Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

16.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

29 januari 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Samenvatting

Hoge-resolutie analyse van de morfologie en functie van zoogdierneuronen vereist vaak de genotypering van individuele dieren, gevolgd door de analyse van primaire kweken van neuronen. We beschrijven een reeks procedures voor: het labelen van pasgeboren muizen worden gegenotypeerd, snelle genotypering, en tot oprichting van een lage dichtheid culturen van neuronen in de hersenen van deze muizen. Individuele muizen worden gelabeld door tatoeëren, die zorgt voor langdurige identificatie blijvend in de volwassenheid. Genotypering van het beschreven protocol is snel en efficiënt en maakt geautomatiseerde extractie van nucleïnezuur goede betrouwbaarheid. Dit is nuttig in omstandigheden waarin voldoende tijd conventionele genotypering niet beschikbaar, bijvoorbeeld in muizen die lijden neonatale sterfte. Primaire neuronale culturen worden gegenereerd bij een lage dichtheid, die beeldvorming experimenten mogelijk maakt bij een hoge ruimtelijke resolutie. Deze cultuur methode vereist de voorbereiding van gliale feeder lagen voorafgaand aan neuronale plating. De pROTOCOL wordt toegepast in zijn geheel een muismodel van de bewegingsstoornis DYT1 dystonie (AE-Torsina knock-in muizen) en neuronale culturen worden bereid uit de hippocampus, cerebrale cortex en striatum van deze muizen. Dit protocol kan worden toegepast op muizen met andere genetische mutaties, alsmede dieren van andere soorten. Verder kunnen de afzonderlijke componenten van het protocol worden gebruikt voor geïsoleerde deelprojecten. Zo zal dit protocol hebben brede toepassingen, niet alleen in de neurowetenschappen, maar ook in andere gebieden van de biologische en medische wetenschappen.

Inleiding

Knaagdiermodellen van genetische ziekten nuttig bij het vaststellen van de normale fysiologische functies van eiwitten en nucleïnezuren, en de pathofysiologische gevolgen van defecten in deze bewezen. Voorbeelden omvatten muizen deficiënt voor eiwitten die betrokken zijn bij essentiële cellulaire functies, evenals muismodellen van aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer. Toch kunnen bepaalde genetische manipulaties leiden tot neonatale sterfte kort of een paar dagen na de geboorte. In deze gevallen primaire celculturen een belangrijk instrument omdat levende cellen kunnen worden verkregen uit de embryonale of neonatale pups voor sterfte kunnen zij gedurende ten minste enkele weken in vitro, en gedurende deze tijd vroege neuronale ontwikkeling kan worden gevolgd door biochemische, functionele en morfologische experimenten. Voor de primaire kweken, kan het voordelig zijn de neuronen bij lage dichtheid plaat; dit maakt het mogelijk de individuele cellichamen, dendrieten, axonale assen en zenuw beëindiging visualiserennals bij hoge ruimtelijke resolutie. De overleving en differentiatie van neuronen bij lage dichtheid vereist gewoonlijk dat ze uitgeplaat op een gliale feeder layer, samen gekweekt met gliale cellen in afwezigheid van fysiek contact met hen, of gekweekt in medium geconditioneerd door glia 1.

De oprichting van lage dichtheid neuronale culturen gliale feeder lagen kan afhankelijk snelle en betrouwbare genotypering vooraf zijn - binnen een paar uur in tegenstelling tot een paar dagen. Snelheid is vooral belangrijk wanneer de neuronale genotype moet worden aangepast aan die van een gliale feeder layer vooraf voorbereid. Als een praktisch voorbeeld, kan het nodig zijn om te beslissen welke pups waarvan genotype voor gebruik in het genereren culturen, de efficiëntie van een experiment optimaliseren.

Hier laten we zien het werken protocol dat is gebruikt voor een snelle, eenvoudige en betrouwbare muis genotypering in eerdere publicaties 2-6. Muis staarten eneen commercieel verkrijgbare kit gebruikt. Dit protocol omvat één fase extractie van nucleïnezuren uit het weefsel, en vereist noch een nucleïnezuur zuiveringsstap noch het gebruik van een buffer beëindigd ("stop solution). De betrouwbaarheid van deze genotyperingsmethode illustreert waarin de resultaten van een reeks proeven bij verschillen wordt geïntroduceerd ten opzichte van het uitgangsbedrag van de specimens, de leeftijd van de dieren en de lengte van de PCR amplicons. Deze kit biedt de voordelen van geautomatiseerde extractie en betrouwbaarheid.

Omwille van zijn uitgebreid, wordt het gebruik van tatoeage voor identificatie van het genotype muizen lange termijn eveneens aangetoond. Tatoeage wordt bereikt door tatoeage inkt naar de dermis van de huid (onder de epidermis) 7. Een werkwijze wordt beschreven voor het tatoeëren de voetzolen van pasgeboren of 1 dag oude muizen, hoewel tatoeages kunnen worden toegepast op andere delen van het lichaam, zoals staarten en tenen, en Animals van alle leeftijden. Bovendien zullen procedures worden aangetoond plateren en kweken muis neuronen bij een lage dichtheid, gebaseerd op geoptimaliseerde bereiding van verschillende gliale feeder lagen 2,8.

We maken gebruik van een genetische muismodel van de erfelijke neurologische aandoening DYT1 dystonie - een autosomaal-dominante stroming aandoening veroorzaakt door een mutatie in het gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Het gecodeerde eiwit, Torsina, behoort tot de "ATPasen geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten" (AAA +) familie van eiwitten, waarvan de leden doorgaans uitgevoerd chaperone-achtige functies, assisteren in: eiwitontvouwende, eiwit-complex demontage, membraantransport en vesikel fusie 10-13. De mutatie leidt tot een in-frame deletie van een codon voor glutaminezuur, en kan leiden tot manifestatie van "early-onset algemene geïsoleerd dystonie '14,15. De padophysiological mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze aandoening blijven slecht begrepen. In een knock-in muismodel, de mutant allel is Tor1a tm2Wtd, hierna genoemd als Tor1a AE. Heterozygote AE-Torsina knock-in muizen zijn levensvatbaar en genetisch bootsen menselijke patiënten met DYT1 dystonie, terwijl homozygote knock-in muizen na de geboorte sterven 16,17, met de latency tot postnatale dood beïnvloed door genetische achtergrond 18. De vroege dood van homozygote knock-in muizen noodzakelijk dat zowel de genotypering van dieren en de instelling van neuronale kweken snel voltooid. Als een ander voorbeeld van genotypering, Tfap2a (transcriptiefactor AP-2α activerende enhancer bindend eiwit 2α) gebruikt. De proteïne gecodeerd door dit gen is belangrijk bij het ​​reguleren meerdere cellulaire processen, zoals proliferatie, differentiatie, overleving en apoptose 19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures uitgevoerd in dit onderzoek werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa.

1. Langdurig Identificatie van Muizen met behulp Tatoeëren de voetzolen

  1. Immobiliseren een poot met de poot pad (voetzool) tegenover de experimentator. Houd de poot met de duim en de wijsvinger. Wees voorzichtig de poot niet bekneld raken.
    OPMERKING: Stabiele immobilisatie is belangrijk dat de tatoeage pigment wordt in de dermis van de poot pad, dus permanent 7.
  2. Zwabberen de poot pad met 70% ethanol op een gaasje spons of doekje.
  3. Gelden de huid olie tot een wattenstaafje, en druk de tip tegen het oppervlak van de poot pad meerdere malen. Gebruik slechts een kleine hoeveelheid huidolie; wanneer aanwezig in grote hoeveelheden, zal voorkomen dat de tatoeagepigment de huid bereikt.
  4. Dompel de uiteinden van de tattoo naalden in de tatoeage inkt net voorafgaandte tatoeëren. Gebruik schone, aseptische en scherpe tatoeage naalden, om de pijn en de mogelijkheid van infectie te verminderen en ook om de tatoeage te verhogen.
  5. Terwijl de poot pad oppervlak is bedekt met de huid olie, drukt u op de tattoo naald tips verticaal en licht tegen de huid in het midden van de poot pad, en spuit de inkt meerdere keren. Zie tabel van Materialen / Apparatuur voor informatie over elektrische tatoeëren systeem.
  6. Spray 70% ethanol op een gaas spons, druk hem voorzichtig tegen de poot aan extra tatoeage pigment te verwijderen op het huidoppervlak en inspecteren van de kwaliteit van de tattoo. Controleer of het midden van de poot pad heeft een donkere, ronde plek die afwijkt van de normale pigmentatie van de huid. Als de tatoeage is niet donker of groot genoeg voor gemakkelijk bekijken, herhaalt u de stappen voor het tatoeëren.

2. Genotypering Pasgeboren Muizen Met behulp van een Fast PCR Genotyping Kit

  1. Desinfecteren het distale uiteinde van een muis staart met 70% ethanol, gesneden 5 mm of minder van de staarttip en overgebracht naar een buis van een 8-buis strip van de soort gebruikt voor PCR. Gebruik een ongebruikte scheermesje voor elke pup om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen. Alternatief, gebruik een schaar, maar in dit geval, voorzichtig en grondig verwijderen restmateriaal op de bladen met 70% ethanol. Controleer voor bloeden. Als bloeden optreedt, gelden druk om de cut deel van de staart met een gaasje spons tot bloeden is gestopt.
  2. Voeg 200 ul van DNA extractie-oplossing aan elke PCR buis die een monster. Zie tabel van Materialen / Apparatuur voor de samenstelling en informatie over de kit.
  3. Plaats de buis contactdoos een PCR thermal cycler en start de DNA extractie met behulp van het volgende programma: 1 cyclus bij 55 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 min, en bewaren bij 4 ° C.
    Opmerking: Dit is dezelfde PCR thermische cycler die later wordt gebruikt voor PCR.
  4. Na de DNA-extractie is voltooid, verwijdert u de buis strip uit het PCR-apparaat eennd omkeren 5 keer.
  5. Overdracht 4 pl van de oplossing (DNA-extract) van elk monster aan een niet-gebruikte buis van een 8-buis strip, en meng met: 10 ul van 2X PCR Ready Mix II, 2 pl gemengde vooruit en achteruit primers (aanbevolen bij 0,5 uM zie Tabel Materiaal / Apparatuur voor sequenties), en 4 pl nuclease-vrij H2O voor elk specimen. Spin in het kort (bijvoorbeeld, 3 sec) met behulp van een table-top centrifuge. Houd de buizen op ijs te allen tijde behalve het hanteren.
  6. Voeren thermische fietsen. Zien Tafel van Materialen / Apparatuur voor de thermische programma.
  7. Detecteer geamplificeerde DNA-producten. Laad de totale reactieoplossing uit de PCR (20 ul) direct in een putje van een agarosegel. Laad het molecuulgewicht merkers in een aparte goed. Toepassing van een elektrisch veld.
  8. Verwerven fluorescentie beelden van de banden onder ultraviolet licht.

3. Primaire Cultuur van de hersenen van muizen Neurons op Gliale Feeder Layer

OPMERKING: De procedures voor de hersenen dissectie en celdissociatie (3.1) zijn gemeenschappelijk voor alle verdere procedures. De procedures voor muizen glialculturen (3.2), ratten gliale culturen (3.3) en muis neuronale kweken (3,4) worden afzonderlijk daarna beschreven.

  1. Brain Dissection en Cellulaire Dissocaiation
    1. Offeren een muis of rat pup door onthoofding, het snel verwijderen van de hersenen, en plaats deze in Hanks 'oplossing (zie tabel 1 voor de samenstelling) + 20% foetaal serum (FBS) in een schaal van 35 mm (op ijs bewaard).
    2. Snijd de hersenen door middel van de middellijn in twee hersenhelften. Verwijder het gebied van belang (bijvoorbeeld cerebrale cortex, striatum en hippocampus) van elke hersenhelft. Verwijder de hersenvliezen en grote bloedvaten van het oppervlak. Snijd de hersenen regio in 4-10 dunne plakjes met een chirurgisch mes.
    3. Spoel de plakjes hersenen in een 15 ml centrifugebuis, eens with Hanks 'oplossing + 20% FBS, vervolgens 3 keer met Hanks' oplossing (dus zonder serum) (alle bij 4 ° C). Spoelen, voeg 5-10 ml oplossing, laat de hersenplakken bezinken op de bodem van de buis zuigen de oplossing van boven, en voeg een verse oplossing. Beëindig de spoelen procedure door opzuigen van de oplossing.
    4. Filtreer 2 ml trypsine bevattende digestie oplossing (zie tabel 1 voor samenstelling) met een 3 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct in de buis met de hersencoupes. Laat de trypsine verlopen gedurende 13 min bij kamertemperatuur.
    5. Neutraliseer de trypsine oplossing eerst door afzuigen meeste en vervolgens door toevoeging van 7-10 ml Hanks 'oplossing + 20% FBS (4 ° C).
    6. Spoel de hersenen plakjes, tweemaal met Hank's oplossing + 20% FBS, en vervolgens driemaal met Hanks 'oplossing (zonder serum) (alle bij 4 ° C). Beëindig de spoelen procedure door het opzuigen van de solution.
    7. Filtreer 2 ml van de dissociatie oplossing (zie tabel 1 voor samenstelling) met een 3 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct aan de buis met de hersencoupes.
    8. Mechanisch dissociëren de cellen door zachtjes wrijven 10-20 maal, totdat zichtbare weefselstukken verdwijnen. Gebruik een katoenen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet en voorkomen dat bellen tijdens het aanwrijven.
    9. Wacht 3 min voor kleine stukken om te settelen.
    10. Breng de meerderheid van de oplossing (~ 1.5 ml, waardoor enkele oplossing onderaan) aan een 15 ml centrifugebuis dat 3 ml Hanks 'oplossing + 20% FBS oplossing (4 ° C) bevat, met het katoen aangesloten, brand- gepolijste Pasteur pipet. Laat de oplossing niet overdragen omdat de opname van bezinksel op de bodem resulteert typisch in verslechtering van de cultuur.
    11. Centrifugeer gedurende 13 minuten bij ~ 185 g (~ 1100 rpm) bij 4 ° C.
    12. Zuig het supernatant voorzichtigVoeg 1 ml voorverwarmde plaatmedium (37 ° C) om de pellet en resuspendeer door enige malen waarbij katoen aangesloten, vuur gepolijste Pasteur pipet voorzichtig pipetteren.
      OPMERKING: Drie verschillende types van uitplaatmedia worden gebruikt voor verschillende doeleinden cultuur: plaatmedium-1 van muizen gliacellen, plaatmedium-2 voor muis neuronen en plaatmedium-3 voor ratten neuronen en gliacellen (zie tabel 1 voor samenstellingen) .
    13. Neem 10 pi van de celsuspensie, mengen met 10 gl 0,4% trypan blauwe oplossing en meet de dichtheid van levende cellen, met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.
  2. Muis glialculturen
    1. Was de dekglaasjes te helpen bij het vaststellen gezonde culturen van de muis cellen.
      1. Dompel dekglaasjes (rond, 12 mm diameter) in 70% salpeterzuur in een glazen petrischaal. Beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie en plaats deze op een schudapparaat O / N.
      2. Spoel het glas coverslips in de petrischaal minstens driemaal met gedestilleerd water. Dompel ze in gedestilleerd water. Zet de schaal op een schudapparaat O / N.
      3. Droog de dekglaasjes op een Whatman 150 mm filter papier in de biologische veiligheid kabinet.
      4. Autoclaaf de dekglaasjes.
      5. Plaats de dekglaasjes in 24-well cultuur schotel.
    2. Label en genotype pasgeboren muizen volgens de stappen 1 en 2.
    3. Haal de hersencellen van de muizen pups, volgens stap 3.1.
      LET OP: Het gebruik van de cerebrale cortex is typerend voor de voorbereiding van de muis gliale feeder-laag. Echter, andere hersengebieden, zoals hippocampus en striatum zal werken en na correctie van celdichtheid door verschillende aantallen en opbrengsten van cellen uit verschillende gebieden.
    4. Voeg ~ 4 ml voorverwarmde plaatmedium-1 aan de uiteindelijke celsuspensie (~ 1 ml). Voor voorverwarmen kweekmedia, plaats de oplossing in de incubator (5% CO2 -95% O2, 37 ° C) O / N teHierdoor kan de temperatuur en de pH te stabiliseren.
    5. Breng de celsuspensie om een ​​niet-gecoate T25 kolf, met behulp van de katoen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet. Plaats de kolf in de incubator.
    6. 1 dag in vitro (DIV), spoel de gekweekte cellen in de T25 kolf tweemaal met plaatmedium-1 (4 ° C). Plaats de kolf terug in de incubator. Voer spoelen door opzuigen het medium in de hals is met een Pasteur pipet toevoegen ~ 5 ml vers medium en voorzichtig kantelen van de kolf meerdere keren in een wervelende beweging.
    7. Bij 6-9 DIV, (dat wil zeggen, een dag voor trypsinisatie en plating op dekglaasjes, in stappen 3.2.8-3.2.13), plaats 100 ul van het bekledingsmateriaal met extracellulaire matrix eiwitten (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor opmerkingen over het deklaagmateriaal) op de dekglaasjes in een kweekschaal, en zet de kweekschaal in de incubator.
    8. 7-10 DIV, wanneer de cellen 20-40% samenvloeiing (ruimtelijk continue), trypsinize hen.
      1. Spoel de kolf eenmaal door afzuigen alle vloeistof in de kolf en het toevoegen van ~ 13 ml Hanks 'oplossing (4 ° C), voorzichtig kantelen de kolf meerdere keren in een wervelende beweging en volledig zuig de oplossing.
      2. Voeg 40 ul DNase oplossing (eindconcentratie 750 eenheden / ml) aan 4 ml trypsine-EDTA-oplossing, laat de oplossing door een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct op de cellen in de kolf.
      3. Laat de trypsine verlopen gedurende 13 min bij 37 ° C in de incubator.
      4. Neutraliseer de trypsine-oplossing door toevoeging van 2 ml van 100% FBS (4 ° C) aan de kolf.
      5. Breng de cellen getrypsiniseerd een 15 ml centrifugebuis met een 5- tot 10 ml pipet ~ 4 ml Hanks 'oplossing + 20% FBS (4 ° C), centrifugeer bij ~ 185 g en 4 ° C gedurende 13 min en zuig het supernatant.
    9. Resuspendeer de pellet in 1 ml vooraf Warmed plaatmedium-1.
    10. Meet de dichtheid van de cellen volgens stap 3.1.13.
    11. Zuig het bekledingsmateriaal volledig uit de dekglaasjes en plaat ~ 50 ul van de geresuspendeerde gliale cellen op dekglaasjes.
      OPMERKING: Deze cellen zullen de gliale feeder-laag vast te stellen.
    12. Plaats de cultuur schotel met dekglaasjes in de couveuse.
    13. 20-60 min later, voeg 1 ml voorverwarmde plaatmedium-1 aan elk putje, en zet de schaal terug in de incubator. Opmerking: Als het plateren medium wordt toegevoegd, zal het nuttig zijn om een ​​pipet om druk de omtrek van het dekglaasje (waar geen geplateerd cellen), zodat het dekglaasje niet drijven in het medium.
    14. Op 1 DIV van de gliale feeder layer (dat is op de glazen dekglaasje), het medium vervangen door 1 ml voorverwarmde plaatmedium-1, door opzuigen alle oplossing in een goed en vervolgens vullen met vers medium.
    15. 2-3 DIV van de gliale feeder-laag als de CELls zijn 80-100% confluent, voeg Antimitoticum (10 pl van een mengsel van 5-fluor-2'-deoxyuridine + uridine; eindconcentraties van 81,2 en 204,8 uM, respectievelijk) aan elk putje, DNA replicatie en derhalve remmen onderdrukken gliale-celproliferatie.
    16. Bij 7-9 DIV, wanneer de cellen 90-100% confluent (1-2 uur voor uitplaten neuronen op de gliale feeder layer), vervang het kweekmedium met voorverwarmd plaatmedium-2 (37 ° C).
      OPMERKING: Neuronen worden verzilverd op dezelfde dag, met behulp van stap 3.4.
  3. Rat glialculturen
    1. Coat een T25 kolf met dezelfde coating materiaal.
      Opmerking: Dit is nodig voor latere verwijdering van niet-hechtende cellen in stap 3.3.5.
      1. Voeg 2,0 ml van het bekledingsmateriaal aan de kolf en plaats de kolf in de incubator.
      2. Na 2-3 uur, zuig het bekledingsmateriaal volledig, zodat de bodem van de kolf droog.
    2. Het verkrijgen van de cellenvan het jonge ratten, volgens stap 3.1.
      OPMERKING: De CA3-CA1 regio van de hippocampus wordt gebruikt voor het bereiden van de rat gliale feeder-laag. Echter, andere hersengebieden, zoals de cerebrale cortex en striatum, werkt na correctie voor verschillen in celdichtheid door verschillende aantallen en opbrengsten van cellen uit verschillende gebieden.
    3. Voeg ~ 4 ml voorverwarmde plaatmedium-3 aan de uiteindelijke celsuspensie (~ 1 ml).
    4. Breng de celsuspensie in de gecoate T25 kolf, met behulp van de katoen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet. Plaats de kolf in de incubator (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. 2-3 DIV, wanneer cellen 20-40% confluent, verwijder niet-klevende of zwak hechtende cellen, door het sluiten van het deksel stevig schudden van de kolf krachtig ~ 10 keer, opzuigen van de oplossing en toevoeging van 4-5 ml plating middellange-3 (bij 4 ° C). Herhaal eenmaal deze procedure. Onderzoek de gekweekte cellen in de hele fles vloer (bvmet fasecontrastmicroscoop) bevestigen dat die neuronale (dwz waarvoor de buitenrand van het cellichaam weergegeven fase-heldere weergegeven) geheel verwijderd. Herhaal de procedure zo vaak als nodig is om deze cellen te verwijderen, en dan terug de kolf naar de incubator.
      OPMERKING: De kracht en het totale aantal "shakes" noodzakelijk kunnen verschillen tussen individuele onderzoekers. Het belangrijkste is niet om het totaal aantal shakes te houden aan een bepaald aantal, maar om te bevestigen dat neuron-achtige cellen worden geëlimineerd.
    6. 6-8 DIV, wanneer cellen 90-100% confluent, passage de gliacellen door hen trypsinizing als in stap 3.2.8.
    7. Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C), voeg 10 ml plaatmedium-3 (4 ° C) en breng de cellen getrypsiniseerd een ongecoate T75 kolf en kweken ervan in de incubator.
      OPMERKING: Rat gliacellen zal twee keer worden gepasseerd; daarentegen de muis gliacellen are gepasseerd eenmaal omdat ze ongezond na meerdere passages. Rat gliale cellen worden doorgekweekt in T75 kolven die niet zijn bekleed met een bekledingsmateriaal. De coating geeft rat gliacellen te snel groeien en leveren vele haarcellen (vermeende ependymale cellen), waarbij de neuronale kweekomstandigheid later zal verslechteren.
    8. Op 17-19 DIV van gliale cultuur in een kolf (dwz 11 dagen na de passage en een dag voor trypsinisatie en plating op dekglaasjes door stappen 3.3.9-3.3.14), plaats 100 ul van het bekledingsmateriaal op ongewassen dekglaasjes ( rond, diameter 12 mm) in een kweekschaal, en zet de kweekschaal in de incubator.
      LET OP: Voor rat glialculturen, werd geen verschil opgemerkt in de kweekresultaten met of zonder het wassen van de dekglaasjes.
    9. Bij 18-20 DIV gliale cultuur in een kolf (dwz 12 dagen na passage), bereid de gliale feeder-laag door trypsinizing de gekweekte cellen, volgens step 3.2.8.
    10. Tijdens centrifugeren volledig zuig het bekledingsmateriaal van de dekglaasjes.
    11. Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C), en meet de celdichtheid, volgens stap 3.1.13.
    12. Pas de gliale dichtheid 10 4 levende cellen / ml, en plaat 100 pl gliale celsuspensie op het beklede dekglaasjes.
      OPMERKING: Deze cellen zullen de gliale feeder-laag vast te stellen.
    13. Plaats de cultuur schotel met dekglaasjes in de incubator voor 20-60 min.
    14. Voeg 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C) aan elk putje, en zet de schaal terug in de incubator.
    15. 3-4 DIV van de gliale feeder-laag, wanneer de cellen op het dekglaasje zijn 40-80% confluent, voeg 1 ml van de voorverwarmde kweekmedium (zie tabel 1 voor samenstelling) die cytosine β-D-arabinofuranoside bevat ( AraC, eindconcentratie van 4 uM) aan gliale-celproliferatie stoppen. Plaat neurons bij 7-9 DIV van de gliale feeder-laag wanneer de cellen 60-80% confluent met stap 3.4.
  4. Muis neuronale kweken
    1. Label en genotype pasgeboren muizen volgens de stappen 1 en 2.
    2. Gebruik de muis pups voor stap 3.1.
    3. Pas de densiteit levend celsuspensie ~ 2,0 x 10 5 cellen / ml met voorverwarmd plaatmedium-2 voor plateren op muis gliacellen, of middels plaatmedium-3 voor laag op ratten gliacellen.
    4. Plaat de cellen op de gliale feeder layer, door voorzichtig toevoegen van de celsuspensie aan het kweekmedium van elk putje. Opmerking: Het volume van de celsuspensie worden toegevoegd, wordt bepaald door het vereiste aantal cellen in een kweek ook. Zo plaat ~ 60 ul van celsuspensie tot 12.000 cellen te bereiken / goed.
    5. Merk op dat er geen oplossing veranderingen zijn nodig na de neuronen worden verzilverd. Wees voorzichtig verdampen van de oplossing uit de putjes voorkomen in de loop van de cultuur, door bevochtiging van de binnenkant of de incubator.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als voorbeeld van de toepassing van dit protocol, worden representatieve resultaten getoond voor het labelen van muizen door tatoeëren, betrouwbare genotypering onder verschillende experimentele omstandigheden, en tot vaststelling van primaire neuronale culturen op gliale feeder lagen.

Tatoeëren

Pasgeboren pups werden bestempeld op de voetzolen met een tatoeage systeem ('Newborn' in figuur 1). De etiketten blijft zichtbaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol omvat procedures voor het tatoeëren om muizen te labelen/identificeren, voor het genotyperen van muizen uit staartpunten en voor het kweken van muizenhersenneuronen op lage dichtheid. In één ronde van experimenten met 6-8 pups vereisen deze procedures typisch ~0,5 uur, ~4 uur en ~2 uur, respectievelijk, met een totaal van 6-7 uur. Dit maakt het praktisch voor een enkele onderzoeker om alle noodzakelijke procedures te voltooien vanaf het moment van de geboorte van de pups tot het aanleggen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur (Zhengmin Huang) is de president van EZ BioResearch LLC die reagentia produceert die in dit artikel worden beschreven.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de onderzoekers van de Universiteit van Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins en Beverly Davidson voor instructies en nuttige opmerkingen met betrekking tot striatale culturen, en Drs. Kara Gordon, Nicole Bode en Pedro Gonzalez-Alegre voor genotypisatie-assistentie en discussies. We danken ook Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) voor nuttige opmerkingen met betrekking tot tatoeëren, en Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) voor nuttige opmerkingen met betrekking tot de muiscultuur. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association, het Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), de Dystonia Medical Research Foundation, de Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, de National Science Foundation en de Whitehall Foundation (N.C.H.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3Dit wordt gebruikt om de naalden en de houder na het tatoeëren schoon te maken.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4Dit wordt gebruikt om de naalden en houder na het schoonmaken te drogen.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01Deze reagent levert een dunne laag olie die de efficiëntie van het tatoeëren verbetert en tatoeage vervagen voorkomt, door (informatie van de verkoper): 1) het voorkomen dat niet-getatoeëerde huid tijdelijk wordt bevlekt, waardoor de kwaliteit van een pootkussentatoeage gemakkelijk kan worden beoordeeld voordat de pup naar zijn thuiskooi wordt teruggezet – het bevlekte huidoppervlak kan worden verward met de getatoeëerde huid, 2) het verminderen van huidbeschadiging tijdens het tatoeëren – het verzachten van de huid en het smeren van de naald helpt de naald de huid te penetreren zonder huidbeschadiging te veroorzaken, en 3) het voorkomen dat moleculair zuurstof de huid binnendringt, waardoor ontstekingsreacties op reactieve zuurstofsoorten die kunnen worden gegenereerd, worden verminderd.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100Een rode, laadkleurstof voor elektroforese is opgenomen in de 2X PCR Ready Mix oplossing.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Bereid de DNA Extractie Oplossing door 20 µl van Tissue Lysis Solution A en 180 µl van Tissue Lysis Solution B per monster te mengen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Bereid de DNA Extractie Oplossing door 20 µl van Tissue Lysis Solution A en 180 µl van Tissue Lysis Solution B per monster te mengen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We gebruiken 2% agarose gels in TAE buffer met de SYBR Safe DNA gel stain (10.000 keer verdund) of ethidiumbromide (0,5 µg/ml gelvolume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Gebruik pipettenpunten die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Voor alle stappen waarbij DNA betrokken is, gebruik gefilterde pipettenpunten om kruisbesmetting te voorkomen.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSGebruik pipettenpunten die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Voor alle stappen waarbij DNA betrokken is, gebruik gefilterde pipettenpunten om kruisbesmetting te voorkomen.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSGebruik pipettenpunten die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Voor alle stappen waarbij DNA betrokken is, gebruik gefilterde pipettenpunten om kruisbesmetting te voorkomen.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We gebruiken een van deze drie molecuulgewicht markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Gebruik buisjes die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Een strip met 8 buisjes is gemakkelijker te hanteren en om de monsters te groeperen dan individuele buisjes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Gebruik buisjes die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Gebruik buisjes die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) en 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (referentie 18). Deze primers werden gebruikt bij een eindconcentratie van 1,0 ng/µl (~0,16 µM) (referentie 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) voor de 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) voor de 983-bp amplicon, en 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3

Referenties

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Primaire neuronale culturengliale feederlaagDNA-extractiePCR-amplificatiegelelektroforesedissectie van de hersenenweefseldigestieceldissociatieuitplaten van neuronen
Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.