CO ₂ inademing.
2. Voorbereiden van het transplantaat bed.
   1. Herhaal dezelfde stappen als beschreven in 2.1.1 tot 2.1.2 voor de ontvanger.
   2. Met behulp van een 1,5 mm diameter trephine, een overzicht van de ontvanger graft website.
   3. Met een scherp mes, dringen de cornea en injecteer Healon in de voorste kamer te verdiepen om de kans op schade aan de onderliggende lens.
   4. Verwijder de geschetste centrale knop hoornvlies van de ontvanger met behulp van Vannas schaar en gooi ze weg.
3. Het hechten van deent
   1. Plaats de donor hoornvlies over de graft bed in het hoornvlies van de ontvanger. Zorg dat er voldoende Healon onder de donor hoornvlies van de donor endotheliale cellen tegen beschadiging door direct contact met lens.
   2. Bij gebruik van zeer fijne getipt microforceps, plaatst u de eerste hap van 11-0 nylon hechtdraad in de donor kant, door de donor met 90% diepte van volledige dikte aan kant ontvanger, dan afhechten.
   3. Zodra het hoornvlies plaats verankerd, uitvoeren midcardinal onderbroken hechtingen zodanig dat het hoornvlies 8-10 totaal hechtingen en de donor hoornvlies stevig uitgelijnd met en aan de ontvanger cornea transplantaat bed.
4. De verdieping van de voorste oogkamer
   1. Verdiepen van de voorste oogkamer door het injecteren van HBSS of luchtbel in de voorste kamer en laat zachtjes de integriteit van de cornea transplantaat op lekkage met een cellulose spons.
      OPMERKING: Als de voorste oogkamer niet hervormd kan worden, dan is er een grote kans op cataract die toekomstige evaluaties van de getransplanteerde hoornvlies zeer moeilijk zal maken en zal ook kunnen leiden tot donor hoornvlies endotheel disfunctie en dus graft mislukking.
5. Eindevaluatie
   1. Observeer het oog om te bepalen dat de leerling is rond en de diepte van de voorste oogkamer is normaal.
      OPMERKING: Als de leerling niet rond is, betekent dit dat tijdens het hechten van de iris beschadigd was en dus de graft wordt beschouwd als een technische storing.
   2. Breng antibiotische zalf voor het oog. Optioneel: Sluit het deksel oog met een 7-0 zijden hechtdraad.
   3. Acht muizen tot ze volledig wakker en vervolgens afzonderlijk huis ze ten minste twee dagen na de operatie.

3. het verwijderen van hechtingen

1. In die gevallen waarin deksel hechtdraad wordt gebruikt, verdoven muizen zoals hierboven beschreven en verwijder het deksel hechting 48 uur.
2. Verdoven muizen op dag 7 na de operatie. Verwijder de sutures vastzetten van de cornea transplantaat. Zodra de hechtingen worden verwijderd en het dier is volledig ontwaakt, terug in de kooi.

4. Klinische Evaluatie

1. Onderzoek het oog voor indicaties van procedurele complicaties waaronder, cataract (vertroebeling van de lens), hyphaema (bloed in de voorste oogkamer), een voorste kamer die is niet van de juiste diepte, of belangrijke dekking van het hoornvlies. Beschouw die deze complicaties te tonen als "gecompromitteerd" en euthanaseren hen door CO ₂ inhalatie.
   1. Voer alle onderzoeken op niet-verdoofde muizen. Houd de muis met één hand aldus de muis beperken zodat de andere kant het oog proptose een beter zicht van het oog mogelijk. Zodra waarnemingen zijn voltooid, terug het dier naar zijn kooi.
2. Heeft waarnemer onbekend met de behandelingsgroepen beoordelen getransplanteerd hoornvlies 2 tot 3 keer per week op tekenen van corneale transplantaatafstotingsepisodes of cornea transplantaat falen. Gebruik ofwel de chirurgische microscoop of een horizontale spleetlamp biomicroscope voor deze waarnemingen.
   1. Evalueer elke hoornvlies voor dekking met behulp van een schaal van 0 tot 5. De schaal is als volgt gedefinieerd:
      1. Wijs een score van 0 tot degenen hoornvliezen dat er geen tekenen van ondoorzichtigheid hebben.
      2. Wijs een score van 1 tot degenen hoornvliezen die minimale oppervlakkige ondoorzichtigheid tonen.
      3. Wijs een score van 2 tot en met hoornvliezen die mild en dieper dekking geven, maar de onderliggende pupil en iris zijn nog steeds waarneembaar.
      4. Wijs een score van 3 tot hoornvlies stroma dat opaciteit geven waarbij de iris niet zichtbaar in detail met uitzondering van de pupil marges.
      5. Wijs een score van 4 tot hoornvlies dat dichte stromale ondoorzichtigheid weer en als er geen onderliggende structuren kunnen worden bekeken.
      6. Wijs een score van 5 tot hoornvlies dat volledige dekking en intensieve stromale oedeem, met pupil en iris weer helemaal verduisterd.
   2. Ook evalueren elke cornea voor de mate van bloedvat infiltratie (neovascularisatie) met een beoordelingsschaal van 1 tot 8. Om dit te bereiken, bekijk de cornea als bestaande uit 4 gelijke kwadranten en bepalen de hoeveelheid bloedvaten in elk van deze kwadranten met een scoren die zullen variëren van 0 (geen schepen) tot en met 2 voor een uitgebreide vascularisatie van dat kwadrant. Voeg de individuele scores van elk kwadrant naar de finale neovascularisatie score te berekenen.
   3. Classificeren hoornvliezen als acuut afgewezen als zij een score van 3 voor twee opeenvolgende waarnemingen voor tijd wijst tot 5 weken.
   4. Classificeren muizen waarvan de hoornvliezen waren duidelijk bij 5 weken, maar ontwikkelen opacificatie soms> 45 dagen na het aanslaan, met een score van 3 voor twee opeenvolgende tijdstippen, zoals het hebben ondergaan late termijn hoornvlies allograftafstoting. Gebruik Kaplan-Meier survival curves om graft survival analyseren.

5. Manipulatie van het model

in-left: 40px; ">

Bereiding van afzonderlijke cellen uit de milt.

1. Om enkele cellen te bereiden, eerst euthanaseren de donor muis. Verwijder vervolgens de milt.
2. Plaats de milt in een cel zeef en verstoren met een zuiger van een injectiespuit 3 ml.
3. Was de cellen en resuspendeer in 10 ml Hanks gebalanceerde zoutoplossing.
4. Breng 10 pl celsuspensie en voeg 10 ul van 0,4% trypan blauw en meng. Toevoegen dat aan hemocytometer en tel de cellen in het centrale rooster. Het aantal cellen in de buis celgetal 10 x ⁴ x 2 (verdunningsfactor trypan blauw) x 10 (volume in de buis).

Injectie in de voorste oogkamer.

1. Verdoven muizen zoals eerder beschreven.
2. Voer injecties met behulp van een dissectie microscoop. Voor elke intracamerale injectie, gebruik 10 ⁶ miltcellen in een 0.005 ml volume en een 0,25 ml microliter injectiespuit voorzien van een 33 G naald.
   OPMERKING: Andere manipulatiesvan het model kan worden uitgevoerd door behandeling van dieren met reagentia die fungeren als agonisten of antagonisten of de rol die een bepaalde factor spelen na orthotope corneale transplantaatafstoting chirurgie bepalen.

Resultaten

Het muizenmodel van hoornvliestransplantatie is al meer dan 20 jaar succesvol mechanismen van beide corneale transplantaatafstoting ^19-23 en corneale transplantaatafstoting acceptatie ^{13, 15,16,18, 24-27} karakteriseren. Dit model werd gebruikt om het belang van FasL expressie vaststellen cornea allograft acceptatie, dat dieren die FasL missen waren niet in staat om corneale transplantaten ¹⁵ accepteren. Het is ook gebruikt om aan te tonen dat vasculaire endotheliale groeifactor receptor ...

Discussie

Het muizenmodel van hoornvliestransplantatie hier beschreven kan de onderzoeker menselijke hoornvlies allograft afstoting bestuderen in een model dat voorspellend is welke factoren zijn best geassocieerd met zowel afstoting ^{15,17,18,20, 26-30} en ^21-25 acceptatie van corneale allografts. Unlike menselijke cornea transplantatie, waarbij patiënten worden gegeven als topische of systemische behandeling steroïd of behandelen of voorkomen van afstoting ^31, is dit model meestal gebruikt om de f...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154