Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) Microscopie Visualiseert Farmaceutische Tabletten tijdens het oplossen

Samenvatting

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gecombineerd met een intrinsieke doorstroom ontbinding opstart om in situ en real-time visualisatie van het oppervlak van farmaceutische tabletten ondergaan oplossen. Met behulp van deze custom-built setup, is het mogelijk om auto's te correleren met drugs oplosprofielen opgenomen met inline UV-absorptie spectroscopie.

Samenvatting

Traditionele farmaceutische oplossingstesten bepalen de hoeveelheid geneesmiddel opgelost in de tijd door het meten geneesmiddelgehalte in het oplosmedium. Deze methode geeft weinig directe informatie over wat er gebeurt op het oppervlak van de oplossende tablet. Het oppervlak tablet samenstelling en structuur tijdens oplossen kan veranderen, is het essentieel om te volgen tijdens oplossingstesten. In dit werk coherent anti-Stokes Raman scattering microscopie wordt gebruikt om het imago van de oppervlakte van de tabletten tijdens het oplossen terwijl UV-absorptie spectroscopie wordt gelijktijdig verstrekken inline analyse van opgeloste concentratie van het geneesmiddel voor tabletten met een mengsel van 50% van theofylline anhydraat en ethyl cellulose. De metingen toonden aan dat in situ CARS microscopie kan beeldvorming selectief theofylline in aanwezigheid van ethylcellulose. Daarnaast is de theofylline anhydraat omgezet in theofylline monohydraat tijdens oplossen, met naaldvormige huilenStals groeien op het tablet oppervlak tijdens oplossen. De omzetting van theofylline anhydraat tot monohydraat, gecombineerd met verminderde blootstelling van het geneesmiddel aan het stromende oplosmedium resulteerde in verminderde oplossnelheden. Onze resultaten tonen aan dat in situ CARS microscopie gecombineerd met inline UV absorptie spectroscopie kan bewaken Farmaceutische tablet oplossen en correleren oppervlak verandert met veranderingen in de oplossnelheid.

Inleiding

Tijdens de ontwikkeling van orale farmaceutische doseringsvormen zoals tabletten en capsules er nadruk op oplossingstesten. Orale doseringsvormen moeten lossen voordat ze kunnen worden opgenomen voor therapeutische werkzaamheid. Slecht oplosbare geneesmiddelen hebben in het algemeen problemen het bereiken van een voldoende concentratie die oplostesten bijzonder belangrijk ¹ maakt. Farmacopee ontbinding methoden worden het meest gebruikt voor ontbinding analyse. In de meeste gevallen vereist het bereiden van het geneesmiddel als tablet of capsule die vervolgens wordt geplaatst in een bekerglas van vloeiende oplosmedium. Het opgeloste geneesmiddel concentratie wordt dan bepaald door het analyseren van monsters van het oplosmedium met een standaard spectroscopische technieken zoals UV absorptie spectroscopie ^2. Deze traditionele farmaceutische oplossing methoden geven geen directe analyse van het monster of veranderingen die opgetreden in het oplossen oppervlak van de doseringsvorm.Directe analyse van het monster tijdens het oplossen kunt meer informatie over het oplossen toedieningsvorm bieden en mogelijk problemen op te sporen waardoor dissolutietest mislukking.

Directe analyse van oplossende doseringsvormen vereist het gebruik van in situ analysetechnieken die kan monitoren het oplossingsproces zijn. Opnemen in situ tijdens oplossen analytische techniek niet beïnvloed door de aanwezigheid van het oplosmedium en de techniek heeft een hoge tijdsresolutie betrouwbaar wijzigingen in het oplossende doseringsvorm in de orde van seconden gemeten. Verzwakte totale reflectie UV-spectroscopie is geschikt gebleken voor het meten van veranderingen tijdens oplossen te zijn maar mist ruimtelijke resolutie door beeldvormingstechnieken ^3. Traditionele farmaceutische beeldvormingstechnieken zoals scanning elektronen microscopie (SEM) en spontane Raman mapping beide beperkende factoren voorkomen van het gebruiksitu tot ontbinding.

SEM beeldvorming is een hoge-resolutie snelle beeldvormende techniek staat beeldvorming het oppervlak van farmaceutische doseringsvormen. Echter, SEM beeldvorming in het algemeen uitgevoerd onder vacuüm en vereist monster coating waardoor het niet geschikt voor in situ ontbinding beeldvorming. Vezel gekoppelde spontane Raman spectroscopie gecombineerd met een doorstroomcel en UV doorstroming absorptiespectroscopie, is uitgevoerd om verschillende drugs systemen in situ bewaken tijdens oplossen, zoals theofylline ^4, carbamazepine en indomethacine ^5. Raman spectroscopie in staat was om te identificeren oppervlak veranderingen die tijdens het oplossen, maar het gaf geen ruimtelijke informatie over waar het oppervlak veranderingen optraden. Spontane Raman mapping gebruikt Raman-spectra en geeft ruimtelijke informatie over het oppervlak van het monster maar beeldvorming neemt de orde van minuten tot uren afhankelijk van het gebied, waardoorhet niet geschikt voor in situ oplossen beeldvorming.

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie is een snelle beeldvormende techniek en gecombineerd met inline UV-absorptie spectroscopie, heeft het ons toeliet om een techniek die in staat van ontbinding in situ analyse te ontwikkelen. CARS microscopie levert snelle chemisch selectieve beeldvorming die niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van oplosmedium waardoor het een geschikte techniek in situ oplossen analyse. CARS technieken worden grofweg verdeeld in twee groepen op basis van de pulsduur van de laser; een wezen smalband CARS (picoseconde gepulste lasers), en de andere is breedband CARS (femtoseconde gepulste lasers). Een typisch CARS microscoop bestaat uit twee gepulste laserbronnen en een omgekeerde microscoop. Een CARS signaal te produceren, een van de gepulste lasers moet afstembaar zijn zodat er een frequentieverschil tussen de twee lasers die een Raman trilling past. Bovendien,de twee lasers moeten overlappen in de ruimte (ruimte) en tijd (tijd), met pulsen van beide lasers die bij hetzelfde gebied van het monster tegelijk. Raman trillingen zijn chemisch specifieke en CARS signaal wordt alleen gegenereerd binnen het brandpunt volume van de microscoop, CARS microscopie is in staat om chemisch selectieve beeldvorming met een resolutie tot de diffractie limiet.

Smalband CARS microscopie met behulp van een enkele Raman vibratie laat ongeveer 100x sneller beeldvorming ten opzichte van spontane Raman-mapping technieken ^6. Breedband CARS microscopie beelden over een breder spectrum (600-3,200 cm ^-1 vs ~ 4 cm ^-1), maar heeft een lagere spectrale resolutie (ongeveer 10 cm ^-1 vs ~ 4 cm ^-1) en langzamer afbeeldingssnelheid (50 msec / pixel vs ~ 5 usee / pixel) in vergelijking met smalband CARS microscopie ^7.

Smalband CARS microscopie is gebruikt om het drug vrijlating van enkele farmaceutische systemen. Op het gebied van farmaceutische formuleringen, Kang et al.. ^8-10 afgebeeld geneesmiddel geladen polymeerfilms. Aanvankelijk afgebeeld zij de verdeling van het geladen geneesmiddel, gevolgd door beeldvorming van de geneesmiddelafgifte uit een statisch oplosmedium. Jurna et al.. ¹¹ en Windbergs et al.. ¹² ging een stap verder en eerst afgebeeld de theofylline verdeling in lipide toedieningsvormen gevolgd door beeldvorming van de drug ontbinding met behulp van een dynamische oplosmedium.

We hebben een nieuwe analytische methode om het oppervlak veranderingen op de tablet die een ontbinding met smalband CARS microscopie tijdens het opnemen van de opgeloste concentratie van het geneesmiddel met UV-absorptie spectroscopie tegelijk monitoren ontwikkeld. We illustreren het gebruik van deze methode beeldvorming tabletten die het modelgeneesmiddel theofylline gecombineerd met ethylcellulose ondergaan oplossen met water als oplosmedium.

Protocol

Figuur 1. Schematische illustratie van het CARS microscoop setup met de intrinsieke stroom door ontbinding setup. Is dit cijfer aangepast is Fussell et al. ^13.

1. System Startup

1. Zet de 20 psec puls 1064 nm laser en CARS zodat de laser opwarmen (ongeveer 1,5 uur).
2. Schakel de deuterium lamp UV-lichtbron en laat deze warm-up (ca. 10 min).
3. Open de sluiter op de deuterium lamp UV-lichtbron door de ontspanknop in de stand "open".
4. Zet de microscoop besturings-pc en de microscoop besturingssoftware openen.
5. Zet de UV spectrometer PC en de spectrometer besturingssoftware openen.

2. Microscope Setup

1. Selecteer de gewenste microscoop doelstelling. Gebruik een 20X/0.5 NA doelstelling om de informatie die in dit werk resultaten te bereiken.
2. Zet de filters in het filter set torentje om excitatie lasers zenden en weerspiegelen de CARS-signaal. Selecteer een 775 nm lange pas dichroic spiegel en een 650 nm band-pass 40 nm filter om de in dit werk resultaten repliceren.
3. Plaats de juiste filters voor de fotomultiplicatorbuis (PMT) detector die zenden CARS signaleren en filteren ongewenst licht. Filtreer het licht met een 750 nm korte-doorlaatfilter en een 650 nm band-pass 40 nm filter om de experimenten in dit werk te reproduceren.

3. Testen van het systeem

1. Schakel de peristaltische pomp en de pomp oplossingsmedium enkele minuten door de Z-vormige UV-stroomcel voorgaande vloeistof te verwijderen uit de leidingen.
2. Bepaal het debiet van de pomp door het wegen van de hoeveelheid oplosmedium gepompt 2 minuten. Pas pompsnelheid until gewenste debiet bereikt is. Pomp oplosmedium met een stroomsnelheid van 5 ml / min de resultaten die in dit werk te bereiken.

4. UV Ontbinding Meting

1. In het UV-spectrometer control software, klik op het menu "Bestand" en klik op 'Nieuwe absorptie meting "om een ​​venster waarin alle beschikbare spectrometers lijsten openen.
2. Klik op de juiste UV-spectrometer, en klik vervolgens op "Volgende" om een ​​venster waarin de data-acquisitie parameters weergeeft openen.
3. Definieer zowel de integratie tijd en de spectrale middeling. Kies een integratie tijd van 150 msec met 200 gemiddelden om de in dit werk resultaten repliceren.
4. Klik op de knop "Volgende" om het scherm gebruikt om de referentie-spectrum opnemen brengen.
5. Klik op de knop die verschijnt als een gele gloeilamp om een ​​referentie spectrum op te nemen. Pomp oplosmedium continu tijdens deze meting.
6. Sluit de sluiter op de deuterium lamp UV-lichtbron door de schakelaar op "gesloten".
7. Klik op de knop "Volgende" om het scherm aan het donker gewend spectrum opnemen brengen.
8. Klik op de knop die verschijnt als een grijze gloeilamp naar een donkere spectrum op te nemen. Pomp oplosmedium continu tijdens deze meting.
9. Klik op de knop die zegt "Finish" om de UV-absorptie metingen beginnen.

5. CARS Ontbinding Video

1. In het CARS microscoop besturingssoftware klik op de knop die een "XYT" meting selecteert.
2. Klik op het drop-down box en selecteer de beeldgrootte in pixels. Selecteer een beeldformaat van 512 x 512 pixels om de beelden die in dit werk te reproduceren.
3. Sleep de belichtingssnelheid schuifregelaar om ofwel de "snelle", "gemiddeld" of "langzaam" positie. Gebruik de snelle scansnelheid (1,12 sec per beeld) te bereikende in dit werk resultaten.
4. Klik op de pijlen met het label "zoom" om het zoomniveau aan te passen. Selecteer "2x" zoomen naar het niveau van de zoom en het gezichtsveld (350 x 350 micrometer) die voor deze resultaten te repliceren.
5. Klik op de keuzelijst en selecteer het doel gebruikt.
6. Klik op het invoerveld en typ het aantal beelden die nodig zijn voor de CARS ontbinding video (afhankelijk van de duur van het experiment). Voeren ontbinding om ongeveer 15 minuten door het opnemen van 900 frames met de in dit werk de resultaten te reproduceren.

6. CARS Golflengte Tuning

1. De optische parametrische oscillator (OPO) controller stel de instellingen van de OPO zoals temperatuur, piëzo positie en Lyot filter positie tot maximaal laserprinten de gewenste Raman-frequentie wordt bereikt. Stem de OPO naar 2960 cm ^-1 tot dezelfde resultaten als die welke in dit artikel op te nemen.

7. De ontbinding Experiment

1. Plaats een tablet in de monsterhouder van de custom-built CARS stromen cel, schroef de sample houder goed gesloten om lekkage te voorkomen.
2. Bevestig de leidingen op de CARS stromen cel aansluiten van de CARS stromen cel naar de beker die de ontbinding medium en de peristaltische pomp.
3. Plaats de CARS stroom cel met een tablet op de microscoop podium.
4. Controleer dat de CARS stroom cel is aangesloten op de oplosmedium beker, de peristaltische pomp, de Z-vormige UV stroom cel en de afvalinzameling beker.
5. Klik op de "XY repeat" knop om de scanning microscoop systeem starten in een functie continu-scan.
6. Pas de focus van de microscoop in door de doelstelling tot het oppervlak van de tablet in het gezichtsveld op het scherm microscoop controle.
7. Klik op de schuifbalk in de microscoop besturingssoftware label "PMT". Pas de gevoeligheid van de detector door het verhogen / verlagen van PMT spanning totbevredigende beeldkwaliteit (noch te donker noch verzadigd) is zichtbaar op het scherm. OPMERKING: Zorg dat u de PMT niet overbelast door een hoog voltage. Voor dit werk, gebruikten we een PMT-spanning ongeveer 600 V, maar dit kan variëren naargelang de PMT gebruikt.
8. Klik op "Stop" in de microscoop besturingssoftware aan de continue scan te stoppen.
9. Tegelijkertijd (of zo dicht bij elkaar mogelijk) start pompen oplosmedium, opname start een XYT scan, en beginnen met het verzamelen UV absorptiespectra.
10. Tijdens de ontbinding experiment, toezicht houden op de video-opname uit en stel de microscoop nadruk te zorgen voor de tablet is voortdurend in focus.

8. Bericht Ontbinding

1. Stop de peristaltische pomp door hem uit.
2. Klik op het menu "Bestand" en klik op "Opslaan als video" op de microscoop besturingssoftware aan de XYT scan wilt opslaan als een video.
3. Klik op het menu "Bestand" en klik op 'Opslaan "en klik op" Stop Export "op de spectrometer besturingssoftware om de inzameling van UV-absorptie spectra te stoppen.
4. Verwijder de CARS stromen cel van de microscoop podium en verwijder de tablet uit de CARS stroom cel.
5. Was de CARS stromen cel met behulp van water en ethanol, en daarna droog met vloeipapier.

Resultaten

In situ ontbinding analyse met behulp van CARS microscopie werd uitgevoerd op tabletten (12 mm diameter, plat oppervlak) met een 50:50 mengsel van het model geneesmiddel theofylline anhydraat en ethylcellulose met gedestilleerd water gepompt met 5 ml / min als de ontbinding medium. CARS beelden (512 x 512 pixels) werden verzameld om 1,12 sec bij de Raman trillingsfrequentie 2960 cm ^-1 die selectief is voor de theofylline inhoud van het tablet gedurende de duur van het experiment ontbinding. Figuur 2 toont geselecteerde frames uit de ontbinding video. Aan het begin van oplossing (figuur 2, tijdstip 0 sec) er gebieden van groene tonen de theofylline inhoud van het tablet en zijn ook donkere gebieden waar slechts ethylcellulose op het oppervlak van het tablet. In de donkere gebieden op het oppervlak van de tablet is het mogelijk om de ethylcellulose inhoud vaag bekijken. Dit is omdat het is gemeld dat ethyl cellulose heeft Raman trillingsfrequenties met maxima rond 2930 en 2975 ^{cm-1 14.} Na ongeveer 60 seconden blijkt er begin theofylline monohydraat kristalgroei op het oppervlak kan worden gezien als smalle naaldvormige kristallen naar buiten groeien van ten minste een kristal kern in het midden van het beeld (figuur 2 keer 60 sec) worden . Het monohydraat kristalgroei kan veel duidelijker gezien na 130 seconden (Figuur 2, tijd 130 sec). Bovendien, op tijdstip 130 sec blijkt dat het monohydraat kristal niet geheel is verspreid over het oppervlak van het tablet. Het lijkt alsof de aanwezigheid van de ethylcellulose regio fysiek geblokkeerd heeft de verlenging van het monohydraat naalden. Na 250 seconden, kan men zien dat het monohydraat dekking van het oppervlak is niet zo prominent dat suggereert dat de monohydraat kristallen zich beginnen te ontbinden.

Figuur 2. Frames van CARS ontbinding video. Geselecteerde CARS beelden (2960 ^cm-1) uit een ontbinding video voor een theofylline anhydraat met ethyl cellulose tablet. Het beeld 0 sec wordt opgenomen in een gebied van het monster, terwijl de 60, 130, en 250 sec beelden worden opgenomen op een ander gebied van het monster. De CARS video is beschikbaar als aanvullende informatie. Schaal bar is 50 micrometer.

Ultraviolet (UV) spectroscopie is een vorm van absorptie spectroscopie met UV licht als de excitatiebron. UV-spectroscopie maatregelen elektron overgangen van de grondtoestand naar een aangeslagen toestand ^15. Theofylline heeft een brede piek rond 270 nm terwijl ethylcellulose is vrijwel onoplosbaar in het oplosmedium wordt dus naar verwachting niet bijdragen aan het UV-spectrum opgenomen. Analyse van de dissolutie medium met de inline z-vormige UV-stroomcel kunnen we kwantitatief de hoeveelheid geneesmiddel opgelost tijdens oplossen. Figuur 3 toont de UV-oplossingsprofiel voor het oplossen van theofylline anhydraat met ethylcellulose tablet. De UV dissolutieprofiel (Figuur 3) laat zien dat de ontbinding van theofylline anhydraat begint het snel bereiken van een maximale concentratie van ongeveer 90 pg / ml binnen 120 seconden; na dit tijdstip de ontbinding tarief begint te dalen. De afname van de oplossnelheid kan door de aanwezigheid van de theofylline monohydraat (oplosbaarheid 6 mg / ml bij 25 ° C ¹⁶⁾ kristallen op het oppervlak minder oplosbaar dan theofylline anhydraat (oplosbaarheid 12 mg / ml bij 25 ° C ¹⁶ zijn ) en duidelijk te zien in het CARS ontbinding video (figuur 2) op dit tijdstip. De geleidelijke verlaging dissolutiesnelheid kan ook gedeeltelijk worden verklaard bya vermindering theofylline blootstelling aan het stromende medium. Deze reductie treedt op omdat ethylcellulose is vrijwel onoplosbaar in water, zodat de theofylline lost de resterende ethylcellulose belemmert theofylline blootstelling aan het oplosmedium.

Figuur 3. UV dissolutieprofiel. Concentratie vs tijd plot voor een theofylline anhydraat gecombineerd met ethyl cellulose tablet toont de concentratie van theofylline in het oplosmedium tijdens de ontbinding experiment.

Discussie

Bij het uitvoeren van CARS microscopische oplossingsexperimenten zijn er enkele kritieke aspecten die tijdens het experiment moeten worden gemonitord. Ten eerste veroorzaakt het introduceren van het oplosmedium in de CARS flowcel dat de focus verplaatst. Dit betekent dat het beeld onmiddellijk verloren gaat en het enkele micrometer objectiefverstelling vergt om het oppervlak weer te vinden. Ten tweede bestaat er een risico op vloeistoflekkage uit de CARS flowcel als het glazen deksel tijdens het experiment breekt. Dit kan potentieel schade aan de optica veroorzaken, dus het is belangrijk om te luisteren naar elk krakend geluid dat zou kunnen betekenen dat het glas is gebroken. Ten slotte is er ook een kleine kans dat de leidingen geblokkeerd raken door deeltjes in het systeem tijdens het experiment, dit kan worden gezien als een plotselinge ongewone verandering in de UV-spectra en ook door periodiek de stroom tijdens het experiment te controleren.

Deeltjesblokkering van de leidingen is vooral een probleem bij tabletten die zijn ontworpen om tijdens het oplossen uiteen te vallen. Dit is een van de beperkingen van deze techniek, aangezien dit systeem vereist dat het oppervlak van de tablet intact blijft gedurende het gehele oplossingsproces om beeldvorming mogelijk te maken. Naast uiteenvallende tabletten, is het momenteel niet mogelijk om tabletten te beeld die zijn ontworpen om tijdens het oplossen te zwellen, aangezien dit kan leiden tot breuk van de CARS flowcel.

Het beeldvormen van tabletten tijdens het oplossen biedt een beter begrip van wat er op het oppervlak van een oplossende tablet gebeurt. Conventionele farmaceutische oplosmethoden richten zich alleen op het geneesmiddelgehalte dat in het oplosmedium is opgelost, wat kan aantonen of de tablet voldoet aan de vereiste norm. In het geval van een mislukte test is het echter moeilijk om te bepalen wat de oorzaak van het falen is. Het geval van een mislukte oplostest is mogelijk waar in situ oplosanalyse met behulp van CARS-microscopie antwoorden kan geven.

Toekomstige toepassingen voor in situ oplosanalyse met behulp van CARS-microscopie kunnen onderzoek omvatten met meer complexe tabletten die meer dan één geneesmiddel of vulstof bevatten, in het bijzonder niet-zwellende langdurige of gecontroleerde afgifte formulering tijdens formuleringsontwikkeling. Bovendien zou het mogelijk zijn om monsters te onderzoeken met biorelevante oplosmedia die voorwaarden creëren die nauwer gerelateerd zijn aan in vivo.

Kortom, dit werk toont aan dat CARS-microscopie in staat is tot snelle chemisch specifieke beeldvorming op basis van Raman-vibratiefrequenties, waardoor selectieve beeldvorming van het geneesmiddel in een tablet mogelijk is die zowel het geneesmiddel als het vulmiddel bevat. Bovendien is CARS-microscopie in combinatie met inline UV-absorptiespectroscopie een krachtig hulpmiddel dat in staat is om het oppervlak van tabletten tijdens het oplossen te monitoren en oppervlakteveranderingen die met CARS worden gezien, te correleren met veranderingen in de oplosnelheid.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Paladin 1,064 nm laser	Coherent		Prototype model not for sale
Levante Emerald Optical parametric oscillator	APE Berlin
IX71 Microscope	Olympus
Fluoview 300 scanning unit	Olympus
Photomultiplier tube R3896	Hamamatsu
Free standing optics / filters	Thorlabs and Chroma
Reglo peristaltic pump	ISMATEC
USB2000+ spectrometer	Ocean Optics
DT-MINI-2-GS light source	Ocean Optics
FIA-Z-SMA-TEF Z shaped flow cell	Ocean Optics
QP400-2-SR-BX optical fiber	Ocean Optics
Plastic piping	ISMATEC
CARS dissolution tablet flow cell			Zelf gebouwd aan de universiteit - ontworpen om tablets met een diameter van 12 mm en een dikte van 3 mm te houden. De flowcell heeft een kanaaldiepte van ongeveer 0,5 mm.
Glass beakers	VWR	D108980
Theophylline anhydrate	BASF	30058079
Ethyl cellulose	Colorcon