Methodenartikel

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

16.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51860

⸱

21 augustus 2014

 , 
1Molecular, Cellular and Developmental Biology Graduate Program, The Ohio State University, 2Center for Cardiovascular and Pulmonary Research, The Heart Center, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, The Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

De mogelijkheid om endotheelcellen van hartkleppen (VEC's) te isoleren, is van cruciaal belang voor het begrijpen van mechanismen van klepontwikkeling, onderhoud en ziekte. Hier beschrijven we de isolatie van VEC's van embryonale en volwassen Tie2-GFP muizen met behulp van FACS, wat studies mogelijk maakt om de bijdrage van VEC's in ontwikkelings- en ziekteprocessen te bepalen.

Samenvatting

Normale klepstructuren bestaan uit gelaagde lagen van gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) doordrenkt met klepinterstitiële cellen (VICs) en omgeven door een monolaag van klependotheelcellen (VECs). VECs spelen essentiële rollen bij het vestigen van de klepstructuren tijdens de embryonale ontwikkeling en zijn belangrijk voor het handhaven van de levenslange klepintegriteit en functie. In tegenstelling tot een continu endotheel over het oppervlak van gezonde klepblaadjes, wordt VEC-verstoring vaak waargenomen bij defecte kleppen en is geassocieerd met pathologische processen die klepziekte en disfunctie bevorderen. Ondanks de klinische relevantie zijn er beperkte studies die de bijdrage van VECs aan ontwikkelings- en ziekteprocessen bepalen. De isolatie van VECs uit diermodellen zou celspecifiek experimenteren mogelijk maken. VECs zijn geïsoleerd uit volwassen diermodellen, maar vanwege hun kleine populatiegrootte, fragielheid en gebrek aan specifieke markers, zijn er geen meldingen van VEC-isolaties in embryo's of volwassen kleine diermodellen. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de directe isolatie van VECs uit muizen in embryonale en volwassen stadia mogelijk maakt. Met behulp van het Tie2-GFP reportermodel dat alle endotheelcellen labelt met Green Fluorescent Protein (GFP), zijn we erin geslaagd GFP-positieve (en negatieve) cellen te isoleren uit de semilunair en atrioventriculaire klepregio's met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Geïsoleerde GFP-positieve VECs zijn verrijkt met endotheelmarkers, waaronder CD31 en von Willebrand Factor (vWF), en behouden endotheelcelexpressie bij cultuur; terwijl GFP-negatieve cellen moleculaire profielen en celvormen vertonen die consistent zijn met VIC-fenotypen. De mogelijkheid om embryonale en volwassen muis-VECs te isoleren, maakt eerder onbereikbare moleculaire en functionele studies mogelijk op een specifieke klepcelpopulatie, wat ons begrip van klepontwikkeling en ziektemechanismen aanzienlijk zal verbeteren.

Inleiding

De rijpe klep bestaat uit drie gelaagde lagen gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) afgewisseld met ventiel interstitiële cellen (VIC) en ingekapseld door een enkele laag hartklep endotheelcellen (VECs) 1. De rol van de ECM is alle noodzakelijke biomechanische eigenschappen te verschaffen op de voortdurend veranderende hemodynamische werking weerstaan ​​tijdens de hartcyclus. Omzet van de klep ECM in de volwassen klep wordt strak gereguleerd door VIC die grotendeels rustige en fibroblast-achtige in afwezigheid van ziekte. Naast de VIC bevolking, hartklep endotheelcellen (VECs) vormen een ononderbroken endotheel over het oppervlak van de klepslippen 2. Terwijl het belang van de ECM en de VIC's voor klep structuur en functie zijn beschreven door ons en anderen, wordt de rol van VECs minder bekend. Echter, deze relatief kleine celpopulatie is essentieel voor de vorming klep in het embryo en wordt beschreven als disfunctioneel ventielziekte.

Hartvorming klep in het embryo begint als een subset van endotheelcellen in de atrioventriculaire kanaal en uitstroombaan regio ondergaan endotheliale naar mesenchymale transformatie (EMT) en vorm zwellingen bekend als endocardiale kussens 1,3. De nieuw getransformeerde mesenchymale cellen binnen deze structuren later differentiëren in VIC en vormen de volwassen kleppen. Zodra EMT is voltooid, endotheliale cellen rondom de kussens, VECs genoemd, vormen een ononderbroken endotheliale cellaag die de mature klep tegen schade beschermt. Bovendien VECs zin de hemodynamische omgeving en is aangetoond dat moleculair communiceren met onderliggende VIC regulering ECM homeostase 1,3. In zieke kleppen, is het VEC monolaag verstoord in samenwerking met abnormale veranderingen in de ECM-organisatie en veranderde biomechanica 4,5. Bovendien studies in muismodellen suggereren dat VEC disfunctie de onderliggende oorzaak van klep disease 1,6-9. Als VECs spelen een belangrijke rol bij klep ontwikkeling, onderhoud en ziekte, is het van belang dat we de temporele fenotypen volledig te bepalen om het veld bevorderen en mechanismen van ziekten begrijpen.

Eerder werk van verschillende laboratoria met succes geïsoleerd VECs van varkens en schapen modellen 10-12. Vanwege de grote omvang van deze kleppen, isolatie door zwabberen en / of enzymatische digestie, gevolgd door een aantal verschillende isolatiemethoden waaronder magnetische korrel scheiding cel en cel klonale expansie effectief pure populaties 11-13 genereren geweest. Echter, deze modellen beperkend vanwege de onvolledige annotatie van de varkens en schapen genomen een beperking van de moleculaire instrumenten naast de hoge kosten. Daarom experimenteren van varkens en schapen VECs na isolatie kan beperkend zijn. Muismodellen zijn voorkeur vanwege de vele mogelijkheden voor genetische manipulatie en moleculaire technieken in het embryo en volwassen, maar tot op heden geen VEC isolatie in kleine proefdiermodellen zijn gemeld. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de moeilijkheid van het werken met kleine weefselmonsters minderheid celpopulatie die nog ontbreken unieke identiteit van VEC-specifieke markers, waardoor antilichamen gebaseerde isolatiemethoden voorkomen omvatten.

In dit artikel beschrijven we een nieuwe methode voor directe isolatie van muizen VECs op embryonale en volwassen stadia. Dit protocol maakt gebruik van Tie2-GFP muizen die GFP in alle endotheliale celtypes tot expressie en zijn uitgebreid gebruikt om endotheelcellen populaties 14 bestuderen. De nieuwheid van deze studie is dat deze muizen voor de eerste keer zijn gebruikt om endotheelcellen te isoleren van de kleppen. Door zorgvuldige dissectie van het klepweefsel en een reeks van negen enzymatische digestie gevolgd door FACS-sortering kan VECs worden geïsoleerd en gebruikt voor diverse experimentele techniekenclusief RNA-extractie en cultuur, direct na het sorteren.

Protocol

1 Voorbereiding van apparatuur en oplossingen

  1. Steriliseer de dissectie-instrumenten - fijn weefsel schaar om volwassen harten en 2 fijne tang halen voor dissectie van de valvulaire regio - in een autoclaaf in een overdekte bak instrument. Spray gereedschappen met 70% ethanol (EtOH) vóór dissectie.
  2. Bereid alle oplossingen onmiddellijk voorafgaand aan het experiment en steriliseer oplossingen door ze door een steriel 0,2 urn filter. Een oplossing op ijs tot gebruik.
    1. Steriele Dissociatie Buffer (15 ml totaal / monster). Combineer 1,2 ml collagenase IV, 300 ul 2,5% trypsine en 150 pi chick serum. Breng het volume aan met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) 15 ml.
    2. Steriele Selectie Buffer (12 ml totaal). Combineer 25 pi 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 12 ul DNase I (RNase-free). Breng het volume aan met HBSS 12 ml.
    3. VEC Cultuur Media. Mix endotheliale growth media volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaal spreadsheet) door toevoeging van de componenten in porties uit de set 500 ml EBM2 media.
    4. GFP Negatieve Culture Media (niet-endotheelcellen media). Meng 445 ml Medium 199 met 1 x 5 ml penicilline / streptomycine (pen / strep) (1% eindconcentratie) en 50 ml FBS (10% eindconcentratie).

2 Dissectie van de Valvulaire Gewest van volwassen muizen en E14.5 embryo

  • Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Nationwide Children's Hospital Research Institute IACUC richtlijnen.
  • Tie2-GFP muizen werden gekocht van Jackson Laboratories (voorraad nummer 003658) 14 en werden gehandhaafd als homozygote genotypen op een FVB / N achtergrond, en dus ervoor te zorgen dat alle off-voorjaar uitdrukkelijke GFP in Tie2-positieve endotheelcellen.
  • Voor FACS sortering, bereiden een vergelijkbare leeftijd negatieve sample die geen GFP bevat zoals C57 / Bl6 GFP gate parameters voor FACS-sortering stellen. OPMERKING: Dit protocol en representatieve resultaten zijn gebaseerd op het gebruik van drie, vier maanden oude volwassen muizen of een nestje op embryonale dag (E) 14.5.
  1. Volwassen muizen: Onmiddellijk na het offer van CO 2 anoxie, gebruiken dissectie schaar om voorzichtig openen van de borstholte en het hart en de longen bloot. Eenmaal blootgesteld, greep het hart met een tang aan de grote slagaders en weg te trekken van het lichaam. Verwijder longweefsel als intact, en plaats harten in koude HBSS te spoelen. Verwijder de ventrikel en trek de atria weg verlaten van de atrioventriculaire kanaal 'ring' en de aorta's intact. Maak een insnijding langs de zijkant van atrioventriculaire kanaal naar het openstellen van de 'ring' en de valvulaire structuren bloot te leggen. Verwijder het myocard en de proximale aorta regio door zachtjes plagen weg met een pincet. Identificeer de klepbladen als witte, dichte weefsel over het roze myocard. Deta voorzichtigch chordae tendinae van de atrioventriculaire kleppen en verwijder zoveel van de resterende myocardium mogelijk. Wees voorzichtig om niet te trekken of schrapen van de klepbladen tijdens dit proces sinds VECs kan worden verdreven. Plaats getrimd valvulaire regio's in een 1,5 ml Eppendorf buis met 1 ml HBSS en blijf op ijs. OPMERKING: Een zorgvuldige dissectie is van cruciaal belang om niet-valvulaire endotheelcellen die het monster kon besmetten elimineren.
  2. Embryo's: Sacrifice vrouwelijke muizen 14,0 dagen na de copulatie stekker is waargenomen (ochtend van copulatie plug = 0,5 dagen).
    1. Onmiddellijk na het offer, ontleden de baarmoeder (met embryo's) en wassen in koud HBSS. Ontleden individuele embryo's uit de baarmoeder en verwijder de embryonale dooierzak rond elk embryo. Verwijder de harten van elk van de embryo's en volg stap 2.1. (NB: knijpen het embryo met een pincet onder de bovenste aanhangsels zou moeten helpen om het hart bloot te leggen en het gemakkelijker verwijderen.)
3. Cel Dissociatie en voorbereiding voor het FACS

  1. Met behulp van een steriele pipet tips, verwijder HBSS van de Eppendorf buis met de valvulaire regio.
  2. Te vervangen door 1 ml dissociatie buffer en 4 pl DNase I.
  3. Draai de buizen bij 37 ° C gedurende 7 minuten.
  4. Pipet op en neer 3 keer en dan laat het monster regelen voor 15 sec. Verzamel de bovenstaande vloeistof (die de gedissocieerde cellen) in een 15 ml conische buis.
  5. De collagenase reactie te stoppen, voeg 125 pl paardenserum de verzamelbuis. Houd collectie buis op ijs.
  6. Herhaal dissociatie stap (3,2-3,5) negen maal negen fracties van supernatans verzameld.
  7. Leid de gespreide verzameling door een 70 urn nylon filter in een nieuwe verzamelbuis een enkele celsuspensie te waarborgen door het verwijderen van vuil en bosjes.
  8. Spin de suspensie bij 400 g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
  9. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml Sorteren Buffer enhouden op ijs tot FACS.

4 FACS sorteren GFP positieve VECs

  1. Stel poorten voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing om vuil uit te sluiten en te vangen enkele cellen; sluiten wambuizen door discriminatie doublet gating. Noteer de negatieve controle monster en definiëren poort instellingen, om te vergelijken en nauwkeurig bepalen van de GFP-positieve cel populatie in de Tie2-GFP monster.
  2. Analyseer GFP positieve cellen via FACS en verfijnen poort instellingen.
  3. Sorteren Tie2-GFP monster en laat zowel GFP-positieve en GFP-negatieve cellen. Indien cellen worden gebruikt voor RNA-extractie, sorteren rechtstreeks in de Selectie Buffer. Om kweek cellen na FACS, verzamel GFP positieve cellen in een steriele buis met 1 ml VEC medium met 1 ml FBS en verzamel GFP negatieve cellen in 1 ml van niet-endotheliale media met 1 ml FBS. Gebruik deze 50% media / 50% serum combinatie levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren. Houden op ijs tot na de FACS-analyse.

5 Bericht FACS Analysis

  1. RNA-extractie:
    1. Onmiddellijk na FACS, centrifuge GFP positieve en negatieve cellen bij 1500 xg gedurende 8 minuten.
    2. Pipet voorzichtig de bovenstaande vloeistof (sorteren buffer) en gooi ze weg.
    3. Resuspendeer de cel pellet (pellet is niet toegankelijk voor de steekproefomvang hier aanbevolen) in 200 ul Trizol.
    4. Invriezen bij -80 ° C of begin standaard fenol-chloroform extractie aan totale mRNA geïsoleerd zoals eerder beschreven door ons laboratorium 15.
    5. Gebruik 50-200 ng RNA voor cDNA-synthese met de Mastermix volgens de instructies van de fabrikant.
    6. Betreft cDNA kwantitatieve PCR amplificatie met IDT Primetime qPCR probes tegen muizen endotheelcel merkers (CD31, von Willebrand Factor (vWF)), klep interstitiële cel markers (α-gladde spier actine (α-SMA), periostin (Postn)), myocyten markers (Mhc6, Mhc7) en GAPDH.
  2. Het kweken van muizen VEC:
    1. Na FACS sortering en celinzameling (stap 4.3), centrifuge cellen bij 300 g gedurende 5 minuten.
    2. Pipet voorzichtig uit de bovendrijvende (sorteren buffer + media) en gooi ze weg.
    3. Resuspendeer de GFP-positieve cel pellet in 1 ml VEC media en GFP-negatieve pellet in 1 ml niet-endotheliale media.
    4. Plate elk monster in een putje van een plastic kamer glijbaan en groeien tot samenvloeiing. Culture ongeveer 1 week voor GFP negatieve cellen confluent worden en meer dan 2 weken voor GFP positieve cellen confluent worden (bij een monster van 3 volwassen muizen). Veranderen media om de twee dagen.
  3. Immunofluorescentiekleuring:
    1. Verwijder media uit cellen en fixeer 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Was gefixeerde cellen driemaal gedurende 5 minuten elk in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Verwijder kamer putjes van dia en blok in 5% runderserumalbumine / 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    3. Incubateslides O / N bij 4 ° C met primaire antilichamen (CD31, 1: 1000 of α-gladde spier actine (α-SMA), 1: 100). Was 3x gedurende 5 min in PBS.
    4. Verdun het secundaire antilichaam (Alexa-Fluor 568 geit anti-rat) 1: 400 in PBS, toe te voegen aan dia's, en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel de objectglaasjes 3x voor 5 min in PBS.
    5. Zet in Vectashield-bevattende DAPI en incubeer 1 uur bij 4 ° C vóór het bekijken.

Resultaten

Tie2-GFP-cellen co-lokaliseren met endotheelcellen markers in de embryonale en volwassen hartkleppen.

Om de specificiteit van Tie2-GFP expressie in VECs van embryonale en volwassen muizen bevestigen, werd immunofluorescentie uitgevoerd co-lokalisatie met de endotheelcel merker, CD31 bepalen weefselcoupes bereid van E14.5 en 3 maanden oude volwassen Tie2-GFP muizen met behulp van methoden vroeger door ons lab 16. Zoals getoond in figuur 1, VECs co-express GFP (Figuur 1 A, B, E, F) en CD31 (Figuur 1 C, D, E, F) zowel volwassenen (figuur 1 B, D, F) en embryonale ( Figuur 1 A, C, E) stages derhalve valideren ons model voor daaropvolgende VEC isolatie.

FACS analyse identificeerde verschillende GFP-positieve en GFP-negatieve celpopulaties in embryonale en volwassen hartkleppen geïsoleerd uit Tie2-GFP muizen.

Wilde type C57 / Bl6 muizen werden gebruikt om GFP parameters en ongeveer 2% van single-gated cellen van Tie2-GFP muizen een significante verrijking in GFP-positieve cellen door FACS-analyse in zowel embryonale en volwassen monsters (figuur 2). Op basis van co-localisatie studies getoond in figuur 1, worden deze cellen als VECs en leveren gemiddeld 61.800 totale cellen (monsters variëren van 39,000-77,000 cellen / monster) bij volwassen monsters (n = 3), en 8.928 cellen (8,015- 11.000 cellen / nest) van het ene nest van E14.5 embryo's.

PCR analyse bevestigt verrijking van endotheel markers in GFP-positieve cellen en klep interstitiële cel markers in GFP-negatieve cellen geïsoleerd uit Tie2-GFP muizen.

Genexpressie analyse van GFP positieve en negatieve celpopulaties door qPCR volgende FACS tonen verschillende moleculaire profielen. Vergeleken met GFP negatieve celpopulaties geïsoleerd van Tie2-GFP embryo's en adults, worden GFP positieve cellen verrijkt voor expressie van endotheel markers CD31 en vWF, (figuur 3). Verder expressie van myocyten markers (Myh6, MYH7) in deze cel populaties zeer laag, demonstreren minimale contaminatie van niet-endotheelcellen. Daarentegen worden GFP negatieve cellen geïsoleerd uit volwassen Tie2-GFP muizen en E14.5 embryo verrijkt voor afsluiter interstitiële cel (VIC) markers, α-sma en periostin (POSTN) ten opzichte van GFP positieve cellen. Verrijking van deze merkers is hoger in GFP negatieve cellen geïsoleerd uit E14.5 monsters vergeleken met volwassenen door de ruststroom fenotype van volwassen VIC en dus lage expressie van geactiveerd markers.

GFP-positieve cellen geïsoleerd uit Tie2-GFP volwassen muizen worden gekweekt in vitro.

Het vermogen cultuur GFP positieve en negatieve cellen GFP geïsoleerd uit volwassen monsters onderzocht based Op cel morfologie en immunohistochemische kleuring. Met protocols eerder door ons beschreven 17 zien we in figuur 4 die GFP positieve cellen blijken door in morfologie (figuur 4A) en co-express GFP met de endotheelcel merker CD31 na twee weken in kweek (Figuur 4C). In tegenstelling, niet-endotheliale cellen zijn negatief voor GFP, weer een mesenchymale-achtige morfologie (figuur 4B) en drukken de VIC marker α-SMA na negen dagen (Figuur 4D).

figure-results-1
Figuur 1 Tie2-GFP-positieve cellen co-lokaliseren met CD31 in embryonale en volwassen hartkleppen. Immuunfluorescentie tot vereniging van (Tie2-) GFP expressie (A, B) met de endotheelcellen marker vertonen, CD31 (C, D) in de septal folders van de mitralisklep bij E14.5 (A, C, E) en volwassen (B, D, F) fasen. De klep regio is gemarkeerd in A, C, E. (E, F) Samengevoegd beelden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2 Tie2-GFP-positieve VECs kan worden geïdentificeerd door FACS. Opzichte van vergelijkbare leeftijd C57 / Bl6 controles (A, C), kleppen geïsoleerd uit Tie2-GFP embryo (B) en volwassenen (D) bevatten afzonderlijke GFP positieve celpopulatie, zoals aangegeven in groen. GFP-negatieve gebeurtenissen, in rood weergegeven werden verzameld als een controle. Getallen in (B) en (D) geven de gemiddelde% van GFP-pOSITIEVE cellen van het totale aantal wedstrijden gesorteerd op FACS (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3 GFP-positieve cellen zijn verrijkt op endotheliale cel markers dat GFP-negatieve cellen brengen genen geassocieerd met ventiel interstitiële cellen. Representatieve qPCR van endotheelcellen merkers (CD31, von Willebrand Factor (vWF)) en volwassen (Myh6) en foetale ( MYH7) myocyte markers in GFP-positieve cellen geïsoleerd uit valvulaire gebieden van E14.5 (A) en volwassen (B) Tie2-GFP muizen. Note verrijking van endotheel markers en zeer lage niveaus van myocyt geassocieerde genen. (C, D) Vouw change's in de expressie van de klep interstitiële cel markers α-sma en Postn in geïsoleerde GFP-negatieve cellen van E14.5 (C) en volwassen (D) Tie2-GFP muizen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4 Tie2-GFP-positieve cellen behouden expressie van endotheelcel markers in vitro. Na FACS, GFP positieve (A, C) en negatieve (B, D) celpopulaties van volwassen muizen werden gekweekt tot confluente en met fase contrast beeldvorming (A, B) en fluorescent immunokleuring (C, D). GFP-positieve cellen brengen CD31 (rood) (C) na10 dagen van de cultuur. Daarentegen werd GFP-expressie niet gedetecteerd ontkennend celpopulatie, die voor α-SMA, een marker van geactiveerde VIC (D) positief gekleurd.

Discussie

Hier beschrijven we voor de eerste keer een nieuwe methode voor het isoleren van embryonale en volwassen muizen VECs van Tie2-GFP muizen. Hoewel deze muis lijn uitgebreid is gebruikt voor het isoleren van endotheliale celpopulaties, is dit het eerste rapport met selectieve isolatie van VECs. Vanwege de kwetsbaarheid van de VEC populatie hebben we een stringent protocol waarmee voor enkele cel isolatie van GFP positieve (en GFP negatief) cellen van hartkleppen van embryonale en volwassen muizen ontwikkelden. Vergeleken met de oorspronkelijke publicatie met gehele embryo of organen van Tie2-GFP muizen 14 hebben we collagenase en dissectie stappen achtereenvolgens op de lage abundantie van deze kwetsbare endotheliale celpopulatie een select populatie van cellen te isoleren geoptimaliseerd.

VEC isolaties hebben voorheen alleen gemeld in grote diermodellen met een beperkte genetische en biomoleculaire gereedschappen. Deze tools zijn goed ingeburgerd in muizen en daarom de ability murine VECs isoleren maakt een uitgebreide reeks experimentele ontwerpen worden gebruikt voor hartklep onderzoek. Daarom is een belangrijk voordeel van deze benadering is dat VECs tijdelijk kunnen worden geïsoleerd uit wild type muizen en modellen van de klep ziekten en letsel. Een tweede voordeel is dat VECs kan worden geïsoleerd en vrijwel direct na dissectie geanalyseerd behoud expressiepatronen die de in vivo situatie beter reflecteren. Verder, deze isolatieprotocol volstaat celcultuur elimineren voor nummer expansie en dus potentiële fenotypische veranderingen bij de in vitro omgeving worden voorkomen.

Ondanks de nieuwigheden en experimentele voordelen van dit protocol, erkennen wij dat de beperkingen nog steeds bestaan. Ten eerste de grootte van de VEC bevolking in muizen kleppen is zeer klein en daarom worden meerdere getimede embryonale nesten noodzakelijk om voldoende RNA genexpressie analyse genereren. Terwijl this kan worden overwonnen met behulp van meerdere fokkers, kan het een impact hebben op de toepassing van een aantal na-isolatie analysetools hebben. Deze beperking is een uitdaging bijzonder voor vaststelling confluente kweken van GFP-positieve VECs om grondiger analyses van VEC fenotypen zoals moleculaire profielen en functionele assays. Daarom erkennen wij dat niet alle problemen zijn opgelost door onze aanpak, maar dit is een gebied van belang dat we streven om te overwinnen.

Deze benadering van het isoleren VECs van valvulaire regio introduceert de mogelijkheid van contaminatie van de Tie-GFP -positieve, niet-valvulaire endotheelcellen van het endocard, of vasculaire structuren binnen het ventriculaire myocard. Tot op heden hebben de moleculaire onderscheid van VECs van andere cardiale endotheelcellen populatie niet geïdentificeerd. Echter een enhancer regio van het Nfatc1 gen is geïdentificeerd en aangetoond dat specifiek label VECs dat niet doenEMT ondergaan en geen andere endotheliale celpopulatie in het hart 18. Als Cre model (Nfatc1 Encre) beschikbaar is, kan de toekomstige studies de specificiteit van deze lijn te gebruiken om besmetting risico's te minimaliseren. Naast niet-valvulaire Tie2-GFP-positieve cellen, is er altijd de mogelijkheid van besmetting van myocyten op het punt waar de klepbladen hechten aan het ringvormige gebied van het septum mural myocardiale wanden. In data niet getoonde wij aanvankelijk begonnen studies isoleren VECs van ontleed valvulaire regio met behulp van antilichaam-geconjugeerde kralen gecoat met anti-GFP en anti-CD31. Hoewel deze benadering succesvol voor het isoleren van de endotheelcellen was, ondervonden we aanzienlijke cel klonteren van aangrenzende, niet-endotheliale celsoorten en derhalve VIC en myocardiale cellen besmet onze experimentele monster. Deze is vermeden middels FACS analyse parameters zijn ingesteld om slechts enkele celsuspensie isolerens en PCR analyse detecteren expressie van myocyten specifieke genen gecontroleerd voor deze beperking (figuur 3). Terwijl onze vervuiling kan worden beschouwd als minimaal, het blijft een potentiële experimentele complexiteit die kan worden vermeden in de toekomst met de dubbele selectie van GFP en endotheelcellen-specifieke oppervlakte markers.

Met dit protocol, hebben we met succes geïsoleerd VECs van embryonale en volwassen muizen en voorbeelden gegeven van hoe deze aanpak kan worden gebruikt voor RNA-isolatie en celkweek van GFP positieve en negatieve GFP celpopulaties. Echter, deze benadering niet beperkt tot deze toepassingen en kan worden gebruikt voor een grote verscheidenheid aan moleculaire, cellulaire en functionele benaderingen. Daarnaast kan de Tie2-GFP achtergrond worden gefokt met genetische muismodellen die zal zorgen voor vergelijkende studies van VEC bevolking in gezondheid en ziekte. De ontwikkeling van deze nieuwe methodologie voor het eerst kunnen worden gericht studiesonderzoekt de bijdrage van VECs in ontwikkeling en onderhoud klep en eerder unappreciated mechanismen van endotheel-afhankelijke klep ziekte kunnen onthullen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytische Cytometry Core faciliteit, specifiek Katrina Moore, voor technische bijstand met FACS-analyse. Daarnaast herkennen we Dr William Pu en zijn groep voor hun wetenschappelijke inzichten. Dit werk werd ondersteund door NIH HL091878 (JL) en The Heart Center in Nationwide Children's Hospital.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)Life TechnologiesA-11077
70 μm nylon cell strainerBD Falcon352350
2.5% TrypsinInvitrogen LT15090-046
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock TreatedFisher ScientificBP1600-100
CD31 rat anti-mouse antibodyBD Pharmingen553370
Chick SerumInvitrogen LT16110-082
Collagenase IVInvitrogen LT17104-019Bereid volgens de instructies van de fabrikant
DNase I, RNase free (10,000 Units)Roche4716728001
EBM-2LonzaCC3156Voor VEC-media
EDTA, 0.5 M SolutionHoefer03-500-506
EGM2 SingleQuot, BulletkitLonzaCC-4176Voor VEC-media
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat InactivatedHycloneSH3007103IH
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14025-092
Horse SerumInvitrogen LT16050-130
Hybridization OvenVWR230301V
Medium 199 1XCorning cellgro10-060-CV
Paraformaldehyde 16% Solution EM gradeElectron Microscopy Sciences15710
Pen/StrepMP-BiomedICN1670049
Permanox steriele kamerschuifplak met dekselThermo-Scientific177429
Phosphate-Buffered Saline, 1XCorning cellgro21-040-CV
PrimeTime Mini qPCR AssayIntegrated DNA TechnologiesActa2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4376600
SuperScript VILO MastermixInvitrogen LT11755050
[header]
Tie2-GFP muizenJackson Laboratories3658
Tissuevinger #5 11 cmDumont14096
TrizolAmbion15596018
α-SMA anti-muis antilichaamSigma-AldrichA2547
VECTASHIELD HardSet Montagemedium met DAPIVector LaboratoriesH-1500

Referenties

  1. Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
  2. Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
  3. Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
  4. Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
  5. Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
  6. Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
  7. Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
  8. Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
  9. Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
  10. Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
  11. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
  12. Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
  13. Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
  14. Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
  15. Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
  16. Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
  17. Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
  18. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van muiskleppendissectie van hartkleppensorteren van endotheelcellenfluorescentie-geactiveerde cellsorteringTie2-GFP-muizenendotheelmarkersCD31-expressievalve interstitiële cellenembryonale klepcellen
Isolatie van Murine Valve endotheelcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.