Methodenartikel

Benutting van microschaal Silicon Cantilevers to Cellular contractiele functie Beoordelen In Vitro

DOI:

10.3791/51866

⸱

3 oktober 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1NanoScience Technology Center, University of Central Florida

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het gebruik van microschaal silicium consoles als buigzaam cultuur oppervlakken voor het meten van de contractiliteit van spiercellen in vitro. Cellular samentrekking cantilever buigen, die kan worden gemeten, geregistreerd en omgezet in uitlezingen van kracht, die een non-invasieve en schaalbaar systeem voor het meten contractiele functie in vitro.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van meer voorspellende en biologisch relevante in vitro testen is gebaseerd op de vooruitgang van de veelzijdige celkweek systemen die de functionele beoordeling van de gezaaide cellen te vergemakkelijken. Daartoe microschaal cantilever technologie biedt een platform waarmee de contractiele functie van verschillende celtypen, waaronder skelet, hart en gladde spiercellen meet, door beoordeling van de contractie geïnduceerd substraat buigen. Toepassing van gemultiplexte cantilever arrays verschaft de middelen matige tot hoge doorvoer protocollen voor het beoordelen van geneesmiddel-effectiviteit en toxiciteit, ziekte fenotype en progressie, alsmede neuromusculaire en andere cel-cel interacties te ontwikkelen. Het manuscript geeft de informatie voor het vervaardigen betrouwbare cantilever arrays hiervoor en de vereiste om succesvol kweek cellen op die oppervlakken methoden. Verdere beschrijving wordt geleverd over de stappen die nodig zijn om functionele anal voerenlyse van contractiele celtypen gehandhaafd op dergelijke arrays met behulp van een nieuwe laser-en foto-detector systeem. De representatieve gegevens wat de nauwkeurigheid en reproduceerbare aard van de analyse van contractiele functie mogelijk met dit systeem, alsmede de diverse studies waaraan dergelijke technologie kunnen worden toegepast. Succesvolle brede invoering van dit systeem zou kunnen bieden onderzoekers de middelen om snelle, goedkope functionele studies uitgevoerd in vitro, wat leidt tot nauwkeurigere voorspellingen weefsel prestaties, ontwikkeling ziekte en de reactie op nieuwe therapeutische behandeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in vitro kweek van spiercellen van zowel menselijke als knaagdierbronnen is al decennia mogelijk1,2. Echter, hoewel standaard dekglaspreparaten nuttig zijn voor biochemische beoordeling, vergemakkelijken ze niet de analyse van de primaire functionele output van de cel (contractiliteit), en zijn daarom enigszins beperkt in waarde als middel om cellulaire rijping en prestaties te beoordelen. Om de hoeveelheid verkrijgbare gegevens uit dergelijke in vitro culturen te maximaliseren, is het noodzakelijk om de ontwikkeling van systemen te bevorderen die in staat zijn dergelijke cellen te huisvesten in configuraties die de real-time beoordeling van hun functionele prestaties mogelijk maken. De oprichting van een veelvoud aan driedimensionale spiermodellen heeft enige vooruitgang geboekt in het voldoen aan deze behoefte, en dergelijke systemen zijn in een aantal publicaties gebruikt als middel om de contractiele capaciteit van gekweekte spiercellen in vitro te beoordelen3-5. Hoewel dergelijke systemen van onschatbare waarde zijn voor weefselmodellering en reconstructiestudies, zijn ze beperkt in hun toepasbaarheid voor studies van enkele celantwoorden. In dergelijke gevallen waar studies van enkele vezels noodzakelijk zijn, blijven complexe en arbeidsintensieve ex vivo methodologieën de enige optie6-10. Verder, de huidige beweging naar de ontwikkeling van complexe, multi-orgaan platforms voor drugontwikkeling en screeningprotocollen vereist de oprichting van systemen die niet-invasief zijn, gemakkelijk schaalbaar zijn en die gemakkelijk integreren met ondersteunende cellen en weefselmodellen11.

Microschaal cantilevers bieden een eenvoudige methode voor het beoordelen van de functionele contractiele capaciteit van enkele cellen/kleine populaties van cellen12,13. De techniek is gebaseerd op gemodificeerde Atomic Force Microscopy (AFM) technologie14, en gebruikt een laser en fotodetectorsysteem om microschaal cantilever uitwijking te meten als reactie op de contractiele activiteit van gekweekte myotubes. Gemodificeerde Stoney's vergelijkingen worden vervolgens gebruikt om stress in de myotube te berekenen, en de kracht uitgeoefend door de myotube om de waargenomen substraatuitwijking te genereren15. Er is een scanprogramma geschreven dat gelijktijdige beoordeling van multiplexed cantilever arrays mogelijk maakt, wat potentiële matige tot hoge doorvoer toepassingen biedt voor geneesmiddeltoxiciteit/effectiviteitsstudies15,16. Dergelijke technologie kan onschatbaar blijken in de ontwikkeling van functionele, pre-klinische assays voor het voorspellen van geneesmiddeleffectiviteit in vivo. Bovendien belemmert de fabricage van cantilever chips in silicium de post-analyse verwerking van cellen voor standaard biomoleculaire assays zoals immunokleuring, western blotting en PCR niet.

Dit manuscript geeft gedetailleerde instructies over de fabricage en voorbereiding van microschaal silicium cantilevers, de hardware en software setup, en de bedieningsrichtlijnen voor het beoordelen van de functionaliteit van contractiele cellen die op deze chips zijn gekweekt. Standaard celkweektechnieken kunnen worden geïmplementeerd voor het plateren en onderhouden van cellen op deze oppervlakken, daarom zou elke contractiele celtype waarvoor betrouwbare kweekparameters bestaan, gemakkelijk met dit apparaat moeten kunnen integreren. De relatief eenvoudige 2D kweekparameters die in dit systeem worden gebruikt, maakt de integratie van andere celmodellen of toevoeging van celtypen die kunnen interageren met spier (zoals innerverende neuronen) eenvoudig, waardoor de toepasbaarheid van dit model in de ontwikkeling van complexere functionele in vitro assays en multi-orgaan modellen van zoogdiersystemen aanzienlijk wordt vergroot.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 cantilever Chip Fabrication

Geïllustreerde data van de beschreven vervaardigingsstappen worden voorzien in figuur 1.

  1. Plaats Silicon-On-Insulator (SOI) wafers in een oven en bak op 125 ° C gedurende 20 minuten om ze uitdrogen.
  2. Stort een 1,5 micrometer dikke laag siliciumoxide op het handvat laag van de vochtarme SOI wafer met een Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) tool.
  3. Plaats de wafer op de spin coater boorkop met de inrichting laag naar boven. Zorg wafer gecentreerd afzien 2 ml P20 primer op het midden van de wafel, en centrifugeren op 3000 rpm gedurende 60 seconden bij een versnelling van 1000 rpm / sec. P20 primer bevordert hechting van fotolak de inrichting laag.
  4. Terwijl de wafer nog op de spin coater boorkop afzien 2 ml S1818 fotolak op het midden van de wafel, en centrifugeren op 3000 rpm gedurende 60 seconden bij een versnelling van 1000 rpm / sec tot obtain een 1,5 urn dikke laag fotoresist.
  5. Plaats de wafer op een hete plaat en uitvoeren van een zachte bakken bij 115 ° C gedurende 1 minuut.
  6. Voer een harde contactlenzen UV blootstelling door fotolithografie contact mask aligner om het patroon brengen van de cantilever masker om de fotoresist op het apparaat laag. Bereken de belichtingstijd gebaseerd op de energetische waarde van 125 mJ / cm 2 voor S1818 fotolak.
  7. Ontwikkel de fotoresist door onderdompeling van de wafer in een 726 MIF fotoresist ontwikkelaar voor 1 min onder zachtjes schudden van de wafer heen en weer.
  8. Spoel de wafer met-de geïoniseerd (DI) water en droog het, bij voorkeur met behulp van een spin spoelen droger (SRD) tool.
  9. Verwijder de fotolak van de rand van de wafel (tot 5 mm van de rand) met een wattenstaafje aceton.
  10. Laad de wafer in een Deep Reactive Ion Etch (DRIE) tool, met de fotolak kant naar boven, en uitvoeren van een recept om het patroon siliciumlaag etsen door de device laag. De ingegraven oxidelaag fungeert als etsstop, dus moet een ets met 50% tot 100% meer cycli dan verwacht noodzakelijk om een ​​volledige etch waarborgen.
  11. Plaats de wafer in een warm bad fotoresist oplossing gedurende 20 min aan de fotolak te strippen. Breng de wafer een quick-dump-rinser (QDR) van de wafer met DI-water afspoelen. Naar aanleiding van de fotolak strip, laadt de wafer in een SRD hulpmiddel om te spoelen en drogen van de wafel. Inspecteer de wafer onder een microscoop om te zorgen voor de cantilever patroon weergegeven zoals verwacht.
  12. Stort een 1 micrometer dikke laag-un gedopeerd silicium oxide op het apparaat laag van de wafel met een PECVD tool. Deze oxidelaag werkt als een beschermende laag voor de cantilevers in verdere bewerkingsstappen.
  13. Plaats de wafer op de spin coater boorkop met de handgreep laag naar boven begint verwerking van de achterzijde van de wafel. Zorg wafer gecentreerd afzien 2 ml P20 primer op het midden van de wafel, en centrifugeren op 3000 tpmgedurende 60 sec bij een versnelling van 1000 rpm / sec.
  14. Terwijl de wafer nog op de spin coater boorkop afzien 2 ml SPR220-4.5 fotoresist op het midden van de wafel, en centrifugeren bij 2000 rpm gedurende 45 seconden bij een versnelling van 1000 rpm / sec tot een 6,5 urn dikke laag te vinden fotolak.
  15. Plaats de wafer op een afstand hete plaat om zacht bakken uitgevoerd bij 115 ° C gedurende 2 minuten.
  16. Met behulp van een fotolithografie contact aligner staat voor / achter uitlijning Zet de achterzijde raam masker de voorzijde cantilever patroon en een harde contactlenzen UV belichting uitgevoerd om het patroon van het zitvlak raam masker overdragen aan de fotolak op het handvat laag. Gebruik een belichtingstijd berekend op basis van de blootstelling energetische waarde van 480 mJ / cm 2 voor SPR220-4.5 fotolak.
  17. Na blootstelling aan UV, laat de wafers blijven in een donkere ruimte voor 30 min voor de volgende bewerkingsstap.
  18. Ontwikkelen van de fotolak door onderdompeling van de wafer ineen 726 MIF fotoresist ontwikkelaar voor 2 minuten onder voorzichtig schudden de wafer heen en weer.
  19. Spoel de wafer met-de geïoniseerd (DI) water en droog het, bij voorkeur met behulp van een spin spoelen droger (SRD) tool.
  20. Plaats de wafers in een oven bij 90 ° C gedurende 12 uur.
  21. Ets silicium oxide laag op de achterzijde van de wafel met een RIE-systeem met gefluoreerde gassen en een recept voor etsen oxide. De gevormde oxide op de achterkant van de wafel werkt als een etsmasker voor verdere verwerking. Inspecteer de wafers onder een microscoop dat de siliciumoxide in de blootgestelde venster volledig geëtst.
  22. Verwijder het fotoresist aan de rand van de wafel (tot 5 mm van de rand) en een schone kamer wattenstaafje gedrenkt in aceton.
  23. Laad de wafer in een DRIE tool en uitvoeren van een recept om de gevormde handgreep laag te etsen tot een diepte van 500 pm met de ingegraven oxidelaag functioneren als een etsstop. Splits deze ets in meerdere runs van overmatige verhitting van de voorkoming vanwafer, die onverenigbaar etsen van het silicium veroorzaakt. Deze ets stap verwijdert volledig het silicium onder de uitkragingen.
  24. Voer een natte etsstap met 25% verdund HF etsmiddel, de ingegraven oxidelaag onder de uitkragingen en de beschermende oxidelaag bovenop de cantilevers strip.
    Opmerking: Deze stap brengt het onderoppervlak van de silicium cantilevers en opent ook een venster eronder om een ​​toegang tot de cantilever met de laser sonde verschaffen.
  25. Spoel de wafer met behulp van een reeks DI-water baden en voorzichtig droog met stikstof. Omdat de uitkragingen alleen worden ondersteund bij hun bases, niet krachtig sprays DI water of inert gas te gebruiken direct op de uitkragingen.
  26. Klieven individuele chips uit de wafel langs de lijnen die splitsen bij het handvat laag etsstap.

2 Celkweek

  1. Bereid 13F dekglaasjes volgens eerder gepubliceerde werkwijzen 17.
    OPMERKING: Als 13F coverslips niet beschikbaar zijn, kan elk hydrofoob oppervlak met een contact hoek boven 95 ° worden gebruikt.
  2. Steriliseren cantilever chips en 13F dekglaasjes in een 70% ethanol oplossing en laat aan de lucht drogen in een zuurkast.
  3. Plaats individuele cantilever chips bovenop 13F dekglaasjes in een standaard 12 wells plaat.
  4. Coat de uitkragingen met het biopolymeer of oppervlaktemodificatie geoptimaliseerd voor het celtype wordt gebruikt volgens de standaard celkweek protocollen.
  5. Resuspendeer de cellen in hun specifieke groeimedium tot de gewenste concentratie.
    OPMERKING: Dit protocol zal resulteren in een substantieel aantal cellen vallen door de cantilever raam en niet vast te houden aan de gewenste cantilever oppervlak. Celbereidingen moet daarom 3-4x worden meer geconcentreerd dan voor standaard dekglaasje voorbereidingen. Bijvoorbeeld wordt zaaien rat skeletspier satellietcellen gewoonlijk uitgevoerd met een zaaidichtheid van 500 tot 700 cellen / mm square 15,16, En worden met cantilever substraten bij 2000 cellen / vierkante mm. Optimalisatie experimenten dient nieuwe cel bronnen worden naar een geschikte zaaidichtheid nagegaan.
  6. Pipetteer 200 ul van de celsuspensie op de cantilever chipoppervlak, waardoor de bel drager omvat de cantilever ramen volledig. Als het medium transporteert door het raam en vormt geen statische zeepbel op de top van de uitkragingen vervang de 13F dekglaasje en probeer het nog eens plating.
  7. Breng de plaat met de chips een incubator en laat de cellen hechten gedurende tenminste 1 uur (bij voorkeur 2-3 uur).
  8. Na deze periode plating, steriel pincet om de chip te brengen naar een schone goed, zonder 13F dekglaasje en bijvullen cultuur 1 ml groeimedium.
  9. Zet de plaat in de incubator.
  10. Aanvullen cellen volgens hun standaard protocol voor in vitro onderhoud op dekglaasjes. Voor skeletale spiercellen,een schakelaar drager samenstelling myotube induceren wanneer cellen confluent nodig.

3 Installatie van hardware en software voor cantilever doorbuiging Analyse

  1. Plaats een verwarmde kweekschaal in het stadium van een rechtopstaande elektrofysiologie microscoop.
  2. Voeg 3 ml van het medium voeden de cellen zijn op dit moment in (+ 10 mM HEPES) opgeschort tot het verwarmde microscoop podium.
  3. Monteer roestvrijstalen elektroden aan de binnenzijde van de verwarmde kweekschaal met een scheidingsafstand van 15 mm en sluit ze met een pulsgenerator, kan produceren gebied stimulatiepulsen van variërende intensiteit, frequentie en golfvorm, zodat het systeem veldstimulatie produceren van cellen, indien nodig.
  4. Schroef een Helium-Neon laser, gemonteerd op XY translationeel podia aan de onderzijde van de microscoop tafel en afstellen, zodat de laserbundel wordt via de bodem van de verwarmde kweekschaal bij een 30 ° hoek relative op het vlak van de cantilever.
  5. Schroef een kwadrant fotodetector module, gemonteerd op XY translationeel podia aan de onderzijde van de microscoop podium en pas de positie, zodat de gereflecteerde laserbundel landt in het midden van de 4 kwadranten. Figuur 2 geeft een overzicht van de opstelling hardware noodzakelijk zijn voor de uitvoering van het protocol beschreven.
  6. Schrijf een software programma om de lineaire actuatoren die scannen via de uitkragingen beheersen. Voeg het softwareprogramma met verwijzing naar het stroomschema verschaft in Figuur 3. De grafische interface geprogrammeerd voor gebruik met dit systeem wordt verschaft in Figuur 4.

4 Opname cantilever doorbuiging Gegevens

  1. Zet de cantilever analyse hardware en bijbehorende software.
  2. Plaats de verwarmde podium thermistor in het medium en wachten tot het te lezen 37 ° C.
  3. Steek de cantilever chip in het podium met de cantilevers georiënteerd naar de rechterkant van het podium.
  4. Zet de microscoop lichtbron.
  5. Focus de microscoop om de randen van de cantilevers in beeld brengen en gebruiken de laser / fotodetector control software om de laserstraal positioneren op het punt van cantilever 1 Opmerking: Uitgaande van de cantilevers georiënteerd rechts van het podium, cantilever 1 is degene gepositioneerd in de linkerbovenhoek van de array en nummers lopen tot 16 in de linkeronderhoek. Cantilever 17 is in de rechter positie en loopt tot en met 32 in de rechterbenedenhoek (figuur 5A).
  6. Druk op "play" van de opnamesoftware.
  7. Plaats de fotodetector zodat het signaal leest "0" in zowel x en y frames door aanpassing van de stappenmotoren regelen van de fotodetector.
  8. Set cantilever 1 positie in de laser / fotodetector control software (figuur 4).
  9. Verplaats de laser om het topje van cantilever 16, herhaal stap 4.7., En stel cantileveh 16 positie in de laser / fotodetector besturingssoftware.
  10. Verplaats de laser aan de punt van cantilever 32 Herhaal stap 4.7. En stel cantilever 32 positie in de laser / fotodetector control software.
  11. Verplaats de laser aan de punt van cantilever 17 Herhaal stap 4.7. En stel cantilever 17 positie in de laser / fotodetector control software.
  12. Schakel de microscoop lichtbron en de overhead licht in het laboratorium.
  13. Druk op "opnemen" van de opnamesoftware.
  14. Stel de pulsgenerator hardware tot 40 msec, 5 V pulsen met een frequentie van 1 Hz, en zet het apparaat aan.
    OPMERKING: Optioneel dienst geoptimaliseerd stimulatie protocollen voor specifieke cel bronnen op dit punt, de aangegeven instellingen zijn richtlijnen op basis van verzamelde gegevens met menselijke en knaagdieren cel bronnen 12,13,15,16.
  15. Met behulp van de laser / fotodetector besturingssoftware, stelt de hardware te scannen via de 32 cantilever array, stoppen voor 5 sec bij elkaar ope.
  16. Wanneer de scan van de 32 uitkragingen is voltooid, schakelt u de stimulator, dan stopt de opname-software en brengen het databestand.
  17. Onderzoeken de opgenomen sporen van elke cantilever voor bewijs van contractiele activiteit. Noteer elke cantilever met positieve reacties. Samentrekking wordt gedefinieerd als een piek als de afbuiging ten minste 0,1 V boven de basislijn.
  18. Verwijder alle niet-reagerende uitkragingen van de scan-protocol op de laser / fotodetector besturingssoftware.
  19. De actieve cantilevers kan vervolgens worden gescand zonder stimulatie om een ​​lezing van spontane contractiele activiteit van de cel te krijgen.
  20. Run scans met of zonder brede gebied elektrische stimulering, na toevoeging van een therapeutische verbinding aan het medium om het effect zien van de functionele output van de gekweekte cellen.
  21. Voeren vermoeidheid evaluaties door het elektrisch stimuleren van de cellen voor langere tijd en scannen niveaus van contr actility om te meten hoe lang het duurt voor de piek van kracht te laten vallen onder een bepaalde drempel.
  22. In experimenten waarbij motorneuronen worden gehandhaafd co-kweek met spier-, meet neuromusculaire junctie vorming door behandeling van motoneuronen-myotube cantilever co-kweken met een neuronaal stimulerend middel (zoals glutamaat) of synaptic inhibitor (bijvoorbeeld D-tubocurarine) en scannen voor respectievelijk 16 stijgt en daalt in spontane activiteit.
  23. Voer specifieke scans zoals gedicteerd door de behoeften van de beoogde experimenten.

5 Analyse van de cantilever doorbuiging gegevens

  1. Gebruik gemodificeerde Stoney vergelijkingen 15 (hieronder) voor ruwe cantilever doorbuiging data (in Volt) omzetten in een indicatie van stress in de cellaag of myotube (in Pascal) en een directe meting van cellulaire contractiekracht (in nano-Newton):
    ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Vergelijking 1
    figure-protocol-1 Vergelijking 2
  2. Wanneer δ = cantilever tip doorbuiging en spanning door de myotube, σ c = spanning geproduceerd door de myotube, uitgaande van een uniform dikke film de volle breedte van de cantilever, C detector = het systeemspecifieke coëfficiënt voor spanning laserpositie op de foto -detector, θ = de hoek van de laser en de detector ten opzichte van het vlak van de cantilever, E Si = de elastische modulus van silicium Si t = de dikte van de cantilever, t f = myotube dikte v Si = verhouding van vergif silicium, L = cantilever lengte, P = weglengte van laser uit cantilever tip om detector, en w Si = de breedte van de cantilever. Een schematische uitleg van de begrippen die in deze vergelijkingen wordt gegeven in figuur 6.
  3. Uitgaande van de myotube wordt een gelijkmatige film, de kracht in de myotube gelijk aan de kracht in de film, waardoor Vergelijking 3, door verevening van het berekenen van kracht van stress en de veronderstelde cel dwarsdoorsnede die werd gebruikt voor de toepassing van Stoney's vergelijking.
    figure-protocol-2 Vergelijking 3
  4. Volgende functionele dataverzameling, fix cantilever chips voor immunocytochemische analyse of gebruik maken van cellen voor eiwit of DNA-analyse met behulp van standaard technieken.
  5. Optioneel kan de terugkeer van de cellen naar de couveuse in plaats van de voorbereiding voor moleculaire analyse met het oog op de functionele prestaties herwaarderen op een later tijdstip-punt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle kweek van contractiele cellen op cantilevers is een relatief eenvoudige procedure, gebruik standaard celkweek technieken (figuur 5). Het percentage van de uitkragingen ondersteunende aanbestedende cellen zullen variëren afhankelijk van het type cel wordt onderzocht en specifieke cultuur toegepaste techniek. Primaire embryonale cellen afkomstig van ratten achterpoten werd contractiele activiteit waargenomen op 12% van de cantilevers onderzocht (n = 4). Analyse van de contractiele functie met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kritische stappen in de analyse microschaal cantilevers op tekenen van cellulaire contractie zijn de plaatsing van de cantilever chip binnen de microscoop fase en de daaropvolgende uitlijning van de laser en de fotodetector met de punt van de hoek cantilevers in de array. Als dit niet correct gebeurt, dan zal de software in staat om de posities van de resterende cantilevers extrapoleren in de array, kan leiden tot ophoping van valse negatieven tijdens gegevensverzameling. Exploitanten moeten erop toezien dat de canti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door het National Institute of Health subsidie ​​nummers R01NS050452 en R01EB009429. Fabricage van de cantilever chips is extern uitgevoerd door medewerkers van de nanofabricage faciliteit gelegen aan de Cornell University. Alle in de cantilever fabricageproces apparatuur werd in deze faciliteit. Speciale dank aan Mandy Esch en Jean-Matthieu Prot voor hun hulp met cantilever micro-fabricage. Video animatie van cantilever functionaliteit werd gegenereerd door Charles Hughes, Alex Zelenin en Eric Imperiale van de Synthetic Reality Lab van UCF.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal mediumLife Technologies21103-049
B27 (50x)Life Technologies175040441x
Glutamax (100x)Life Technologies350500611x
G5 supplementLife Technologies17503-0121x
Glial-Derived Neurotrophic FactorCell sciencesCRG400B20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic FactorCell sciencesCRB600B20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic FactorCell sciencesCRC400A40 ng/ml
Neurotrophin-3Cell sciencesCRN500B20 ng/ml
Neurotrophin-4Cell sciencesCRN501B20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth FactorLife Technologies13241-013 25 ng/ml
Cardiotrophin-1Cell sciencesCRC700B20 ng/ml
Heparin SulphateSigmaD9809 100 ng/ml
Leukemia Inhibitory FactorSigmaL5158 20 ng/ml
VitronectinSigmaV0132100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4Brain Bits LLCNB4-500
Equipment
Class 2 red diode laserNewport
Photo-detectorNoah Industries
Model 2100 Pulse stimulatorA-M systems
Multiclamp 700B DigitizerAxon Instruments
Patch clamp microscope and stageOlympus
Delta T4 culture dish controllerBioptechs
Axoscope softwareMolecular Devices
LabVIEW softwareNational Instruments
37 oC, 5% CO2 incubatorNAPCO
Class 2 microbiological flow hoodLabconco
Pipettes and tipsEppendorf

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
  2. Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
  3. Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
  4. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
  5. Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
  6. Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
  7. Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
  8. Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
  9. Edman, K. A. Contractile performance of striated muscle. Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).
  10. Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
  11. Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
  12. Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
  13. Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
  14. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  15. Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108(2013).
  16. Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
  17. Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
  18. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
  19. Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
  20. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
  21. Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
  22. Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
  23. Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
  24. Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
  25. Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
  26. Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
  27. Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
  28. Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643(2010).
  29. Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
  30. Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
  31. Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Spiervezelcontractielaserfotodetectorsysteemcantilever deflectiemetingmodificatie van elektrofysiologische microscoophigh throughput drug screeninganalyse van de neuromusculaire overgangskeletspier myotubenberekening van de krachtmeting

Gerelateerde artikelen