De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

Samenvatting

Mutatie tarieven bij jonge Saccharomyces cerevisiae cellen gemeten door fluctuatie tests worden gebruikt om mutatie frequenties voorspellen voor moeder cellen van verschillende replicative leeftijden. Magnetische sortering en flow cytometrie worden vervolgens gebruikt om de feitelijke mutatie frequenties en leeftijd van moedercellen meten afwijkingen identificeren voorspelde mutatiefrequentie.

Samenvatting

Saccharomyces cerevisiae is een uitstekend modelsysteem geweest voor het onderzoek van de mechanismen en gevolgen van het genoom instabiliteit. Informatie verkregen uit deze gist model is voor veel organismen, inclusief de mens relevant, omdat DNA-herstel en DNA schade respons factoren goed zijn geconserveerd in diverse soorten. Echter, S. cerevisiae is nog niet gebruikt om volledig te pakken of de snelheid van de accumulatie van mutaties veranderingen met toenemende replicatie (mitotische) leeftijd als gevolg van technische beperkingen. Zo metingen gist replicatieve levensduur door micromanipulatie meestal zeer geringe populaties van cellen, die detectie van zeldzame mutaties verbieden. Genetische methoden verrijken moedercellen in populaties door het induceren dood van dochtercellen ontwikkeld, maar populatiegrootte nog beperkt door de frequentie waarmee willekeurige mutaties die de selectiesystemen gevaar komen. Het huidige protocol maakt gebruik van magnetische sorting oppervlak gelabelde gist moedercellen te stellen een populaties van veroudering moedercellen zeldzame mutaties kwantificeren door fenotypische selectie te verkrijgen. Mutatiesnelheden gemeten door fluctuatie proeven en mutatiefrequentie worden eerst ingevoerd voor jonge cellen en gebruikt om de mutatiefrequentie in moedercellen van verschillende leeftijden replicatieve voorspellen. Mutatie frequenties worden vervolgens voor gesorteerde moedercellen en de leeftijd van de moeder cellen wordt bepaald middels flowcytometrie door kleuring met fluorescent reagens dat bud littekens gevormd op het celoppervlak gedurende celdeling detecteert. Vergelijking van de voorspelde mutatiefrequentie basis van het aantal celdelingen de frequenties experimenteel waargenomen voor moedercellen van een bepaalde replicatieve leeftijd kan dan vaststellen of er leeftijdsgebonden veranderingen van de accumulatie van mutaties. Variaties van deze basisprotocol de middelen om de invloed van veranderingen in specifieke genfuncties onderzoeken ofspecifieke milieu-omstandigheden op mutatie accumulatie mechanismen pakken onderliggende genoom instabiliteit tijdens replicatieve veroudering.

Inleiding

Micro-organismen, zoals gist Saccharomyces cerevisiae, zijn uitstekende modellen voor het onderzoek mutatiesnelheden, maar deze modellen zijn niet volledig gebruikt om de accumulatie van mutaties te onderzoeken gedurende mitotische celveroudering. Mutatie accumulatie in het nucleaire genoom wordt verondersteld bij te dragen aan veroudering hierdoor geen progressief verlies van (of variatie in) genfuncties ^1. De mogelijkheid om een ​​microbieel systeem te gebruiken om de mechanismen en gevolgen van mutatie accumulatieonderzoek het ouder kan sterk versnellen de identificatie van genetische en omgevingsfactoren beïnvloeden deze taak vanwege gemakkelijke genetische systemen en het gemak kwantificeren zeldzame fenotypische veranderingen in microörganismen. DNA-herstel factoren en DNA schade respons eiwitten zijn goed geconserveerd in diverse soorten ^2, en van de fundamentele overeenkomsten in organismal ouder zijn geïdentificeerd voor organismen zo divers als S. cerevisiae eend zoogdieren ^3, waardoor het waarschijnlijk is dat de resultaten verkregen uit studies in gist zal de vergrijzing in veel organismen relevant zijn.

Studies van de vergrijzing in S. cerevisiae maken gebruik van twee verouderende modellen die chronologische veroudering of replicatieve veroudering van cellen te meten. Chronologische veroudering wordt gekenmerkt door progressief verlies van levensvatbaarheid gistcel populaties die in een niet-delende toestand (stationaire fase) door nutriënten uitputting ^3. De chronologische veroudering model is gebruikt om aan te tonen dat mutaties accumuleren met de leeftijd ^4, omdat grote celpopulaties gemakkelijk worden verkregen in dit model fenotypische selectie uitvoert mutantcellen. In dit geval verschijnt mutatie accumulatie beïnvloed worden door groei-signaalwegen en oxidatieve stress ^5, en elk van deze factoren is het inzicht veroudering in meercellige eukaryoten ³ relevant. De replicatieve veroudering model maakt gebruik van de asymmetrische divisiop tussen S. cerevisiae moeder en dochter cellen voor onderzoek naar veroudering die optreedt bij de opeenvolgende generaties cel ^3. Gist replicatief veroudering is vaak gemeten door micromanipulatie van kleine populaties van moeder en dochter cellen, of meer recent, door middel van video microscopie van kleine populaties van gistcellen in microfluïdische apparaten ^6,7. Beperkte omvang van de bevolking maken deze benaderingen slecht geschikt voor het onderzoeken van mutatie accumulatie tijdens mitotische ouder, tenzij het ​​hele genoom informatie wordt verzameld uit enkele cellen of zeer hoge frequentie van genetische veranderingen worden gemeten ^8. Hele genoom-analyse van individuele cellen levert substantiële datasets voor onderzoek naar mutatie accumulatie, maar fenotypische selectie systemen hebben het belangrijke voordeel van het verstrekken van een middel van het meten van mutatie tarieven om mechanismen te bestuderen onderliggende mutatie accumulatie. Studies naar mutatie frequenties en tarieven door middel van fenotypische selecties in haploi onderzoekend giststammen bij replicatieve veroudering nog niet gemeld.

Mutatie tarieven worden meestal gemeten met behulp van fluctuatie testen ^9. Mutation frequentiewaarden de totale aantal cellen die een mutatie in een gen sequentie in een populatie. Dit omvat cellen die onafhankelijk mutaties optreden en alle kalveren van die cellen die eenvoudig erven bestaand mutaties. Daarentegen mutatiesnelheden gemeten door fluctuatie proeven geven het aantal onafhankelijke mutaties die pas ontstaan ​​waarbij elke cel generatie. Deze tests omvatten typisch inoculeren vele duplokweken bij lage celdichtheden de waarschijnlijkheid van het toevoegen cellen met bestaande mutaties in een doelsequentie, groeit de culturen dichtbij verzadiging en identificeren mutante cellen door groei op selectief medium te verminderen. Het aantal mutante cellen die in de herhaalde populaties worden dan gebruikt in een van de mathematische modellen om het aantal i schattenONAFHANKELIJKE mutaties die ontstaan ​​tijdens de groei ^9. Vergelijking van het aantal onafhankelijke mutaties de gemiddelde populatiegrootte verschaft een maat van de mutaties. In S. cerevisiae, mutatie-frequenties en de tarieven worden vaak gemeten met de URA3- en CAN1 genen, omdat het verlies-van-functie mutaties in deze genen produceren selecteerbare fenotypes. Verlies van URA3 functie maakt, bestand tegen 5-fluororotinezuur (5-FOA), aangezien de proteïne gecodeerd door URA3 zet 5-FOA een toxische molecule ^10. Functieverlies van CAN1 maakt cellen resistent canavanine een toxische arginine analoog worden, aangezien de proteïne gecodeerd door CAN1 transports arginine en canavanine in cellen ^11.

Zowel genetische en fysische sortering strategieën zijn met succes toegepast om grotere populaties van S. vinden cerevisiae moeder cellen te onderzoeken van replicatieve veroudering te vergemakkelijken. Genetische strategieën omvatten slimme benaderingen die kiest tegen dochter overleving van cellen in een populatie. De moeder verrijking programma (MEP) omvat beta-estradiol inductie van Cre recombinase expressie alleen in dochtercellen, waardoor dochter-specifieke verstoring van twee essentiële genen die werden om loxP plaatsen ¹² bevatten. MEP stammen kunnen gewoonlijk worden gekweekt in de afwezigheid van de induceerder, maar alleen de moeder cellen blijven delen na inductie, terwijl dochtercellen zullen arresteren M-fase meestal tijdens de eerste progressie door de celcyclus ^12. Hoewel dit systeem niet gebruikt globaal onderzoek mutatie accumulatie tijdens veroudering, is het gebruikt om verlies van heterozygositeit, relatief frequente vorm van genoom instabiliteit in diploïde giststammen, en biochemische veranderingen bij verouderen moedercellen ^13,14 bestuderen. Ook de dochter-afleider systeem omvat dochter-specifieke expressie van de S. cereviSIAE URA3-gen ^15. Dochter-afleider stammen groeien normaal tot 5-FOA wordt toegevoegd aan het medium, waarna dochtercellen expressie URA3 sterven, terwijl moedercellen blijven groeien ^15. Dit zijn bruikbare systemen te verrijken voor moedercellen, maar afhankelijk handhaving van de genfuncties het selectiesysteem vormt. Willekeurige mutaties in een of meer bestanddelen van het selectiesysteem kan resulteren in dochtercellen die de selectie ontsnappen en vermenigvuldigen exponentieel. Tijdens de ontwikkeling van de MEP-stammen, de juiste omvang van de bevolking was vastbesloten om het uiterlijk van de mutant dochter cellen die de selectie ¹² kon ontsnappen te voorkomen. Echter, deze limiet in grootte van de populatie afbreuk doet aan de opsporing van zeldzame vormen van het genoom instabiliteit tijdens replicatieve veroudering. Deze beperking maat populatie kan gedeeltelijk worden overwonnen door diploïde giststammen met twee kopieën van elk gen dragen aan het selectiesysteem, omdat de meestemutaties zou waarschijnlijk recessief ^12. Echter, gebruik van diploïde stammen beperkt de typen mutatie gebeurtenissen die gemakkelijk gedetecteerd kunnen worden vergeleken met die die gemakkelijk gedetecteerd kunnen worden in haploïde gistcellen.

Fysieke sorteren strategieën omvatten isolatie van de moeder cellen met een gelabelde celoppervlak van ongelabelde dochter cellen te verrijken voor grote populaties van de moeder cellen. De waarneming dat celoppervlakeiwitten (celwandeiwitten) van S. cerevisiae dochter cellen zijn nieuw gesynthetiseerde tijdens ontluikende werd misbruikt om de moeder cellen te labelen zonder het labelen van de dochter cellen die ze produceren ^16. Bijvoorbeeld kan een eerste populatie van gistcellen op hun oppervlak gemerkt met biotine worden gekweekt en geïsoleerd van de dochtercellen behulp van anti-biotine microbolletjes en magnetische sortering ¹⁶ omdat de dochtercellen die door de initiële populatie niet biotine bevatten op hun oppervlak . Serial groei ensorteren laat geleidelijk oudere populaties van de moeder cellen worden verkregen en geanalyseerd. Deze procedure is met succes gebruikt om veranderingen in celfysiologie en genexpressie bij replicatieve veroudering gist ^13,14,17,18 onderzoeken. De huidige methode past dit biotine etikettering en magnetische sortering techniek te verrijken moedercellen met het meten van de accumulatie van potentieel zeldzame mutaties of andere instabiliteit van het genoom getest door fenotypische selectie. Serial groei en fysische sortering analysesystemen mutatie accumulatie in geleidelijk oudere moedercellen, alsmede in hun dochter celpopulaties. Bepaling van het aantal mutaties per generatie laat een voorspelde mutatie frequentie te worden berekend voor de moeder cellen die een bepaald aantal celdelingen hebben ondergaan. Aangezien voorspelde frequentiewaarden zijn gebaseerd op de verwachte toename door aanvullende ronden van celdeling aanzienlijke afwijkingen in de waargenomen Mutatiop frequenties in vergelijking met de voorspelde waarden leveren bewijs voor de leeftijd-specifieke veranderingen in de snelheid van de accumulatie van mutaties. Met behulp van dit protocol, kunnen fluorescerende kleuring van bud littekens die overeenkomen met plaatsen van celdelingen op moeder cellen in combinatie met analyse door flowcytometrie worden gebruikt om snel te bepalen van de leeftijdsverdeling van gesorteerde en ongesorteerde populaties. Aanvullende fluorescente reagentia, zoals die gebruikt voor het detecteren van reactieve zuurstof species, kunnen ook worden gebruikt in deze protocol. Over het algemeen is dit protocol maakt een efficiënte analyse van de leeftijd-afhankelijke veranderingen in het genoom instabiliteit met het potentieel voor correlatie met leeftijd-gerelateerde cel fysiologische veranderingen in een modelorganisme goed geschikt is voor het bestuderen van de genetische en omgevingsfactoren die de vergrijzing samenhangende genoom instabiliteit beïnvloeden.

Protocol

1 Voorbereiding van de media en oplossingen

1. Kweek cellen middels gistextract-pepton-glucose (YPD) rijk medium voor het standaardprotocol. Bereid een 2% bacto-pepton, 1% gistextract, 2% glucose oplossing YPD medium en voeg 2% bacto-agar voor vast medium ^19. Autoclaaf te steriliseren. Gebruik een ander medium, indien nodig, om een ​​bepaalde groeicondities of mutante giststam testen.
2. Maak stevige synthetische compleet medium zonder arginine met 60 mg / L canavanine (SC-arg + canavanine) om te kiezen voor canavanine resistente mutanten. Bereid een oplossing die 0,67% bacto-giststikstofbase zonder aminozuren, 2% glucose, 0,2% van het mengsel zonder supplement arginine (dropout mix) en 2% bacto-agar ^19. Autoclaaf en koel voorafgaand aan het toevoegen canavanine van een 20 mg / ml voorraadoplossing (filter-gesteriliseerd, bewaard bij 4 ° C) ^19.
   1. Voeg vast synthetisch compleet medium bevattende 5-fluororotinezuur (5-FOA). Bereid 500ml van een oplossing die 1,34% bacto-giststikstofbase zonder aminozuren, 4% glucose, 0,4% complete aanvulling mengsel en 0,2% 5-FOA en filter-gesteriliseerd ^19. Autoclaaf 500 ml van een 4% bacto-agar oplossing koel kort en meng met de 500 ml-filter gesteriliseerde voedingsoplossing. Gebruik geschikte alternatieve media voor andere mutatie assays.
3. Voor biotine labeling, maak 500 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing die 137 mM natriumchloride, 2,7 mM kaliumchloride, 10,14 mM natriumfosfaat dibasisch en 1,77 mM kaliumfosfaat dibasisch, pH 8 Bewaar bij 4 ° C en blijf ijs tijdens gebruik.
4. Maak een frisse 5 mM biotine voorraad in steriele, ultrapuur water.
5. Om biotine labeling lessen, maak 500 ml 1x PBS, 100 mM glycine. Bewaren bij 4 ° C en blijf op ijs tijdens het gebruik.
6. Afhankelijk van het aantal gebruikte cellen en duur van het experiment, maken 1-2 L van de kraal-labeling buffer met 1x PBS, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine serumalbumine. Filter steriliseren en de gas-buffer. Bewaren bij 4 ° C en blijf op ijs tijdens het gebruik.
7. Bereid een 0,4% trypan blauwe oplossing in 1x PBS, filter steriliseren en opslag bij kamertemperatuur bestemd voor cellevensvatbaarheid metingen.
8. Aliquot kleine volumes (-100 pl) van een tarwekiem agglutinine (WGA) fluorescente conjugaat te bewaren bij -20 ° C in folie verpakt (of ondoorzichtige) microcentrifuge buizen bestemd voor het bepalen cel leeftijd.

2 Bepaling van de mutatie snelheid en frequentie

1. Opzetten van een basislijn mutatie snelheid per cel generatie met fluctuatie tests voor cellen onder standaard kweekomstandigheden gegroeid. Groei 7-11 repliceren 1 ml kweken van een eerste dichtheid van 1,000-5,000 cellen / ml vroege stationaire fase (~ 10 ⁸ cellen / ml).
   1. Voor elke repliceren cultuur, verdunnen cellen 1: 2.000 en verspreiden 1-4 ul op niet-selectief medium (YPD) om kolonievormende eenheden / ml te bepalen. Pellet resterende cellen op ~ 2.400 xg gedurende 1 minuut in een microcentrifuge en resuspendeer in 100 pl water uitgespreid op selectief medium mutanten te identificeren. Incubeer de platen gedurende drie dagen bij 30 ° C vóór het tellen kolonies (pas incubatietijd indien nodig gebaseerd op de groeisnelheid van cellen).
   2. Bepaal het aantal onafhankelijke mutaties (m) die zich in het proces op basis van het aantal mutante kolonies (r) opgehaald op selectief medium. Gebruik de Lea-Coulson mediaan schatter om m te vinden door het vervangen van het mediane aantal mutante kolonies voor r in de formule onder de ^9. Substitueer tenslotte waarden voor m totdat de linkerzijde van de vergelijking is nagenoeg nul.
      
   3. Mutatie tarief te bepalen, eerst bereken het gemiddelde aantal levensvatbare cellen uitgespreid op selectief medium door het gemiddelde kolonie-vormende eenheden / ml van het duplokweken en het volumevan cultuur in ml spread op selectief medium. Verdeel de m waarde van stap 2.1.2 van dit gemiddelde aantal levensvatbare cellen om de mutatie snelheid per cel generatie te verkrijgen.
2. Individueel te berekenen het aantal levensvatbare cellen verspreid op selectief medium voor elke repliceren cultuur in een proces zoals beschreven in stap 2.1.3. Verdeel het aantal mutante kolonies (r) voor een kweek verkregen door het aantal levensvatbare cellen uitgespreid op selectief medium om de mutatiefrequentie te verkrijgen. Gebruik de gemiddelde of de mediaan van de individuele mutatie frequenties van het repliceren culturen in stap 2.1 als een baseline mutatie frequentie.
3. Voeg frequentiemetingen voor en na biotine labeling cellen (stappen 3.2 en 3.4) te bepalen of de etikettering stap resulteert in een wijziging van de frequentie van mutaties die moeten worden overwogen bij het testen voor leeftijdsgebonden veranderingen in mutatie accumulatie.

3 Biotin Labeling

1. Streak S. cerevisiae uit een glycerol voorraad bij -80 ° C op YPD medium en incubeer bij 30 ° C gedurende 1-3 dagen.
2. Met behulp van een steriele pipet overdracht cellen van de reeks van plaat 1 ml (of meer) water in gedachten houden dat 1-1,5 cm van een dik gegroeid deel van de strook zal ongeveer 10 ⁸ cellen bevatten. Exact celdichtheid met behulp van een hemocytometer.
3. Label 10 ⁸ cellen per stam (of behandeling conditie) per collectie punt waarop mutatie frequentie zal worden bepaald of een populatiegrootte voldoende is om ten minste 5-10 mutante kolonies per steekproef te verkrijgen op selectief medium (op basis van mutatie frequentie van stap 2.2). Voorzien van een extra 10 ⁸ cellen voor nulmetingen per stam / conditie.
4. Biotine label volgens de standaardprocedure van de fabrikant, behalve gebruik maken van een 5 mM biotine reagens voorraad en schud tijdens de incubatie. Spin voor 5 min bij 4 ° C bij 3000 xg voor centrifugatiestappen, sinds spinning bij temperaturen hoger dan 4 ° C kan leiden tot verhoogde cel verlies. Na de laatste wasbeurt, schorsen cellen tot een concentratie van 10 ⁸ gelabelde cellen / ml in water.
5. Controleer levensvatbaarheid van cellen met trypan blauw kleuring. Verdun 10 pi cellen met 23 ul water en 67 pl van 0,4% trypan blauw in 1x PBS. Incubeer gedurende ten minste 40 min bij kamertemperatuur voor het maken van levende (ongekleurd) en dood (gekleurd) cellen met een hemocytometer.
6. Meet de uitgangswaarden voor genoom instabiliteit, cel leeftijd en andere relevante kenmerken (zie paragrafen 5, 6 en 7).
7. Transfer-biotine gemerkte cellen 20 ml YPD-medium per 10 ⁸ cellen in een Erlenmeyer kolf (ongeveer 5 x 10 ⁶ cellen / ml). Groei cultuur (s) 16-18 uur bij 20 ° C een dichtheid van ongeveer 10 ⁸ cellen / ml (4:56 celgeneraties), maar laat cellen stationaire fase bereiken. Gebruik een kortere incubatietijd voor groei bij 30 ° C. Houd biotine-gelabelde cells bij 4 ° C gedurende enkele uren voordat zij aan medium, indien nodig om de timing van de groeiperiode en verzamelen optimaliseren.

4 Bead Labeling en magnetische sorteren

1. Na de groeifase, Verdun een hoeveelheid van cultuur aan de cel dichtheid te bepalen met behulp van een hemocytometer. Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 4 ° C bij 3.000 x g. Giet supernatant.
2. Was de cellen door te vortexen om pellet op te schorten in 30 ml van de kraal-etikettering buffer, dan centrifugeren en afgieten van supernatant zoals in paragraaf 4.1. Herhaal wassen.
3. Volledig opnieuw in suspensie cellen in 50 ul kraal-etikettering buffer per 10 ⁸ totaal cellen door vortexen. Voeg 2 pi magnetische kralen per 10 ⁸ totale cellen en vortex kort te mengen. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten, het omkeren van periodiek te mengen (bewerkt uit een online-protocol op http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
4. Was de cellen drie maal met 30 ml bead-labeling buffer.
5. Voeg 0,5 ml kraal-etikettering buffer per 10 ⁸ totale cellen en kort vortex pellet op medium instellingen enkel tot cellen worden geresuspendeerd. Giet door een 40 micrometer cel zeef in een 50 ml buis om alle resterende celklonten verwijderen. Indien nodig, laat de cellen op ijs gedurende 1-2 uur vóór het laden van de kolom.
6. Volg de fabrikant aanbevolen protocol voor de magnetische kolom binden, wassen en elueren de magnetische-kraal gemerkte moedercellen. Voor versneld herstel van de gelabelde cellen, gebruik ten minste een kolom per 2 x 10 ⁹ totaal cellen.
   1. Verwijder eventuele luchtbellen die zich voordoen bij het laden van de kolommen, als ze stroom zullen blokkeren. Verwijder en vervang de kolom aan de scheiding tussen wasbeurten om cellen te voorkomen dat ze gevangen zitten tussen de kralen (gewijzigd bij een online protocol bij http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
   2. Tenzij stromen door binden en wasstappen jonge cellen die door de moedercellen analyseren, indien gewenst. Concentraat cellen zoals beschreven in stap 4.7.
   3. Gebruik meerdere kolommen separatoren voor het verwerken van meerdere monsters tegelijk. Elute meerdere kolommen van hetzelfde monster in dezelfde collectie buis te verminderen verwerkingstijd en het verlies van cellen te verminderen.
7. Concentreer geëlueerd moedercellen door centrifugeren bij 3000 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Zuig alle maar 1 ml buffer per 10 ⁸ originele biotine-gelabelde cellen. Vortex kort aan cellen in de resterende buffer op te schorten.
8. Verdun een aliquot van cellen en kleuren met trypan blauw aan de celdichtheid en cellevensvatbaarheid met een hemocytometer bepaald (zie stap 3.5). Bereken het totale aantal cellen teruggewonnen.
   1. Als het aantal cellen aanzienlijk hoger dan verwacht, passen de elutie monster door een kolom te proberen te verwijderen contaminerende jonge cellen.Als het aantal cellen is aanzienlijk lager dan verwacht, passen de opgeslagen stroom door monster door een kolom te proberen opbrengst van moedercellen verbeteren.
9. Gebruik cellen voor verdere analyse, zoals beschreven in de hoofdstukken 5 en 6 alternatief groeien de cellen in YPD bouillon weer aan hun replicative leeftijd (stap 3.7) te verhogen en te volgen door kraal etikettering en sorteren (stappen 4.1-4.8.1), zonder dat de moet de biotine herhalen etikettering.

5 Bepaling van Replicatieve Age

1. Spin cellen gedurende 2 minuten bij 5000 xg bij RT voor alle stappen in dit gedeelte. Breng 25 pl van teruggewonnen cellen (~ 10 ⁸ cellen / ml) in een 1,5 ml centrifugebuis en tweemaal spoelen met 1x PBS 1 ml. Aspireren uit supernatant.
   1. Ontdooi een portie van WGA-conjugaat, vortex te mengen, en spin kort eiwit aggregaten te elimineren. Suspendeer de cellen in 180 ul 1 x PBS en 20 ui WGA geconjugeerd aan een fluorescent molecuul bud littekens label op het oppervlak van de cellen. Bedek 1,5 ml centrifugebuis met folie en incubeer met zachte schommelen bij 30 ° C gedurende 30 minuten.
   2. Was drie keer met 1 ml 1X PBS.
2. Voor fluorescentie microscopie, label glijbanen en monteren per standaard protocol met behulp van een anti-fade-agent. Volledig genezen van dia's in het donker (tot een paar dagen) voor het afdichten dekglaasje naar cel beweging tijdens de beeldvorming te voorkomen. Telling knop littekens op ten minste 50 cellen per monster een representatieve maatstaf cel leeftijd verkrijgen. WINKEL dia tot 1 maand voor weergave Knop littekens, indien nodig.
   1. Anderzijds bepaalt de intensiteit van het fluorescerende signaal van de WGA-conjugaat door het uitvoeren van flowcytometrie op cellen gesuspendeerd in 1 ml 1x PBS na stap 5.1.2. Gebruik een 405 nm excitatie laser en 530/30 nm emissie-filter met een 505 nm lange pass filter voor de WGA-Alexa 488 Inclusief een onbesmet controle voor elk inzamelpunt.
3. Grafiek bud littekens op jonge cellen en verouderde cellen geteld door microscopie op dey-as tegen de genormaliseerde geometrisch gemiddelde (gekleurd geometrisch gemiddelde / ongekleurde geometrisch gemiddelde) van de WGA-conjugaat fluorescentie van dezelfde celpopulaties op de x-as. Het verkrijgen van de vergelijking van een lineaire trendlijn voor deze relatie. Voor verdere experimenten wordt vervangen genormaliseerde meetkundig gemiddelde van WGA-conjugaat fluorescentie-intensiteit van een celpopulatie voor x in de vergelijking en lossen voor y de gemiddelde cel leeftijd van een monster.

6 mutatiefrequentie

1. Spread gesorteerd moedercellen geresuspendeerd in buffer van stap 4.7 op YPD medium en selectief medium volgens stap 2.1.1. Gebruik 1 ml geresuspendeerd moedercellen voor selectief medium en rotatie cellen bij 5000 xg gedurende 1 minuut.
   OPMERKING: Bedek grotere hoeveelheden verdunde cellen op YPD medium zoals cellen toenemen leeftijd compenseren steeds niet-levensvatbare en verouderde cellen in oudere populaties.
   1. Incubeer YPD medium en selectief medium platen uitstap 6.1 bij 30 ° C gedurende 3 en 4 dagen, respectievelijk. Verhoog de incubatietijd tot een week voor de zeer oude cellen of langzaam groeiend ras. Bereken mutatiefrequentie zoals beschreven in stap 2.2.

7 Berekening Voorspelde mutatiefrequentie voor een bepaald Replicatieve Age

1. Bereken de gemiddelde toename replicatieve ouderdom van de biotine-gelabelde cellen in de loop van het experiment door de gemiddelde leeftijd van de initiële celpopulatie van de gemiddelde leeftijd van de gesorteerd moedercellen voor de betreffende soort. Gebruik de cel leeftijden berekend in stap 5.2 of stap 5.2.2.
2. Vermenigvuldig de mutatie snelheid in stap 2.1.3 verkregen door de gemiddelde cel leeftijd berekend in stap 7.1. Voeg deze waarde aan de basislijn mutatiefrequentie voor de initiële populatie berekend in stap 2.2 de voorspelde mutatiefrequentie voor cellen van de desbetreffende replicatieve leeftijd te bepalen.

Resultaten

Een stroomdiagram in figuur 1 toont de algemene stappen van de procedure, waaronder de punten waar mutatiesnelheden, frequenties en cellen leeftijd gemeten. Nauwkeurig bepalen van de frequentie en de snelheid van mutaties (of andere vorm van genoom instabiliteit) bij jonge celpopulaties is een belangrijke eerste stap, aangezien het noodzakelijk voor het kiezen van een geschikte populatiegrootte etikettering en magnetische sortering is. Rate waarden kan worden vastgesteld met behulp van fluctuatie testen ^9. Voorbeeld resultaten voor giststammen in de BY4741 genetische achtergrond ²⁰ geselecteerd voor mutaties in het gen dat CAN1 canavanine resistentie of mutaties in de URA3 gen dat resistentie tegen 5-FOA verlenen verlenen zijn getoond in figuur 2. Cellen werden gekweekt bij 20 ° C voor representatieve rate experimenten, en bij 20 ° C en 30 ° C voor representatieve frequentie experimenten. Deze temperaturen werden gebruikt omdat initiële celpopulatie gekweektbij 30 ° C werden vervolgens gekweekt bij 20 ° C voor de volgende sortering representatieve experimenten. Rate waarden uit onafhankelijke studies waren vergelijkbaar voor de eerste cel populatie en cellen na biotine labeling voor een stam die de CAN1 gen heeft op zijn normale plaats op chromosoom V, ongeveer 32 kilobasenparen van de linkerarm van telomeren ( www.yeastgenome.com ) ( Figuur 2A, lavendel kolommen). De mutatie snelheid van CAN1 was aanzienlijk hoger in de eerste populatie van een tweede giststam die een deletie van de CAN1-gen van zijn normale plaats op chromosoom V en een insertie van CAN1 op de rechter arm van chromosoom VIII ongeveer 25 kilobasenparen van de telomeren heeft ²¹ (figuur 2B). CAN1- genmutatie frequenties waren ook vergelijkbaar voor de initiële celpopulaties en biotine gelabelde cellen aan beide groei temperatuur (Figuur 2A, blauwe kolommen). Echter, mutatie frequenties verkregen bij 20 ° C bleken hoger dan mutatiefrequentie bij 30 graden. Om te testen of deze temperatuur effect was beperkt tot de CAN1-gen, hebben we gemeten mutaties in URA3- door te selecteren voor resistentie tegen 5-FOA met behulp van de giststam die CAN1- geplaatst op chromosoom VIII heeft. Deze stam heeft een deletie van URA3 van zijn normale plaats op chromosoom V en een insertie van URA3 op de rechter arm van chromosoom VIII ongeveer 40 kilobaseparen van de telomeer ^21. Mutatie frequenties waren ook hoger bij 20 ° C gedurende URA3 in deze chromosomale locatie (figuur 2C). Kortom, dit toont aan dat groeitemperatuur de mutatiefrequentie kan beïnvloeden, maar biotine kenmerken lijkt geen mutatiefrequentie beïnvloeden. Daarom mutatie tarieven en frequenties voor de initiële populatie moeten worden bepaald op dezelfde groei temperatuur die wordt gebruikt voor ronden van groei en sortering. Het is raadzaam dat biotine etikettering verifiëren ofwel geen invloed genoom instabiliteit vóór gebruik van het protocol om andere typen mutaties of genoomherschikkingen onderzoeken.

Zoals verwacht, de mutatie snelheid waarden getoond in figuur 2A is enkele malen hoger dan de overeenkomstige frequentiemetingen. Dit verschil treedt op omdat mutatiepercentage meet het verschijnen van cellen met nieuwe mutaties bij elke ronde van celdeling, terwijl mutatiefrequentie meet het cumulatieve aantal mutante cellen in de populatie aan het einde van de groeiperiode. De tarieven en 95% betrouwbaarheidsintervallen voor deze onderzoeken tonen aan dat reproduceerbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van zeven duplokweken per proef, die is het minimum aantal herhalingen stelde voor dit protocol.

Zodra de eerste frequentie en de snelheid worden bepaald, moet een bevolkingsgrootte ch zijnosen die ervoor zorgt dat er voldoende cellen aanwezig na meerdere rondes van het sorteren om op betrouwbare wijze vast te stellen mutatie frequenties zijn. Labelen van een populatie van 10 ⁸ cellen per tijdstip dat tijdens veroudering te analyseren is dienstig bij frequenties en tarieven zijn vergelijkbaar met die getoond in figuur 2A. Deze beslissing hangt ook af van hoe efficiënt gelabeld moeder cellen worden hersteld na elke ronde van het sorteren. De efficiëntie van het terugwinnen gelabelde moedercellen kunnen snel en eenvoudig worden beoordeeld met behulp van een hemocytometer om het aantal cellen geëlueerd uit de kolom voor elke soort vast en celmorfologie onderzoeken. Twee hoofdbestanddelen worden geïllustreerd door het voorbeeld data recovery efficiency (figuur 3A) de teruggewonnen aantallen cellen hoger dan verwacht na het sorteren verschijnen, en een kleine progressief verlies van cellen wordt verwacht met aanhoudende sorteren. Hoe hoger dan verwachte aantal cellen in enkele experimenten na de eerste soort kunnen result uit de etikettering van de knoppen op de cellen in de oorspronkelijke bevolking. Een gistcel met een knop zou typisch worden gemaakt als een enkele cel de bepaling van het aantal cellen te labelen met biotine. Etikettering van knoppen die aanwezig zijn in de initiële populatie, hoewel, zou de cellen die zich ontwikkelen van die knoppen om ook op kolommen behouden tijdens het sorteren. De invloed van dit fenomeen op de bepaling van de herstelcapaciteit afhankelijk van de fractie van budded cellen in de initiële celpopulatie. Een tweede mogelijke reden voor het grotere aantal cellen na sort is dat neigt er meer grote budded cellen op dit tijdstip aan te voltooien celdeling tijdens het sorteren worden. Hierdoor kunnen grote toppen nog aan hun moedercellen worden gesorteerd maar lijken dan als afzonderlijke cellen wanneer de geëlueerde cellen onderzocht. Hoewel enig verlies van cellen wordt waargenomen met elke ronde van groei en sortering Het protocol kan resulteren in een goede bevestiging van 80-90% van de cellen na elke ronde van sorting. Het is de moeite om de procedure te oefenen zodat 80% van de gemerkte cellen worden geïsoleerd om de noodzaak een onnodig grote initiële celpopulatie etiketteren voorkomen waard. Behandeling van de cellen met een milde spanning na de eerste soort (1 mM waterstofperoxide in YPD medium voor 30 min) kon niet verhinderen dat efficiënt herstel van cellen met een aanhoudende rondes van de groei en het sorteren, al was er enige variatie in het herstel van de eerste soort na de stress (Figuur 3A).

Inspectie van celmorfologie en levensvatbare ook bruikbaar zowel voor het bevestigen succesvolle isolatie van moedercellen en voor de aanpassing verdunningen / volumes gebruikt als verspreiding cellen op niet-selectief medium om de dichtheid kolonievormende eenheden te bepalen. Moedercellen steeds groter en onregelmatig gevormd als zij ouder tegenover dochtercellen (Figuur 3B). De moeder cel monsters moet daarom in de eerste plaats bestaan ​​uit grote, irregularly vormige cellen als het experiment vordert in elke ronde van sortering. De aanwezigheid van vele kleine ovale cellen van regelmatige vorm kan erop wijzen dat moedercellen niet adequaat gescheiden dochtercellen. Levensvatbaarheid van de moeder cellen dient tevens geleidelijk afnemen met elke ronde van de teelt en het sorteren, hoewel er veel verandering niet kan zijn tijdens de eerste 5-10 cel generaties. Het aantal cellen dat kolonievormende kan verminderen veel sterker is dan het aantal cellen die bepaald levensvatbaar te zijn door een vorm van directe kleuring voor celintegriteit, door de vorming van verouderde cellen. Wanneer levensvatbaar directe kleuring werkwijze begint eerst dalen (circa 80% of minder), kan het nodig zijn om verdunningen en volumes voor het meten kolonievormende eenheid dichtheden in afwachting van een dramatische afname in het vermogen van levensvatbare cellen te passen kolonies vormen (een twee tot enkele voudige afname).

Hetreplicative leeftijden van de gesorteerde populatie en controle populatie moet worden vastgesteld vóór mutatie frequentie gegevens van de moeder cellen kunnen worden geanalyseerd voor de leeftijd-specifieke veranderingen in de snelheid van de accumulatie van mutaties. Dit kan worden bereikt door handmatige telling van bud littekens op moedercellen (figuur 4) of via flowcytometrie het signaal van de kiem litteken detectiereagens (figuur 5) kwantificeren. Bud littekens kunnen met relatief lage achtergrondsignaal met WGA-fluorescerende conjugaten (figuur 4C) worden gemerkt. Figuur 4A toont dat de meeste cellen van de stroom door monsters van de sorteerinrichting procedure nul of een knop litteken. De cellen geëlueerd uit kolommen meestal moedercellen leeftijd (Figuren 4B en 5). Typisch,> 90% geëlueerde cellen moedercellen, die gemakkelijker kan worden gezien van de flowcytometrie resultaat in figuur 5. Cellen met relatief weinig bud littekens (<6) OBTained na meer dan twee ronden van het sorteren contaminerende cellen die geen biotine gemerkt dat een paar ronden van celdeling ondergaan tijdens de desbetreffende ronde van groei, in tegenstelling tot moedercellen die langzaam delende kunnen vertegenwoordigen. De variatie in cel leeftijd toenemen latere ronden van het sorteren zo niet alle cellen in de populatie uniform groeien.

Een grotere celpopulatie kan sneller worden gebruikt om cellen leeftijd beoordelen of een lineaire relatie bestaat tussen WGA-fluorescentiesignaal intensiteiten en het aantal kiem littekens per cel. Voor deze analyse wordt normalisatie van alle WGA-fluorescentiesignaal intensiteiten bewerkstelligd door het signaal van gekleurde cellen te delen door het signaal verkregen voor de juiste ongekleurde celpopulatie (dochter of moeder) te vertegenwoordigen verhoogde achtergrondfluorescentie in de oudere cellen. Figuren 4 en 5 toont analyse van dezelfde gevolmachtigde celpopulaties.Handmatige telling opgericht gemiddelde replicatief leeftijd van 0,95 en 11,4 voor de dochter cel (Figuur 4A) en moeder celpopulaties (Figuur 4B), respectievelijk. Genormaliseerde WGA-signalen voor beide populaties en de drie aanvullende populaties (gemiddelde leeftijd van 3,0, 6,9 en 14,4) werden uitgezet tegen de gemiddelde aantal bud littekens voor elke populatie (Figuur 5B). Deze lineaire relatie kan dan worden gebruikt met dezelfde stam en reagentia in toekomstige experimenten gemiddelde cel leeftijd van de genormaliseerde WGA-signaal verkregen door flowcytometrie, waardoor een snelle en nauwkeurige bepaling van cel leeftijd te bepalen. Controle populaties moeten nog worden opgenomen om soortgelijke vlekken efficiëntie tussen de trials te verifiëren.

De invloed van de veroudering op de accumulatie van mutaties wanneer de voorafgaande stappen van het verkrijgen van mutaties waarden efficiënt sorteren cellen en bepaling cel leeftijden bewerkstelligd worden. De nuember van tijdstippen waarop de frequentie kan worden bepaald afhankelijk van de grootte van de biotine-gelabelde celpopulatie en het aantal cellen die moeten worden verspreid op selectief medium om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Als mutatie snelheid verandert met de leeftijd, dan is de waargenomen mutatie frequenties voor bejaarde moeder cellen moeten verschillen van de verwachtingen alleen gebaseerd op extra rondes van celdeling. Vergelijking van de waargenomen mutatiefrequentie de voorspelde mutatiefrequentie kan leeftijdsgebonden veranderingen in het aantal accumuleren mutaties identificeren. Zoals beschreven in hoofdstuk 7 van het protocol, kan de voorspelde frequentie verkregen worden uit het product van de basislijn mutatie tarief voor de eerste cel bevolking en de toename van replicative leeftijd van de moeder cellen toegevoegd aan de mutatie frequentie voor de initiële populatie. Verhogingen van CAN1 mutatie frequentie waargenomen met een verhoogde gemiddelde cel leeftijd in een stam met CAN1 op zijn normale plaats op chromosoom V(Figuur 6A) en een stam met CAN1 rechts arm van chromosoom VIII (figuur 6B). Aangezien de waargenomen mutatie frequenties voor moeder cellen in figuur 6A zijn vergelijkbaar met of net onder de voorspelde frequenties, hoeft de data niet enkel bewijs voor een leeftijd-specifieke veranderingen in mutaties. Daarentegen mutatie frequenties moedercellen van de stam met CAN1 op chromosoom VIII hoger dan de voorspelde frequenties (figuur 6B). Merk op dat de voorspelde frequenties in de grafiek lijken niet erg veel omdat een logaritmische schaal moest worden gebruikt voor de Y-as toenemen vanwege de grote toename waargenomen mutatiefrequentie. Daarom zijn de resultaten in figuur 6B geven wel bewijs ter ondersteuning van een leeftijd-specifieke verhoging van het tarief van accumuleren mutaties. Het verschil in de resultaten van de gegevens in figuur 6A en 6B is waarschijnlijk te wijten aan de diffe huren genomische locaties van CAN1. Deze types van observaties bieden een uitgangspunt voor het ontwikkelen van hypothesen mechanismen die mutatie tarieven als cellen leeftijd van invloed te bestuderen en modellen om mutatie accumulatie met replicative leeftijd uitleggen ontwikkelen.

Figuur 1 Stroomdiagram van de algemene procedure voor de behandeling van mutatie accumulatie tijdens gist replicative veroudering. Zwarte tekst en pijlen geven de belangrijkste stappen in de procedure. De gebogen pijl geeft dat aanvullende ronden van hergroei en sortering van dezelfde cellen worden gebruikt geleidelijk oudere cellen te verkrijgen. Paarse pijlen en tekst geven de stadia waarin de vermelde metingen worden uitgevoerd. Freq - frequentie.

uploaden / 51850 / 51850fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figuur 2 Bepaling van de mutatie frequentie en snelheid bij jonge celpopulaties. (A) Mutant kolonies werden geselecteerd door het verspreiden cellen op SC-ARG + canavanine medium selecteren voor verlies-van-functie mutaties in het gen CAN1 en vergeleken met het totale aantal levensvatbare cellen uitgespreid op selectief medium frequenties / berekenen. Cellen van initiële populaties voor biotine labeling (IP) of na labeling biotine (PB) werden gekweekt met YPD medium van een initiële dichtheid van 5.000 cellen / ml near verzadiging. Lavender kolommen geven snelheidsmetingen en blauwe kolommen stellen frequentie metingen aangegeven temperaturen (20 ° C en 30 ° C). Sets van zeven duplokweken werden gedurende elk proces en 04:58 onafhankelijke proeven zijn uitgevoerd. Individuele tarief worden berekend voor onafhankelijke studies zijn aangetoond, en error bars voor deze onderzoeken vertegenwoordigen 95% betrouwbaarheidsintervallen te bepalend met behulp van een online calculator ^22. Frequenties vertegenwoordigen gemiddelden en standaarddeviaties. (B) CAN1- mutatie tarieven verkregen en weergegeven als beschreven voor deel A met behulp van een stam met CAN1 op de rechter arm van chromosoom VIII. (C) Mutatie frequenties verkregen volgende selectie voor mutant kolonies op 5-FOA gebruik een stam met het URA3-gen op de rechter arm van chromosoom VIII. Methoden waren anders als voor deel A, en de gemiddelden en standaarddeviaties voor drie of vier onafhankelijke studies worden getoond.

Figuur 3 Voorbeeld sorteerefficiëntie bepaald door het aantal geëlueerde cellen na elke ronde van sortering. (A) Het totale aantal cellen in elke populatie waarvan na biotine merken werd ingesteld op een, en het t otal aantal cellen aanwezig in de geëlueerde monsters uit elke magnetische celsortering werd gedeeld door de initiële waarden om de fractie gelabelde cellen te verkrijgen. Totaal aantal cellen werd bepaald uit cellen verkregen met een hemocytometer telt. Orange kolommen geven het gemiddelde en de standaardafwijking voor van drie onafhankelijke proeven na het standaardprotocol. Blue kolommen geven het gemiddelde en standaarddeviatie voor twee onafhankelijke studies waarin cellen direct na het sorteren werden behandeld met 1 mM waterstofperoxide gedurende 30 minuten. (B) grootte en morfologie van de cellen na biotine labeling (post-biotine) en moedercellen hersteld na de derde ronde van magnetische sortering (sorteer 3 moedercellen) gegeven met standaard helderveld microscopie en een 20X objectief. Witte lijnen in de achtergronden zijn van de lijnen die de kleinste vierkantjes zichtbaar op een standaard hemocytometer gebonden.k "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4 Bepaling van replicative leeftijd met handmatige kiem litteken tellen. Confocale microscopie werd gebruikt om bud littekens op individuele cellen gelabeld met een WGA-fluorescerende conjugaat (excitatie bij 488 nm en detectie met 458/543 nm band pass en 505 nm lange pass te tellen filtercombinatie). (A) Manual knop scar tellingen van cellen van de doorstroming (dochtercellen) na de derde ronde van magnetische sortering (n = 62). (B) handmatige knop scar tellingen van geëlueerde cellen (moedercellen) na de derde ronde van magnetische sortering (n = 54). (C) moedercellen behouden na de derde ronde van magnetische sortering gefotografeerd met een 63x olie-immersie objectief met 3x zoom na kleuren witha WGA-fluorescerende conjugaat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5 Bepaling van replicatieve leeftijd met behulp van flowcytometrie. Monsters van 10.000 cellen gekleurd met een WGA-fluorescerende conjugaat werden geanalyseerd door flow cytometrie met excitatie bij 488 nm en detectie met een 530/30 band pass en 505 lang door filterset. (A ) Histogrammen beeltenis van het aantal cellen met specifieke WGA-fluorescentie-intensiteiten voor een dochter celpopulatie of het eluaat (moeder cellen) na drie rondes van magnetische sorteren. Populaties overeen met die van figuur 4 geanalyseerd. Blauwe verticale lijnen geven de corresponderende positie voor de meerderheid van de daughter cellen aan de moedercel histogram. (B) De genormaliseerde geometrisch gemiddelde van fluorescentie signaal van elke in een populatie en drie extra populatie cellen (gemiddelde leeftijd 3.0, 6.9 en 14.4) werd berekend als de verhouding van het geometrische gemiddelde van de gekleurde cellen en het geometrische gemiddelde van de geschikte ongekleurde celpopulatie. Deze waarden worden uitgezet ten opzichte van het gemiddelde aantal bud littekens per totale populatie (Figuur 4 en data niet getoond). De ^R2 waarde voor de trendlijn van deze vergelijking wordt gegeven in de grafiek.

Figuur 6 Vergelijking tussen voorspelde en waargenomen mutatiefrequentie bij replicatieve veroudering. Cellen met mutaties in de CAN1-gen werden geselecteerd zoals beschreven bij figuur 2 using stammen met CAN1 op zijn normale plaats op chromosoom V (A) of de rechter arm van chromosoom VIII (B). Cellen werden gekweekt op vast medium bij 30 ° C voorafgaand aan biotine etikettering en bij 20 ° C daarna. Geobserveerde frequentie waarden worden getoond met oranje kolommen (Obs) en voorspelde frequenties voor de leeftijd van de cellen worden weergegeven met bruine zuilen (Pre). De eerste kolom van elke grafiek toont het gemiddelde en de standaardafwijking van de oorspronkelijke mutatiefrequentie na biotine etikettering van vier onafhankelijke proeven (PB). Getallen onder de kolommen geven het gemiddelde aantal bud littekens voor elke populatie (Cell Leeftijd). Onafhankelijke voorspelde waarden werden bepaald zoals beschreven in hoofdstuk 7 van het protocol met behulp van elk van de initiële snelheid waarden weergegeven in figuur 2A (IP kolommen) en 2B. Deze onafhankelijke waarden werden vervolgens gemiddeld. Geobserveerde waarden zijn middel van drie proeven. Foutbalken geven standaarddeviatie.

Discussie

Dit protocol combineert meerdere methoden om middelen mogelijk en benaderingen in de Saccharomyces cerevisiae modelsysteem tijdens mitose veroudering doeltreffender kunnen worden toegepast op de studie van genoom instabiliteit. Een grote verscheidenheid aan assays om verschillende vormen van instabiliteit van het genoom kwantificeren door fenotypische selectie kan worden gecombineerd met magnetische sortering mogelijke leeftijd-specifieke veranderingen in accumulatie van bepaalde vormen van mutaties of chromosoomherschikkingen bestuderen. Terwijl genoom sequentieanalyse benaderingen meer informatie kan verschaffen over de algemene soorten wijzigingen van een genoom met de leeftijd, het vermogen om fenotypische selectie systemen mutatie snelheidsmetingen verkrijgen en bij voorkeur isoleren specifieke genetische veranderingen zijn belangrijke voordelen voor het bestuderen mechanistische aspecten van veroudering gerelateerde genoom instabiliteit. Het stroomlijnen van de bepaling van de cel leeftijd en het potentieel om parallelle metingen van physiologi makencal veranderingen via flowcytometrie een efficiënte manier om het genoom instabiliteit met andere cellulaire veranderingen tijdens specifieke leeftijdsgroepen correleren. Bepaling van potentiële leeftijdsafhankelijke schommeling van accumuleren mutaties vereist: 1) zorgvuldige bepaling van tarieven bij jonge celpopulaties 2) nauwkeurige bepaling van cel leeftijd, en 3) het vermogen om betrouwbaar te verrijken voldoende grote populaties van moedercellen reproduceerbaar meten genoom instabiliteit op oudere leeftijd. Deze aanpak maakt het mogelijk de gist modelsysteem om bij te dragen aan het bepalen van de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de leeftijd-afhankelijke veranderingen in tarieven en / of frequenties van het genoom instabiliteit in mitotisch actieve cellen. Bovendien kunnen genetische en omgevingsfactoren snel worden beoordeeld voor bijdragen aan leeftijdsafhankelijke genoom instabiliteit. Uiteindelijk kunnen deze karakteristieken leiden tot ontwikkeling van modellen die rekening houden met de wijze waarop mutaties accumuleren tijdens replicatieve veroudering.

Deze werkwijze hangt af van het vermogen om mutaties of andere soorten genoom instabiliteit detecteren door het verschijnen van selecteerbare fenotypen te bekijken van dergelijke gebeurtenissen te meten. Echter, kan de creativiteit in assay ontwerp toe vele aspecten van het genoom instabiliteit te worden onderzocht. Zo kan de URA3 en CAN1 genen worden geplaatst op verschillende genomische locaties elke invloed van genomische locatie testen resultaten. Terugval van specifieke niet-functionele gen allelen tot functioneel gen allelen konden testen bepaalde mutatie-processen. Ook zou opneming van tal inactieve allelen van een gen of een gen met flankerende herhaalde sequenties worden gebruikt om recombinatiegebeurtenissen respectievelijk onderzocht wordt hersteld of verlies van genfunctie. Fluctuatie tests zijn de standaard aanpak voor het bepalen van de tarieven van de verschillende genoom instabiliteit gebeurtenissen ^9. Het protocol is geschreven met behulp van de algemeen aanvaarde en relatief eenvoudige Lea-Coulson mediaan schatter en muta bepalennatiegraad om het meer toegankelijk te divers onderzoekers te maken, ook al is de MSS-maximum likelihood schatter methode wordt beschouwd als de beste aanpak voor het bepalen van het aantal mutaties ^9. De MSS-maximum likelihood estimator eerder beoordeeld in detail ^9, en kan worden gebruikt als een alternatieve methode, maar vereist meer gesofisticeerde berekeningen. U kunt ook gratis software om mutatie berekenen met deze methode is beschikbaar ²² gemaakt. Het verkrijgen van reproduceerbare metingen van mutatiesnelheden vereist aandacht voor enkele aspecten van experimenteel ontwerp, waaronder met geschikt duplokweken, enten kweken worden in kleine initiële celdichtheden die populatieomvang verhoogt 10.000-voudig of meer, en het kiezen van geëigende hoeveelheden zodat de gehele celpopulatie kan worden uitgespreid op selectief medium. Voor dit laatste punt kan een eerder beschreven formule worden gebruikt om de mutatie snelheid aanpassen op basis van de fractie van de cultuur tested ^9. Variatie in de groei van culturen kan het bepalen van een reproduceerbare mutatie snelheid, en een aangepaste-mediaan gebaseerde schatter die meer reproduceerbare resultaten in dergelijke situaties is onlangs beschreven ²³ kan opleveren compliceren.

Het accuraat meten cel leeftijd andere factor die van belang is te bepalen of genoom instabiliteit frequenties oude cellen verschillen van de waarden verwacht vanwege de snelheid van gebeurtenissen bij jonge cellen. We hebben WGA kleuring gevonden voorkeur witte vlekken Calcofluor zijn, zowel qua achtergrond en flexibiliteit, aangezien WGA is geconjugeerd beschikbaar voor verschillende fluorescente moleculen. Deze flexibiliteit kan meer mogelijkheden bieden voor het gelijktijdig meten van andere cel kenmerken met fluorescerende reagentia. De eerste werkzaamheden om een ​​relatie tussen de intensiteit van het signaal voor de WGA kleuring en het bijbehorende aantal bud littekens op cellen te stellen, kan dan leiden tot een meersnelle bepaling van cel tijd door flowcytometrie. Deze aanpak maakt het ook mogelijk het gebruik van grotere populatie maten dan zouden in het algemeen door middel van microscopisch worden onderzocht voor een betere reproduceerbaarheid van de metingen. Terwijl meerdere bepalingen zou kunnen worden gemaakt door middel van microscopisch onderzoek van de cellen, voelen we dat de flowcytometrie aanpak maakt snelle screening van factoren die leeftijdsafhankelijke genoom instabiliteit beïnvloeden.

Naast meetcel leeftijd betrouwbaar, dient aandacht te worden besteed aan het aantal celdelingen moedercellen mogen ondergaan met elke opeenvolgende ronde van groeiende cellen en sorteren. Gebruik van een kleinere initiële populatiegrootte of grotere kweekvolume waardoor cellen meer celdelingen ondergaan alvorens de gewenste celdichtheid. Zo hebben andere onderzoekers gebruikt twee ronden van sortering zeer oude gistcellen ^16, waarbij als voordelen verkrijgen van oude cellen minder experime heeft verkregenntal stappen. Bij de beoordeling van de cultuur het volume te verhogen, zodat de cellen om meer celdelingen voorafgaand aan het sorteren te voltooien, rekening houden met de beperking van het totale aantal cellen dat in een enkele kolom kan worden verwerkt. Gebruik van een grotere cultuur volume kan het gebruik van meerdere kolommen noodzakelijk een celpopulatie te sorteren. Ook als cellen ondergaan minder rondes van celdeling tussen allerlei / inzamelpunten, dan zijn er meer mogelijkheden om afwijkingen van verwachte mutatie frequenties op verschillende tijdstippen te observeren tijdens de levensduur. Bijvoorbeeld, bemonstering alleen op vroege en late tijdstippen tijdens de levensduur kan data wijst op een gestage toename van de mutatie frequentie, maar bemonstering tegen extra tussenliggende momenten tijdens de levensduur kan snel en plateaus zien dat mutatie frequentie stijgt produceren. Echter, aangezien dit protocol isoleert oude moeder cellen, is er een mogelijkheid om een ​​meer directe meting van veranderingen in de mutatie tarieven met de leeftijd te verkrijgen. Fluctuatie testen kon be uitgevoerd met moedercellen van verschillende leeftijden te bepalen of de mutatie snelheid verschillen van de snelheid verkregen met jonge cellen. Terwijl het kweken van deze fluctuatie proeven een mengeling van oude en jonge cellen als ze groeien, kunnen eventuele afwijkingen van verktregen ab jonge cellen worden toegeschreven aan het gebruik van een oudere uitgangspopulatie.

De mogelijkheid om reproduceerbaar verkrijgen van een voldoende groot populatie moedercellen verouderd aan genoom instabiliteit nauwkeurige meting is cruciaal voor het succes van deze benadering. Terwijl het protocol beschrijft het gebruik van een bepaald magnetisch sorteersysteem hiervoor zijn andere groepen gist moedercellen gesorteerd met alternatieve systemen ^14,18 (zie tabel of Materials). Dergelijke alternatieve systemen moeten ook met deze methode, hoewel sommige optimalisatie van de protocollen van de fabrikant kan worden verlangd. Ongeacht het specifieke systeem dat wordt gebruikt, de grootte van de populatie nodigd verschilt afhankelijk van de frequentie van het type mutatie of genoomsegment herrangschikking gekozen studie. Minimaal moet er voldoende moedercellen ten minste een mutant kolonie per populatie verkrijgen van een mutatiefrequentie berekenen. In de praktijk kunnen de resultaten nogal variabel zijn als alleen nul tot vijf mutante kolonies worden verwacht van de populatiegrootte, en zelfs een kleine toename in densiteiten, zodat 09:55 mutante kolonies worden verwacht, kan sterk verbeteren reproduceerbaarheid. Wanneer biotine labelen van een beginnend bevolking, het herstel efficiëntie voor elke soort moet in aanmerking worden genomen om te helpen bij het identificeren van de juiste grootte van de populatie noodzakelijk om mutatie frequentie in oude moeder cellen te meten. Bij 90% terugwinning van moedercellen na elke soort, zou slechts 59% van de oorspronkelijke populatie worden hersteld na vijf ronden van groei en sortering. Deze daalt tot ~ 33% herstel van de oorspronkelijke populatie na vijf ronden van groei en sorteren als slechts 80% van gelabelde moedercellen worden herstellened tijdens elke soort. Meten en het maximaliseren van het herstel is van cruciaal belang bij het meten van laagfrequente gebeurtenissen, sinds een 2-3 voudige afname van de bevolkingsomvang gemakkelijk zou kunnen leiden tot onbetrouwbare aantallen mutant kolonies per bevolking.

Er zijn tal van mogelijkheden om uit te breiden op of dit protocol te wijzigen om een ​​breder begrip van het genoom instabiliteit tijdens mitotische celveroudering te verkrijgen. Eenvoudige voorbeelden zijn te analyseren hoe veranderingen in de gen-functies, media verandert, of andere veranderingen milieuconditie veranderen de accumulatie van mutaties met de leeftijd. Mutation bekijken van jonge cellen met veranderde genfunctie en in de relevante voorwaarde zou worden gemeten en bepaald of mutaties accumuleren anders dan voorspeld door de snelheid waarden en anders dan in de controle celpopulaties. Celpopulaties op verschillende punten tijdens replicative veroudering kunnen worden blootgesteld aan specifieke stressoren, zoals zuurstofradicalen of DNA-beschadigende middelen. Eenvoorbijgaande en milde blootstelling aan oxidatieve stress niet wezenlijk het vermogen om celsortering (figuur 3) voeren wijzigen maar zwaardere belasting kunnen de terugwinning van cellen bemoeilijken. Voorlopige experimenten nodig zou zijn om te controleren of de moeder cellen kan nog efficiënter na specifieke spanningen hersteld. Bovendien kan de cellulaire kenmerken van geïsoleerde moedercellen in detail geanalyseerd, zoals het niveau van reactieve zuurstof species, en vacuolaire mitochondriale morfologie, en andere fysiologische kenmerken die zijn geassocieerd met veroudering ^3. Voorts zou de moedercellen een populatie waarvan een verdere behandeling of manipulatie. Omdat moeder en dochter cellen fysiek worden gescheiden tijdens de procedure, de dochter cellen zijn ook nog beschikbaar voor analyse. Bijvoorbeeld veranderingen in de fysiologische kenmerken van de dochter van cellen of de asymmetrische erfenis van beschadigde macromoleculen tussen gist moeder en dochter cellen ^{24 kan worden vergeleken met de timing van een interessante veranderingen in de mutatie frequenties / tarieven. Mutatie frequenties voor dochtercel populaties kunnen worden verkregen om te proberen te modelleren of er asymmetrische overerving van mutaties gedurende replicatieve veroudering. Samenvattend combineren verrijking van moedercellen door magnetische celsortering met schommelingen proeven kan de voordelen van de S. cerevisiae modelsysteem doeltreffender kunnen worden toegepast op doel mechanismen verantwoordelijk voor de accumulatie van genetische veranderingen tijdens mitose veroudering.}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	100 mg
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-090-485	2 ml MicroBeads geconjugeerd met monoklonale muis anti-biotine antilichamen (isotype: muis IgG1)
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	25 kolommen geschikt voor QuadroMACS separator
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	Alleen Separator
QuadroMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-051	Inclusief: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Kolommen (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), Eén 2 ml eenheid van MACS MicroBeads. Opmerking: Alternatieve systemen omvatten Dynabeads Biotin Binder en MagnaBind Magnetische Kralen
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm	BD Biosciences	352340	40 µm voor gebruik met BD Falcon 50 ml Conische Tubes. 50 per pakket
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T6146	Poeder, filteren na oplossen is belangrijk om deeltjes te verwijderen
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488	Life Technologies	W11261	Conjugaten met verschillende excitatie/emissiespectra kunnen ook worden gebruikt
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930	10 ml, andere antifade reagentia kunnen ook worden gebruikt