Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

Samenvatting

Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.

Samenvatting

Een verscheidenheid aan cellulaire processen, zowel fysiologisch als pathofysiologisch, vereisen calcium of worden erdoor bestuurd, waaronder exocytose, mitochondriale functie, celdood, celmetabolisme en celmigratie om er slechts enkele te noemen. Cytosolisch calcium wordt normaal gesproken op lage nanomolare concentraties gehandhaafd; eerder wordt het aangetroffen in hoge micromolare tot millimolare concentraties in het endoplasmatisch reticulum, mitochondriale matrix en het extracellulaire compartiment. Bij stimulatie dient een voorbijgaande toename van cytosolisch calcium als signaal voor downstream-gebeurtenissen. Het detecteren van veranderingen in cytosolisch calcium wordt normaal gesproken uitgevoerd met behulp van een live-celbeeldvormingsopstelling met calciumbindende kleurstoffen die een toename van de fluorescentie-intensiteit of een verschuiving in de emissiegolflengte bij calciumbinding vertonen. Een live-celbeeldvormingsopstelling is echter niet vrij toegankelijk voor alle onderzoekers. Alternatieve detectiemethoden zijn geoptimaliseerd voor immunologische cellen met flowcytometrie en voor niet-immuunologische aderente cellen met een fluorescentie microplaatlezer. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde, eenvoudige methode voor het detecteren van veranderingen in epitheliale cellen met flowcytometrie met behulp van een calciumbindende kleurstof met één golflengte. Adherente renale proximale tubulus-epitheelcellen, die normaal gesproken moeilijk te laden zijn met kleurstoffen, werden geladen met een fluorescerende, celpermeabele calciumbindende kleurstof in aanwezigheid van probenecide, in suspensie gebracht en calciumsignalen werden gemonitord voor en na toevoeging van thapsigargine, tunicamycine en ionomycine.

Inleiding

Calcium is een belangrijke tweede messenger verantwoordelijk voor de overdracht van cellulaire fysiologische en pathofysiologische signalen ^1. Cytosolische calciumconcentraties worden door de activiteit van calcium pompen en uitwisselaars calcium laag gehouden. De sarcoplasmatisch / endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA) vult het endoplasmatisch reticulum (ER) calcium opslag als onderdeel van een "pomp lek" systeem dat het plasmamembraan calcium ATPase (PMCA) extrudeert calcium aan het extracellulaire compartiment, zowel ATP-afhankelijke manieren ^2. Fysiologische boodschappers, zoals hormonen of neurotransmitters, geven hun signalen via G-eiwit gekoppelde receptoren, activering van fosfolipase C, dat fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) in de plasmamembraan hydrolyseert om diacylglycerol en inositol-trifosfaat (IP3) ³ gegenereerd. Terwijl diacylglycerol blijft in de plasmamembraan, IP3 diffundeert in het cytosol en bindt aan IP3 receptors (IP3R), die ligand geactiveerde calciumkanalen in het ER membraan en calcium vrij uit het ER luminale winkel afgesloten met een toename van cytosolische calciumconcentraties ^4. Een alternatieve route voor calcium naar het cytosol te bereiken is door calciumkanalen en warmtewisselaars in de plasmamembraan. Crosstalk tussen deze twee compartimenten zijn beschreven: calcium geïnduceerde calcium vrijstelling (CKP) waar extracellulair calcium induceert calcium vrijlating uit ER winkels ^5, en op te slaan bediend calciumentryblokkade (SOCE) waar het legen van de ER-winkels wordt waargenomen door STIM en veroorzaakt opening van Orai calciumkanalen op het plasmamembraan naar hervullen van de ER winkels ⁶ promoten.

Onder pathofysiologische omstandigheden, de cellulaire calcium respons gedereguleerd en cytosolische calcium verhogingen in afwezigheid van fysiologische stimulatoren ^1. De calcium respons kan worden beïnvloed op een aantal manieren langdurige calciumsignaal vertraagd calcium verwijdering uit het cytosol, uitputting van calcium winkels of gelocaliseerde veranderingen in calcium. Bovendien de mitochondriën nemen een centrale rol in buffering en vrijgeven calcium ^7. Langdurige en / of supramaximale cytosolische calcium verhoging leidt tot celdood. In feite, calcium meestal niet betrokken bij de cellulaire respons pathofysiologische en is een belangrijke gebeurtenis in een breed scala aan ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekte, hartziekte, kanker, botziekte en nierziekten, die voornamelijk worden geassocieerd met celdood en verlies of wijziging van orgaan of weefsel functie ^8-10. Bovendien heeft verstoring van calciumsignalen gekoppeld aan cellulaire aanpassing en veranderingen in cellulaire functies en reacties.

Traditioneel worden calcium gemeten signalen met een negatief geladen fluorescente calcium indicator die in cellen is geplaatst in een cel permeabele acetoxymethyl (AM) estervorm. Eenmaal gesplitst door cellulaire esterases, de fluorescente indicatoren blijven binnen het intracellulaire compartiment en de toename in fluorescentie-intensiteit als calcium gebonden. De meest bekende en gebruikte calcium indicator is de ratiometrische Fura-2 ontwikkeld door Roger Tsien en collega ^11. Calcium indicatoren met verschillende affiniteiten voor calcium toe verschillende calcium zwembaden worden bewaakt. Detectiemethoden zijn live cell imaging, fluorescentie microplaataflezer en flowcytometrie. De relatief snelle kinetiek van calcium signalen (gewoonlijk binnen enkele seconden tot minuten) maakt beeldvorming van levende cellen de beste werkwijze voor het verkrijgen van de informatie over de kenmerken van de calcium signaal. Naast de snelle kinetiek van calciumsignalen (binnen milliseconden), live cell imaging is een betere methode voor het bestuderen van cellulaire compartimentering van calcium signalering binnen een enkele cel ^12. Absolute calciumconcentraties kunnen worden berekend door de minimum en maximum van de fluorescentie calcium indicator door toevoeging van een calcium chelator en permeabiliserende de cellen, respectievelijk, zoals beschreven door Grynkiewicz et al. ^11.

Het gebruik van flowcytometrie calcium signalen te meten werd eerst ontwikkeld in de jaren 1980 in immunologische cellen waarin de mogelijkheid vele parameters, zoals membraan integriteit en gescheiden celpopulatie, en het vereiste van cellen in suspensie in combinatie met de ontwikkeling van enkele golflengte meten calcium indicatoren gemaakt flowcytometrie een ideale en convenientdetection methode ^13-15. In hechtende cellen beeldvorming van levende cellen verschaft de informatie over calcium signalering, vooral de kinetiek, maar vereist een ingewikkelde installatie omvattende een fluorescentie microscoop, een perfusiesysteem, onderhoud van de cellulaire omgeving, zoals temperatuur, en gespecialiseerde software microscoop voor het verwerven en analyseren van gegevens. Alternatieve methoden zoals fluorescentie microplaat lezer of Pharmacological middel door het gebruik van calciumvangers zijn onvergelijkbaar qua opgedaan informatie. Flowcytometrie wordt op grotere schaal gebruikt cytosolische calcium in hechtende cellen volgen echter in de meeste studies slechts eindpunt metingen worden uitgevoerd. Volgens de methode oorspronkelijk ontwikkeld door Gergely et al. In immunologische B-cellen ¹⁶ zijn wijzigingen in cytosolische vrije calciumconcentratie door flowcytometrie met real-time kinetiek en monitoren van de fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke cellen uit een monster populatie succes gemeten in kankercellen epitheelcellen en kanker stamcellen hybriden ^17. Deze werkwijze werd verder aangepast voor gebruik in hechtende epitheelcellen die moeilijk te beladen met calcium indicatoren ¹⁸ zijn.

Hier, met behulp van een onsterfelijk aanhanger epitheliale cellijn afgeleid van de S1-segment van de rat nier proximale tubulus (WKPT-0293 Cl.2) ¹⁹ beschrijven we een geoptimaliseerde vereenvoudigd methode voor het meten van veranderingen in cytosolische calciumconcentratie door flowcytometrie. Aangezien veel epitheelcellen een aantal organische transporteurs voor anionische verbindingen bezitten, kan het laden van de cellen met een calcium indicator blijken te zijn een uitdaging. Om de uitstroom van calcium indicatoren, probenecide, de prototypische remmer van organische aniontransporters en oorspronkelijk ontwikkeld om de renale uitscheiding van penicilline ²⁰ afnemen voorkomen, wordt gelijktijdig toegepast in de incubatie medium. De cellen worden gehandhaafd in monolagen op calcium indicator laden gebracht suspensie en calcium signalen direct na toevoeging verbinding gedetecteerd.

Protocol

1. Bereiding van reagentia en oplossingen

1. Bereid een gemodificeerde Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) (in mm: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na ₂ HPO _4, 0,44 KH _{2PO 4,} 4,17 _NaHCO3, pH 7,2, zonder fenolrood). Bewaren bij 4 ° C.
2. Voeg 1,5 M _CaCl2 en 2 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) (pH 7,2) voorraadoplossingen met gedestilleerd water.
3. Bereid een 250 mM voorraad oplossing van probenecide. Voor het vrije zuur (vaak aangeduid als water oplosbaar), ontbinden probenecide poeder in 1 N NaOH, vul tot driekwart van het uiteindelijke volume met gedestilleerd water en langzaam titreren tot pH 7,4 met 1 N HCl. Bewaren bij 4 ° C.
4. Los fluorescente membraan permeabel calcium bindende kleurstof in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) een voorraad concentratie van 1 mM. Bewaar bij -20 ° C in het donker.
5. Voorafgaand aan elk experiment vers bereid, bevattende probenecide HBSS flux (PHF) buffer door combineren gemodificeerd met HBSS (in uiteindelijke concentraties) 1,5 mM _CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% foetaal runderserum, 2 mM probenecide en 5.55 mM glucose. Warm tot 37 ° C.

2. Celkweek

1. Plaat 2,5 x 10 ⁵ nier proximale tubulus cellen (WKPT-0293 Cl.2) per putje van een 6 well plaat of schaal van 35 mm in standaard kweekmedium en te groeien voor 2 dagen het bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 70%.

3. Calcium Dye Loading

1. Voor elk putje of schaal, meng 1 ml kweekmedium dat 5% foetaal runderserum, 4 uM celpermeabel calciumbindende kleurstof en 2 mM probenecide.
2. Vervang het kweekmedium met 1 ml loading dye mengsel in elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min in een bevochtigde incubator met 5% _CO2. Bedek de plaat met aluminiumfolie om het bleken van de fluorescerende indicator voorkomen.

4. Bereiding van CeLLS voor flowcytometrie

1. Warm 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing 37 ° C.
2. Zuig calcium loading dye oplossing uit elk putje en voeg 1 ml trypsine langs de wand van de put.
3. Incubeer bij 37 ° C totdat alle cellen losgemaakt.
4. Overdracht cellen om een ​​1,5 ml buis en pellet door centrifugeren in een microcentrifuge bij 10.000 g gedurende 1 min.
5. Zuig het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren.
6. Was de cellen door toevoeging van 1 ml PHF buffer en resuspendeer door en neer te pipetteren.
7. Pellet cellen door centrifugeren bij 10.000 g gedurende 1 min.
8. Herhaal stap 4.6. en 4.7. nog twee keer.
9. Resuspendeer cellen in een eindvolume van 500 pl buffer PHF en gebruik de cellen voor experimenten binnen 1 uur.
10. Optioneel: Aantal cellen naar de cel concentratie te bepalen en te gebruiken 5 x ^04-01 oktober x 10 ⁵ cellen per meting.

5. Flow Cytometer Setup

1. Start de flowcytometer, opent de fluïdica lade en draai de ventilatieklep tuimelschakelaar om de luchtdruk van de schede vloeistoftank verhogen.
2. "Prime" het instrument om potentiële wonende luchtbellen vanuit de binnenbanden en de stroom kamer te verwijderen.
3. In de flowcytometrie software, opent twee puntdiagram ramen.
   1. De eerste puntdiagram vereist voorwaartse strooilicht (FSC) voor de parameter X en zijkant diffuus licht (SSC) voor de parameter Y te controleren voor de kwaliteit van de cellen in het monster door respectievelijk grootte en granulariteit.
   2. De tweede dot plot meet de fluorescentie-intensiteit van de calcium gebonden kleurstof. Selecteer de juiste fluorescentie detectie kanaal voor de parameter Y met behulp van een logaritmische schaal en tijd in seconden voor de parameter X op een lineaire schaal.
4. Stel de snelheid in op 'high'.

6. flowcytometrie Measurement

1. Voer de metingen bij KT. In een flowcytometrie monsterbuis (11,5 x 75 mm), voeg 480 ul buffer PHF.
2. Voeg 20 ul celsuspensie en kort vortex te mengen.
3. Verplaats de tube draagarm aan de kant en plaats het monster buis over het injecteren van een monster buis totdat er een goede afdichting wordt gevormd. Zet de buis draagarm naar zijn oorspronkelijke positie gecentreerd.
4. Optimaliseren meting door aanpassing van de fluorescentie kanaal zodanig dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het monster op ongeveer 10 ² op de y-as. Slaan en te gebruiken voor verdere experimenten.
5. Om een ​​experiment te beginnen, herhaalt u de stappen 6,1-6,3.
6. Record basislijnfluorescentie 50 sec.
7. Pauze meting, verwijder het monster buis, voeg verbinding van interesse, vortex kort en terug te keren naar de monsterinjectie buis. Deze stap niet meer dan 15 seconden duren.
8. Hervat meting en gedurende een totaal van 204,8 sec.
9. Gebruik een calcium ionophore zoals ionomycine (10 uM) en een calcium chelator, zoals ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), _MnCl2 of _CoCl2 (2 mM), positieve en negatieve controles, respectievelijk.

7. Data Analyse

1. Analyseren van gegevens met behulp van speciale flowcytometrie software voor offline analyse, zoals WinMDI (Windows Multiple Document Interface voor flowcytometrie), een gratis software pakket ontwikkeld door Joe Trotter bij het Scripps Institute, flowcytometrie Core Facility.
2. Open een dot plot met SSC en FSC parameters.
3. Selecteer de regio van cellen voor analyse met behulp van de "Regio" tool (klik met de rechtermuisknop op de afbeelding) om dode cellen of cel puin gevonden in de linker benedenhoek van de data-analyse (figuur 1) uit te sluiten.
4. Kwadrant analyse (figuur 2)
   1. Open een dichtheid perceel tijd op de x-as en fluorescentie-intensiteit op de y-as. Gebruik alle evenementen.
   2. Onse dezelfde gating regio als in 7.3.
   3. Kwantificeren van de data met behulp van de "Quadrant" tool.
   4. Stel het kwadrant afscheiders zodat de verticale lijn wordt geplaatst ten tijde van verbinding toevoeging en de horizontale lijn in het middelpunt van de basislijn fluorescentie in de controles. Waarborgen dat de positionering van het kwadrant afscheiders gelijk in alle monsters.
   5. Het percentage cellen in elk kwadrant wordt weergegeven in elke hoek (figuur 2). Vergelijk het kwadrant rechtsboven (UR) tussen de monsters.
5. Histogram analyse (Figuur 3)
   1. Open de besturingsgegevens in een histogram raam met fluorescentie-intensiteit op de x-as en evenementen op de y-as. Gebruik alle evenementen.
   2. Voor een picturaal overzicht, voeg de testgegevens te worden vergeleken met de controle plot als overlay percelen (ga naar Bestand → Open File → Archief → Overlay).
   3. Voor kwantitatieve analyse enkele histogram winnendows worden gebruikt. Gate de celpopulatie met behulp van de regio R1 vanaf stap 7.3.
   4. In de niet behandelde controle, gebruikt de markering functie ("Markers") om het gebied voor ze vanuit het midden tussen de minimum en maximum fluorescentie van de controle piek en eindigt bij de maximale fluorescentie-intensiteit markeren. Het percentage cellen in dit gebied wordt berekend.
   5. Ophalen gegevens uit de statistieken venster. Herhaal dit voor de overige data bestanden met dezelfde gemarkeerde gebied voor analyse.
6. Fluorescentie-intensiteit analyse (Figuur 4)
   1. Open een puntenplot tijd op de x-as en fluorescentie-intensiteit op de y-as. Gebruik alle evenementen.
   2. Enable "Kinetics Mode" en "Overlay Kinetics Line". Een blauwe lijn verschijnt in de dot plot die de gemiddelde fluorescentie-intensiteit.
   3. Kwantificeren van de relatieve instroom van calcium door het creëren van meerdere rechthoekige regio. Elke regio moet aw hebbenidth van ongeveer "50", hetgeen overeenkomt met "10 sec". Definieer tot 15 rechthoekige gebieden.
   4. Ophalen kwantificering van de statistieken venster en kopieer in een spreadsheet.
   5. Gebruik de y-gemiddelde gegevens voor analyse. Bereken het gemiddelde van R2 tot R6, wat overeenkomt met 20 tot 50 sec. Dit is de uitgangswaarde.
   6. Kies een geschikte tijdsinterval voor calciuminflux analyse (afhankelijk van aanvang, de duur en intensiteit).
   7. Bereken de calcium signalen van elk gebied binnen het tijdsinterval van het gemiddelde uitgangswaarde, dat wil zeggen, het fluorescentiesignaal voor verbinding toevoeging, die is ingesteld op 100%. Bepaal het gemiddelde en de standaarddeviatie van de regio's te posten verbinding toevoeging; Dit is de gemiddelde calcium signaal opgewekt door de verbinding.

Resultaten

Om cytosolische calcium te verhogen, werden twee farmacologische verbindingen toegepast op renale proximale tubulus cellen (WKPT-0293 Cl.2) geladen met celpermeabel calcium binden kleurstof, Fluo-3-AM. Niet-behandelde controlemonsters werden beladen met calcium bindende kleurstof in aanwezigheid van probenecide en gemengd zonder toevoeging van verbindingen. Thapsigargine (TG) is een klassieke remmer van de SERCA pomp leidt tot lekkage van de ER en resulteert in een verhoogde cytosolische calcium. Tunicamycine (TUN) blok...

Discussie

Calcium is een belangrijke gebeurtenis in verschillende cellulaire processen als een tweede boodschapper signaalmolecule en ook als een middel voor communicatie tussen de ER en mitochondria. Het vermogen om veranderingen in vrije cytosolische calciumconcentraties meten is een nuttige techniek die kan worden toegepast op alle gebieden van celbiologie. Er zijn verschillende methoden om cytosolische calcium signalen te detecteren. Klassiek, signalen van een ratiometrische calcium indicator, zoals Fura-2, worden bewaakt in ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Celpermeabel
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Niet oplosbaar in water, oplossen in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Houd er rekening mee dat dit een oudere 16-bits applicatie is die FCS 2.0 compliant bestanden leest, maar FCS 3.0 digitale gegevens niet herkent.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Beschikbaar gesteld door Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)