Methodenartikel

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo's in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

DOI:

10.3791/51880

⸱

18 september 2016

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologische cellen worden gewoonlijk waargenomen op vlakke (2D) oppervlakken. Deze voorwaarde is niet fysiologische en fenotypes en vormen zijn zeer variabel. Screening op basis van cellen in dergelijke omgevingen hebben dus ernstige beperkingen: celorganellen tonen extreme fenotypes cel morfologie en grootte zijn heterogeen en / of specifieke celorganellen niet goed zichtbaar is. Bovendien, cellen in vivo in een 3D-omgeving; in deze situatie cellen vertonen verschillende fenotypen vooral door hun interactie met de omringende extracellulaire matrix van het weefsel. Om standaardiseren en genereren orde van enkele cellen in een fysiologisch relevante 3D omgeving voor cel-gebaseerde testen, beschrijven we hier de microfabricage en toepassingen van een inrichting voor in vitro 3D celkweek. Deze inrichting bestaat uit een 2D reeks microcavities (gewoonlijk 10 5 holten / cm 2), elk gevuld met losse cellen of embryo's. cel positie, vorm, polariteit en de interne organisatie van de cel worden dan genormaliseerd met een 3D-architectuur. We gebruikten replica molding patroon een reeks van microcaviteiten, 'eierdopjes', op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een dekglaasje. Holtes waren bedekt met fibronectine hechting vergemakkelijken. Cellen werden ingebracht door centrifugeren. Vervullingspercentage werd geoptimaliseerd voor elk systeem waardoor tot 80%. Cellen en embryo levensvatbaarheid werd bevestigd. Wij pasten deze methode voor de visualisatie van cellulaire organellen zoals kern en Golgi apparaat en actieve processen, zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic celmitose bestuderen. Dit apparaat kon de identificatie van nieuwe functies, zoals periodieke ophopingen en inhomogeniteiten van myosine en actine tijdens de cytokinetic ring sluiting en verdicht fenotypes voor Golgi en de kern uitlijning. Wij karakteriseerden de werkwijze voor zoogdiercellen, splijtgist, gist, C. elegans wide specifieke aanpassing in elk geval. Tenslotte, de kenmerken van dit apparaat worden bijzonder interessant voor screeningstesten voor geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidige in vitro op cellen gebaseerde assays zijn tweedimensionale (2D). Deze configuratie is niet natuurlijk voor zoogdiercellen en dus niet fysiologisch relevant 1; cellen vertonen een diversiteit aan vormen, maten en heterogene fenotypes. Zij presenteren op ernstige beperkingen bij toepassing op screening toepassingen, zoals een wanordelijke verdeling binnen het vliegtuig en extreme fenotypes van cellulaire organellen (stress vezels, in het bijzonder). Dit is vooral belangrijk bij klinische proeven voor het testen van geneesmiddelen, waarbij hoge budgetten jaarlijks worden uitgegeven. De meeste van deze geneesmiddelen echter niet wanneer toegepast op diermodellen vanwege de kunstmatige 2D kweekomstandigheid in een vroege drug discovery. Bovendien gegevens geven specifieke celorganellen kan niet goed zichtbaar, zoals cytokinetic actomyosine ring tijdens celmitose en algemeen structuren die evolueren in het vlak loodrecht op het vlak van waarneming. sommigenieuwe 2D assays zijn om te overwinnen de bovengenoemde nadelen en belangrijke inzichten cytoskelet organisatie waargenomen 2,3 voorgesteld. Echter, deze testen nog onderhavige serieuze beperking: cellen vertonen een fenotype spreiding in tegenstelling tot wat wordt waargenomen in vivo, waarbij cellen vormen een 3D architectuur. Deze artefacten in verband met de kweekmethode kan niet-fysiologische functies te sturen, zoals verhoogde stress-vezels 1,4,5.

Driedimensionale celcultuur assays om talrijke voordelen ten opzichte van 2D omgevingen 6,7. Ze zijn fysiologisch relevanter en resultaten zijn daarom zinvol. Als voorbeeld, cellen ingebed in hydrogels tonen 3D-structuren maar hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere 8,9. Echter, hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere, waarbij het screenen bemoeilijkt. Een alternatieve strategie is om insluiten enkelcellen in microfabricated holten 10,11. Cell positie, vorm, polariteit en de interne organisatie cel kan vervolgens genormaliseerd worden. Naast het verstrekken van 3D-achtige architectuur aan cellen, microcaviteiten maakt het ook mogelijk voor high-gehalte screening studies 10,12-14; enkele cellen kunnen worden besteld in microarrays en cellulaire organellen en hun evoluties kunnen parallel worden waargenomen. Deze regelmaat biedt goede statistieken met een gering aantal cellen en betere temporele / ruimtelijke resoluties. Bruikbare verbindingen zijn gemakkelijker betrouwbaar te identificeren.

In deze studie tonen we de fabricage en toepassing van een nieuwe 3D-achtige enkele cellen kweeksysteem voor high-content-screening toepassingen 10,12,13. De inrichting bestaat uit een matrix van elastomeer microcavities (10 holten 5 / cm 2), bedacht 'eierdopjes (EC). Afmetingen en de totale omvang van de EC in dit werk zijn geoptimaliseerd om de typische volume van één NIH3T3 en HeLa-cellentijdens de celdeling. Morfologie van de holten - cilindrische - is geselecteerd goed oriënteren celvorm voor de visualisatie van actieve processen. Replica gieten wordt gebruikt voor het patroon van een array van de EG op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een glazen dekglaasje 15,16. De cellen worden in de EG geïntroduceerd door centrifugeren. Wij rapporteren hier observatie en normalisatie van cellulaire organellen (actine stressvezels, Golgi-apparaat en nucleus) in 3D (EG) in vergelijking met dezelfde cellen 2D (vlakke) oppervlakken. Wij rapporteren ook de waarneming van actieve dynamische processen zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic actomyosine celmitose 17. Tot slot laten we resultaten van deze methodologie op andere systemen met vaste wanden, zoals gist, splijtgist en C. elegans embryo's die de toepasbaarheid van onze methodologie bevestigt aan een breed scala van modelsystemen.

We naast een gedetailleerd en uitputtend pROTOCOL om te fabriceren en de 'eierdopjes "3D microfabricatie toepassing. Onze benadering is eenvoudig en vereist geen schone ruimte nodig. We verwachten dat deze nieuwe methode met name interessant voor drug screeningstesten en gepersonaliseerde geneeskunde zal zijn, ter vervanging van petrischaaltjes. Tenslotte zal ons apparaat bruikbaar voor het bestuderen van de verdelingen van cellen reacties op externe stimuli, bijvoorbeeld kanker 18 en fundamenteel onderzoek 19 zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microfabricage van 'Eggcups'

  1. Fabricage van de Master: microcaviteiten Array
    1. Verhit een 3 '' silicium wafer tot 200 ° C om eventuele aanwezigheid van vocht verdampen.
    2. Spin-coat een dunne laag van SU-8. Stel het volume hars en spinsnelheid afhankelijk van de gewenste dikte en het type fotoresist. Deze dikte zal de diepte van de "eierdopjes (EG) bepalen. Voor een 30 micrometer dikke laag en SU-8 2025 spin-laag bij 2.800 toeren per minuut.
    3. Pre-bak de wafer bij 65 ° C gedurende 1 min (stap 1 van 2) om een ​​30 urn dikke SU-8 2025 laag. Pas de tijd afhankelijk van het fotoresist en de gewenste dikte. Controleer de fabrikant datasheet voor meer informatie.
    4. Pre-bak de wafer bij 95 ° C gedurende 3 minuten (stap 2 van 2) om een ​​30 urn dikke SU-8 2025 laag. Pas de tijd afhankelijk van het fotoresist en de gewenste dikte. Controleer de fabrikant datasheet voor meer informatie.
    5. Laad dewafer op het masker aligner UV blootstelling. Plaats het fotolithografisch masker op. Het masker toont een patroon van cirkelvormige elementen (schijven) van 20 pm in diameter. Zorgen voor een perfect contact met elkaar.
      OPMERKING: Verschillende fabrikanten bieden fotolithografie maskers. De ruimtelijke resolutie zal de uiteindelijke kosten te bepalen. Acetaat maskers bieden aanvaardbare resolutie (≈10 pm) tegen lage kosten. Chromium maskers betere resolutie, maar zijn duurder. Pas de diameters van de schijven (van de fotolithografie masker) om het volume van cellen. Afmetingen van schijven op het masker zal de diameter van holten in het apparaat. Kleine diameters leidt tot een laag vulling; te grote diameter niet beperken de cellen. Voor HeLa en NIH3T3 cellen, zijn diameters van 20 urn tot 25 urn voorgesteld.
    6. Controleer de kracht van de UV-lamp voorafgaande expositie en dus optimaliseren van de belichtingstijd. Bestralen (golflengte = 365 nm) gedurende 41,5 sec (of het optimale belichtingstijd) en250 mJ / cm2.
      OPMERKING: SU-8 2025 is een negatieve fotoresist, waardoor belichte gebieden aan UV wordt uitgehard. In dit geval, de cirkelvormige kenmerken waren zwart en de rest transparant. Positieve fotolak werk in de tegenovergestelde manier: niet-belichte gebieden worden genezen. Selecteer de fotoresist derhalve afhankelijk van het ontwerp en het fotomasker.
      OPMERKING: Bescherm de ogen tegen UV-licht met de juiste veiligheidsbril.
    7. Verwijder voorzichtig het masker van de fotoresistlaag.
    8. Post-bak de wafer bij 65 ° C gedurende 1 min (stap 1 van 2) om een ​​30 urn dikke SU-8 2025 laag. Post-bak de wafer bij 95 ° C gedurende 3 minuten (stap 2 van 2) om een ​​30 urn dikke SU-8 2025 laag. Pas de tijd afhankelijk van het fotoresist en de gewenste dikte. Controleer de fabrikant datasheet voor meer informatie. Na post-bakken, koelen van de wafer op kamertemperatuur op de bank voor ongeveer 1 min.
    9. Plaats de wafer in de spin-coater en drop paar mm van de SU-8 developer te dekkende hele wafer gebied. Ontwikkelen gedurende 2 minuten en vervolgens spin-laag bij 1000 tpm gedurende 30 sec. Herhaal deze procedure drie maal.
    10. Spoelen met 2-propanol om de volledige verwijdering van onontwikkelde SU-8 waarborgen. Verschijning van de witte gebieden is een indicatie van onvolledige ontwikkeling. Als dat zo is, herhaalt u de ontwikkeling van een stap extra tijd.
    11. Hard-bak de wafer bij 200 ° C om robuustheid van de vervaardigde microstructuren waarborgen. Deze stap is optioneel.
    12. Bewaar de 3 '' wafer met microstructuren in een 94 mm x 15 mm polystyreen petrischaal.
      NB: Er is geen noodzaak voor oppervlaktebehandeling, in het bijzonder silaneren, voor de volgende stappen.
  2. Fabricage van de Polydimethylsiloxane (PDMS) Replica: Pijlers Array
    1. Meng in een 01:10 verhouding (w / w) de verknoper en de prepolymeer voor een totaal van 30 g in een 50 ml buis.
      LET OP: Het gebruik van een (v / v) 01:10 verhouding werkt ook.
    2. Centrifugeer de buis bij 1800 xg gedurende 5 minVerwijder luchtbellen.
    3. Drop voorzichtig de PDMS op de top van de microstructuren.
      NB: Als er luchtbellen verschijnen tijdens deze stap, ontgas het monster met behulp van een vacuümpomp voor 15-20 min.
    4. Het monster wordt in een oven bij 65 ° C gedurende 4 uur.
      OPMERKING: De uithardingstijd varieert tussen gebruikers en, samen met de vernetter: prepolymeer verhouding. Deze keer zal de stijfheid van het PDMS te dicteren. Het wordt aanbevolen om meer dan 2 uur harden en te houden aan een vaste uithardingstijd.
    5. Gebruik een scalpel om voorzichtig te snijden het gebied van belang (stempel) van ongeveer 1 cm 2, die ongeveer 10 5 microcaviteiten of 'eierdopjes' omvat.
      OPMERKING: Knip eerst het PDMS en dan, afschilferen voorzichtig. De kwaliteit van de replica PDMS met een optische microscoop.
  3. Fabricage van 'eierdopjes' van replica gieten. Hierna worden twee alternatieve strategieën voor de vervaardiging van "eierdopjes 'beschreven. Beide protocollen SimiLAR en geven identieke resultaten:
    1. strategie 1
      1. Activeer de gefabriceerde PDMS stempel door zuurstof plasma behandeling voor 30 sec. Tijdelijk op te slaan de geactiveerde stempels in een gesloten petrischaaltje om afzetting van stof te voorkomen.
        OPMERKING: Stel de expositie tijd als andere gassen voor het plasma worden gebruikt.
      2. Plaats de geactiveerde PDMS stempel ondersteboven op (de zijde met de structuur) in een petrischaal naast een 15 ml tube cap. Vul de dop met 200 ul van trimethylchloorsilaan (TMCS). Sluit de petrischaal en laat de stempel silaniseren gedurende 7 min.
        OPMERKING: Sommige tijdelijke vervorming op de postzegel en / of verandering in kleur (wit) kan worden waargenomen. Het stempel zal zijn oorspronkelijke vorm in korte tijd herstellen en de structuren zal niet worden aangetast.
        LET OP: TMCS produceert acute inademing en dermale toxiciteit en is licht ontvlambaar (met ontsteking flashback kunnen zich voordoen over grote afstanden). Daarom moet deze worden gebruikt in een zuurkast verwijderd van brons van de ontsteking.
      3. Plaats de PDMS stempel op de spin-coater met de structuren kop omhoog. Doe een druppeltje paar microliter (ongeveer 20 pl) van vloeibare PDMS (1:10 w / w verknopingsmiddel: prepolymeer) bovenop de structuren. Spin-laag bij 1500 rpm gedurende 30 seconden om een ​​dunne laag van PDMS bovenop de structuren deponeren.
        NB: Als de stempel past niet in de spin-coater boorkop plaats de stempel op de top van een petrischaal deksel met een klein gat in het midden.
      4. Plaats de stempel in de oven bij 65 ° C gedurende 4 uur om de gedeponeerde roterend bedekken PDMS laag harden.
      5. Activeer de dunne PDMS laag door het plaatsen van de PDMS stempel ondersteboven op, samen met een glazen dekglaasje # 0 van 25 mm diameter, gebruik van zuurstof plasma reiniger voor 30 sec. Gaat snel naar de volgende stap.
        OPMERKING: Coverslips met andere dikten, vormen en afmetingen kunnen eveneens worden gebruikt. Echter kunnen sommige cellulaire structuren moeilijk te visualiseren afhankelijk van de geselecteerde dekglaasje dikte en objectievevergroting en / of NA en / of werken op afstand. Controleer de objectieve data sheet.
      6. In contact te brengen de stempel (de kant met de dunne-spin-bekledingslaag) met de glazen dekglaasje. Druk zachtjes rondom het oppervlak van de stempel met een pincet aan de 'bonding' maken. Tenslotte, houdt een constante druk op de top van de stempel ongeveer 10 sec.
      7. Na 30 min zachtjes 'schil' van de stempel van het dekglaasje om te 'bevrijden' 'eierdopjes' (zie figuur 1). Spoel grondig met ethanol en droog. Als PDMS 'eierdopjes' niet goed nageleefd op het glas dekglaasje (dwz ze los tijdens de 'unpeeling' stap), overweeg dan het aanpassen van de instellingen van de plasma schoner en start bij stap 1.3.1.5.
        OPMERKING: Deze stap is delicaat. Let teneinde breuk van het dekglaasje en / of loslaten van de dunne laag PDMS voorkomen.
      8. Lijm een ​​klein stukje (handvat) van de uitgeharde PDMS van 1 mm x 1mm x 3 mm in volume aan de rand van het dekglaasje met een kleine druppel vloeistof PDMS en genezen van de PDMS als voorheen. Dit zal de manipulatie van het monster daarna vergemakkelijken (zie figuur 1). Deze stap is optioneel.
    2. strategie 2
      1. Hydrofiliseren de gefabriceerde PDMS stempels door zuurstof plasmabehandeling gedurende 30 sec. Tijdelijk op te slaan de geactiveerde stempels in een gesloten petrischaaltje tot afzetting van stof te voorkomen.
        OPMERKING: Stel de expositie tijd als andere gassen voor het plasma worden gebruikt.
      2. Hydrofiliseren de 25 mm diameter glazen dekglaasjes # 0 zuurstofplasma behandeling bij 15 W gedurende 30 seconden. Gaat snel naar de volgende stap.
        OPMERKING: Coverslips met andere dikten, vormen en afmetingen kunnen eveneens worden gebruikt. Echter celstructuren moeilijk te visualiseren afhankelijk van de geselecteerde dekglaasje dikte en objectieve kenmerken (zie opmerking boven).
      3. Spin-coat een druppeltje PDMS (1:10 w / w verknopingsmiddel: pre-polYmer) van de weinige microliter op het glas dekglaasjes. Spin-laag bij 1500 rpm gedurende 30 seconden voor een uiteindelijke dikte van ongeveer 50 urn.
      4. Lijm een ​​klein stukje (greep) van uitgeharde PDMS van 1 mm x 1 mm x 3 mm in volume aan de rand van het dekglaasje met een kleine druppel vloeistof PDMS en genezen van de PDMS als voorheen. Dit zal de manipulatie van het monster daarna vergemakkelijken (zie figuur 1). Deze stap is optioneel.
      5. Bewaar tijdelijk de-PDMS gecoate dekglaasjes op een schoon te vegen in een petrischaal te beschermen tegen stof depositie.
      6. Een druppel silaneren reagens bovenop elkaar stempel en laten verdampen gedurende 1-2 min. Vervolgens drogen onder een stroom N2.
        Opmerking: In deze stap kan een tijdelijke vervorming van de stempel tijdens verdamping worden waargenomen. Het stempel zal zijn oorspronkelijke vorm te herstellen na het drogen met N2 zonder blijvende vervorming van microstructuren.
      7. Drop heel voorzichtig de gesilaniseerde stempel op de top van dePDMS-spin-beklede glazen dekglaasje opgeslagen in de petrischaal. Zorg ervoor dat beide partijen volledig parallel zijn tijdens het contact. Vermijd drukken of het verplaatsen van de stempel na het plaatsen van het op de PDMS-gecoate dekglaasje.
      8. Plaats de petrischaal met monsters in vacuüm gedurende 1-2 uur om luchtbellen te verwijderen.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de monsters zijn volledig horizontaal stempel verplaatsing te voorkomen. Vermijd ook trillingen mogelijk veroorzaakt door de vacuümpomp.
      9. Plaats de monsters in een oven van 65 ° C gedurende 4 uur.
      10. Voorzichtig, haal het stempel 'eierdopjes' te onthullen. Spoel grondig met ethanol en droog.
        OPMERKING: praktijk op dit moment nodig is. Besteed aandacht in het vermijden van breuk van de dekglaasje en / of loslaten van de dunne PDMS laag.

2. De invoering van cellen in de 'Eggcups'

Om zoogdiercellen binnen 'eggcups', PDMS oppervlak ne introducereneds worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten van de extracellulaire matrix. In dit voorbeeld wordt fibronectine maar andere eiwitten van belang, zoals collageen, kunnen worden gebruikt.

  1. Hydrofiliseren de 'eierdopjes in het zuurstofplasma reiniger voor 30 sec.
    OPMERKING: Optimaliseer de parameters indien nodig.
  2. Bereid een oplossing in PBS 1x van 20 ug ml -1 fibronectine van Bovine bronnen.
  3. Steriliseer de 'eierdopjes' met UV gedurende 5 minuten. Stort een kleine druppel (ongeveer 20-50 ui) van fibronectine oplossing voor de gehele 'eierdopjes' bedekken en incubeer gedurende 1 uur bij KT. Bescherm het monster uit te drogen.
  4. Spoel voorzichtig de 'eierdopjes' met PBS 1x. Herhaal dit 3 keer.
    Opmerking: Het monster direct klaar voor gebruik of opgeslagen bij 4 ° C in het donker gedurende meerdere weken.
  5. Introduceer een cilindrische custom-made plastic stuk van 63 mm in de hoogte, 26 mm van de externe radius en 7 mm van de inwendige afmetingen straal in een 50 ml buis (zieFiguur 2) 20
    LET OP: Gebruik UV-gesteriliseerde items of steriliseren ze eerder gebruik.
    NB: Dit stuk kan gemakkelijk worden vervaardigd in het lab. of met alle beschikbare machine winkel.
  6. Doe 13 ml van celkweek medium binnen de buis (zie tabel 1). De drager dient minimaal 2 cm boven het cilindrische stuk vullen volledige onderdompeling van het monster te verzekeren.
    LET OP: Voor meer informatie over specifieke celtypen, en andere model systemen zoals gist of C. elegans embryo's, en de bijbehorende gebruikte medium, te vinden in hoofdstuk 5 en tabel 1. De beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor HeLa, NIH3T3-cellen, en andere cellijnen (zie tabel 1).
  7. Introduceren zachtjes het "eierdopjes 'in de buis en evenwijdig aan de bovenzijde van het kunststof stuk. Gebruik scherpe pincet om het monster met behulp van de PDMS handvat vast te houden. Druk voorzichtig de dekglaasje totdat het ligt op de top van de bovenkant van het plastic onderdeel, until volledig wordt ondergedompeld (zie figuur 2).
    LET OP: Het is aanbevolen om scherpe en rechte pincet gebruiken. Met gebogen pincet, de manipulatie van het monster is moeilijk deze kan breken.
  8. Kweekcellen tot 80-100% samenvloeiing in een P60 petrischaal en verzamel ze door behandeling met trypsine.
    OPMERKING: Cellen kunnen wild-type, getransfecteerd of behandeld met een geneesmiddel van belang zijn.
    OPMERKING: Vermijd de vorming van cel aggregaten die enkele cellen zullen voorkomen dat de 'eierdopjes' te openen. Om deze stap, pipet op en neer grondig na behandeling met trypsine te optimaliseren.
  9. Resuspendeer cellen in 5 ml kweekmedium. Pipetteer 200 ul van cellen bovenop de 'eierdopjes.
    OPMERKING: Drop cellen zoveel mogelijk gecentreerd boven de 'eierdopjes' maar vermijden fysiek contact. Dit breuk en / of beschadiging van het monster te voorkomen.
  10. Centrifugeer bij 1800 xg gedurende 2 minuten.
    NB: Na de eerste centrifugeren, check-in een microfoonroscope het vullen percentage van de "eierdopjes.
  11. Pipetteer weer 200 ul van cellen bovenop de 'eierdopjes en centrifugeer bij 1800 xg gedurende 2 minuten. Herhalen voor een totaal van drie keer teneinde de vervullingspercentage optimaliseren.
    LET OP: Na de laatste centrifugeren, controleren met een microscoop het vullen percentage 'eierdopjes'. Indien nodig, herhaal de vulling + centrifugeren stappen tot het bereiken van de gewenste vulling percentage.
  12. Verwijder het monster uit de buis met behulp van de scherpe pincet die de PDMS handvat. Zorg ervoor dat voorzichtig in geen 'storende' cellen die worden gehouden in de 'eierdopjes' te zijn (zie figuur 2).
  13. Plaats het monster in een petrischaal met medium. Spoel de overmaat cellen die niet in de 'eierdopjes' voorzichtig naast elke zijde (totaal 4 zijden) van de microstructuur matrix verwijderen en neer te pipetteren driemaal.
    OPMERKING: Pipetting misschien te sterk vrijgevensommige cellen uit de 'eierdopjes'.
  14. Vervang het medium met vers medium om nonattached cellen te verwijderen.
    Opmerking: In deze stap een geneesmiddel plaats kunnen worden toegevoegd.
  15. Fix cellen of hen voor te bereiden time-lapse imaging.See stap 4.1.

3. Observatie van Active Cellular Dynamics in 'Eggcups': Cytokinetic Ring Sluiting

LET OP: Dit voorbeeld gebruikt HeLa-cellen die zijn getransfecteerd met MYH10-GFP en Lifeact-mCherry voor myosine en actine, respectievelijk, de belangrijkste actieve moleculen die betrokken zijn bij de cytokinetic ring sluiting tijdens de cel mitose. Het apparaat wordt bereid met microcavities van 25 urn in diameter. Voor hun waarneming werd een epifluorescentie omgekeerde microscoop gebruikt, uitgerust met een 60X objectief olie (1,40 NA, DIC, Plan Apo) en GFP (myosine) en TxRed (actine) filters. Als alternatief kan een rechtopstaande confocale microscoop werd gebruikt, uitgerust met een 25x of 63x HCX IR APO objectief L water (0,95 NA). Hiervoor EXAmple, is het sterk aanbevolen om cellen te synchroniseren met behulp van de dubbele thymidine blok, mitotische blok of mitotische shake-off methode 21-24.
OPMERKING: De dikte van de PDMS gebruikt wordt voor het eierdopjes 'staat het gebruik van een verscheidenheid aan doelstellingen zowel gemarkeerd en opengevouwd microscopen.

  1. Place 'eierdopjes' in een microscoop houder en vul deze met 1 ml 10% FCS L-15 observatie medium. Om verdamping te voorkomen, plaatst u een glazen deksel op de top van de houder of breng een dun laagje van minerale olie op de top van de medium.Select de olie doelstelling 60X.
    OPMERKING: L-15 medium is geschikt voor niet-CO 2 atmosferen. Merk ook op dat sommige verbindingen met DMEM zijn auto-fluorescentie. Bij gebruik van dit medium, is het raadzaam om de fluorescerende verbindingen photobleach door belichten met een lamp met hoge intensiteit gedurende 1-2 uur.
    LET OP: Vermijd het gebruik van plastic deksels bij het werken met DIC imaging.
  2. Plaats de houder met 'eierdopjes en goeder trouwvatie medium in de microscoop. Focus voorzichtig met helderveld licht tot het 'eierdopjes' en cellen in hetzelfde gebied van waarneming.
  3. Open de software en de parameters aan te passen. Selecteer de filters TxRed en GFP voor actine en myosine; Stel de belichtingstijd voor elk kanaal. Een typische overname bedraagt ​​5 sec voor beide kanalen.
    NB: De expositie tijd mogelijk moeten worden aangepast, afhankelijk van de instelling gebruikte kleurstof of andere cellulaire organellen van belang.
  4. Selecteer de regio van belang en zoeken naar een cytokinetic ring met behulp van de GFP of TxRed kanaal. Focus nauwkeurig.
    NB: De ring is scherper in myosine en gemakkelijker te herkennen.
  5. Voer de automatische acquisitie in beide kanalen, totdat de ring volledig gesloten is.
    OPMERKING: Sommige fotobleken kan worden waargenomen. Pas de microscoop parameters om reduceren.

4. Observatie van Vaste celorganellen in de 'Eggcups'

Deze stap kan worden uitgevoerd voor of na stap 3. Cellen kunnen direct worden vastgesteld nadat het centrifugeren stap en gekleurd voor de organel van de rente of na de constatering in de microscoop. Dit voorbeeld toont de kleuring van het Golgi-apparaat, kern en actine vezels op NIH3T3 fibroblasten in 'eierdopjes.

  1. Fixatie van cellen in de 'Eggcups'
    1. Bereid 3% paraformaldehyde (PFA) en verwarm bij 37 ° C. Verwijder het monster 'eierdopjes' uit de 50 ml buis (of de microscoop houder) en plaats deze in een P35 petrischaal. Spoel eenmaal met PBS 1x.
      OPMERKING: Protocollen voor de bereiding van 3% paraformaldehyde elders schaal beschikbaar.
      LET OP: Gebruik van nitril en oogbescherming tijdens de voorbereiding van de PFA.
    2. Volledig te verwijderen van de PBS en drop 1 ml van 3% PFA en incubeer gedurende 17 min. Verwijder de PFA en tweemaal spoelen met 1 ml PBS 1X. Doorlaatbaar cellen met behulp van 1 ml 0,5% Tritgedurende 3 min en was tweemaal met PBS 1 x gedurende 5 min.
  2. Kleuring van cellen in 'Eggcups'
    1. Incubeer cellen voor Golgi kleuring met het primaire antilichaam polyklonaal konijn anti-Giantin in een 1: 500 verdunning in PBS. Plaats een 100 ul druppel antilichaamoplossing op een kunststoffolie plaat en incubeer de cellen in de "eierdopjes" ondersteboven 45 min.
      OPMERKING: Bescherm het monster met een deksel om uitdroging te voorkomen.
    2. Laat voorzichtig de 'Eggcups' en leg ze in een P35 petrischaal. Spoel 3 keer, 5 minuten elk met PBS 1x.
    3. Bereid een cocktail in PBS met het secundaire antilichaam Cy3 geit anti-konijn (1: 1000) en met Phalloidin Alexa Fluor 488 (1: 200) voor het kleuren actine stressvezels.
    4. Incubeer de cellen met 100 ul druppel antilichaamoplossing op een kunststoffolie plaat en incubeer cellen in het "eierdopjes" ondersteboven 45 min.
    5. Vrijgeven zorgvuldig de 'eggcups 'en plaats ze in een P35 petrischaal. Spoel 3 keer, 5 minuten elk met PBS 1x.
    6. Incubeer cellen gedurende kern kleuring plaatsen van een 100 ul druppel van 1 ug ml -1 DAPI in PBS op een kunststoffolie plaat en incubeer cellen in het "eierdopjes" ondersteboven 45 min. Deze stap kan worden uitgevoerd met stap 4.2.3.
    7. Laat voorzichtig de 'eierdopjes en plaats ze in een P35 petrischaal. Spoel 3 keer, 5 minuten elk met PBS 1x.
    8. Mount cellen met behulp van een 15 ul glycerol: PBS (1: / v 1 v) op een standaard microscoop glasplaatje en verzegelen van het monster met nagellak om uitdroging te voorkomen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de dikte 'eierdopjes', montage kan moeilijk zijn. Aanbevolen wordt opgeslagen dat het monster in een petrischaal P35 in PBS, beschermd tegen uitdrogen.
  3. microscoop Observation
    LET OP: Voor dit voorbeeld een rechtopstaande confocale microscoop wordt gebruikt, uitgerust met PMT en Hybrid detectoren. Een 25X of 63 X HCX IR APO objectief L water (0,95 NA) werd geselecteerd om een ​​breed gebied van het monster en tonen de toepasbaarheid van de inrichting voor high content screening toepassingen.
    1. Selecteer het doel 25X of 63x water.
      LET OP: Verschillende doelen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de toepassing en het signaal. Maar het gebruik van een hoge opening doelstellingen numerieke wordt aanbevolen.
    2. Plaats het vaste monster met de 'eierdopjes en concentreren voorzichtig met helderveld licht (fasecontrast of DIC) tot het' eierdopjes en cellen in het vlak van de waarneming.
    3. Open de software en de parameters aan te passen. Selecteer de filters GFP, Cy3 en DAPI voor actine, Golgi en de kern observatie, respectievelijk; pas de expositie tijd voor alle kanalen.
      NB: De expositie tijd mogelijk moeten worden aangepast, afhankelijk van de configuratie.
    4. Selecteer en de focus van de regio van belang; start het vastleggen van beelden (zie figuur 3).
TLE "> 5. Aanpassing voor de observatie van gistcellen en C. elegans Embryo

  1. Kernsplijting en Budding gistcellen
    LET OP: Dit voorbeeld gebruikt splijtingsproducten gistcellen die zijn gelabeld met RLC1-mCherry en CHD-GFP voor myosine en actine, respectievelijk. De ontluikende gistcellen worden niet fluorescent hier geëtiketteerd. Voor kernsplijting gist waarneming werd een omgekeerde draaiende schijf confocale microscoop gebruikt. Een 100X HCX PL APO CS olie doelstelling (1.4 NA) werd gebruikt voor alle overnames. Alternatief cellen werden ook waargenomen met behulp van een omgekeerde fase contrast microscoop uitgerust met een 20X objectief fasecontrast lucht LCPlanFl (0,4 NA). In dit voorbeeld is het protocol voor beide celtypen.
    1. Bereid het oppervlak "eierdopjes zoals hierboven is aangegeven. Voor splijting en gist cellen, bereid holten van 5 urn in diameter (zie tabel 1). In dit geval is het oppervlak niet te worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten.
      LET OP: De vulling can geoptimaliseerd worden door gebruik conische 'eierdopjes. Deze vorm vangt en houdt de cellen los te vermijden tijdens de spoelstap na centrifugeren. Vervullingspercentage optimaal ongeveer 80%. Deze conische 'eggcups' kan worden vervaardigd door middel van Deep Reactive Ion Etching 13.
    2. Cultuur gistcellen in het juiste kweekmedium (zie tabel 1) tot aan een optische dichtheid (OD) in het bereik van 0,2 en 0,8. Ultrasone trillingen van de cultuur van gistcellen om aggregaten te verwijderen.
    3. Invoegen gistcellen in 'eggcups' door centrifugeren. Voor centrifugeren wordt 4 ml gekweekte cellen in de geschikte OD toegevoegd aan de buis met 'eierdopjes. Na de eerste centrifugatie, schud de buis resuspendeer cellen die niet in de 'eierdopjes', terwijl cellen in de "eierdopjes 'niet gestoord. Zonder het openen van de buis, centrifuge opnieuw en twee keer herhaalt u deze stap. Dit garandeert de afzettingcellen uit de kweek in het lege microcavities en de vervullingspercentage verhogen.
      LET OP: Bij het werken met gist, is het raadzaam om voor te verwarmen de centrifuge aan de werkende temperatuur tijdens experimenten
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken en later voortgezet tot 12 uur. In dit geval, slaat het monster bij de werktemperatuur bedekken om verdamping te voorkomen.
    4. Plaats 'eierdopjes' in een microscoop houder en vul de houder met filter gesteriliseerd medium voor beeldvorming. Nu Spoel de cellen met hetzelfde medium tot de drijvende gistcellen doeltreffende wijze opgeheven. Zorg ervoor dat u de cellen in 'eierdopjes' verstoren tijdens het spoelen proces.
    5. Selecteer de 100X olie objectief en nauwkeurig scherp te stellen. Open de software en de parameters aan te passen. Voor kernsplijting gist, selecteert u de filters GFP en TxRed voor actine en myosine en stel de expositie tijd voor beide kanalen. Een typische overname bedraagt ​​3 sec.
      OPMERKING: Afhankelijk vande fluorofoor, type tagging en de set-up, belichtingstijd varieert voor andere systemen.
  2. C. elegans Embryo
    OPMERKING: Dit voorbeeld gebruikt C. elegans embryo 25-30 micrometer breed en 50-55 micrometer lang. Embryo's werden gekweekt zoals aangegeven in 25. Een eenvoudige visuele protocol over hoe om C. te manipuleren elegans is te vinden in 26. De observatie werd uitgevoerd met een omgekeerde fase contrast microscoop uitgerust met een 40X objectief air 0,55 NA.
    1. Bereid het oppervlak "eierdopjes 'zoals hierboven beschreven en 25 micrometer in diameter (zie tabel 1). In dit geval is het oppervlak niet te worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten.
    2. Cultuur van de C. elegans embryo in de juiste kweekmedium (zie tabel 1).
    3. Plaats embryo's in 'eierdopjes' door centrifugeren, zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 2,6-2,12) met behulp van ultrapuur water als kweekmedium.
      OPMERKING: Embryo's werden 'gedraagt' normaliter ultrazuiver water voor de duur van het experiment. U kunt ook gebruik maken van een fysiologische M9 buffer voor de lange termijn experimenten.
    4. Spoel het monster zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 2.14). Plaats de 'eierdopjes' in een microscoop houder. Selecteer het doel 40X lucht en zorgvuldig richten. Open de software en de parameters aan te passen. Selecteer een overname van 3 sec.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De 'eierdopjes' (EC) zijn een nieuwe high content-screening methodiek die de visualisatie van georiënteerde cellen en embryo's mogelijk maakt in een 3D omgeving. Daarnaast is een aantal cellulaire processen, die moeilijk te observeren standaard 2D (plat) culturen waar te nemen van deze nieuwe werkwijze. Figuur 1a toont een samenvatting van de procedure voor de EC microfabricatie (zie paragraaf 1 in het hierboven beschreven protocol ). De methode is eenvoudig, snel, efficiënt en zonder vereis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Replica vormstuk werd gebruikt om de 'eierdopjes' fabriceren. Het fabricageproces niet een schone kamer nodig; het is eenvoudig, hoewel enige oefening vereist zijn. Vooral vrijgeven van de PDMS stempel is de meest kritische stap om een ​​groot gebied van hoge kwaliteit "eggcups 'produceren. Daarom speciale zorg moet worden genomen in deze stap. Als deze stap herhaaldelijk faalt, overweeg dan om het plasma schoner parameters voorafgaand aan de silanisatie en plasma binding te optimaliseren. Onvoldoende s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen L. Brino (IGBMC High Content Screening faciliteit, Illkirch, Frankrijk) voor het verstrekken van ons met de anti-Giantin antilichaam, M. Labouesse Lab. voor C. elegans (IGBMC) en B. Séraphin Lab. voor gist (IGBMC), E. Paluch en A. Hyman voor TL HeLa-cellen (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) en JQ Wu (Ohio State University) voor kernsplijting gistcellen; A. Hoël en F. EVENOU voor experimentele hulp, C. Rick (IBMC, Straatsburg, Frankrijk) voor technische hulp, en JC Jeannot (Femto-st, Frankrijk) voor hulp bij het microfabrication. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het CNRS, de Universiteit van Straatsburg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale en de ci-FRC van Straatsburg.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ddH20 (ultrapuur)Millipore-Gebruik altijd vers water.
Parafilm (kunststoffolie)BemisPM-999Hecht Parafilm aan het laboratoriumblad met enkele waterdruppels en zorg voor een perfect vlakke oppervlakte.
FotomaskerSelba-http://www.selba.ch
Siliconen waferSiltronix-http://www.siltronix.com/
SU-8 fotoresistMicroChem2000 seriehttp://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
Werken in een afzuipkast is vereist; raadpleeg de gegevensbladen van de fabrikant voor meer informatie.
SU-8 ontwikkelaarMicroChem-http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
Werken in een afzuipkast is vereist; raadpleeg de gegevensbladen van de fabrikant voor meer informatie
2-propanolSigma-Aldrich19030http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA
Beschikbaar bij meerdere bedrijven.
Sigmacote (siliconiseringsreagens)Sigma-AldrichSL2-25MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR 
Schadelijk, werken in een afzuipkast is vereist; raadpleeg de gegevensbladen van de fabrikant voor meer informatie. 
Chlorot rimethylsilaan (TMCS)Sigma-Aldrich386529-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR  
TMCS veroorzaakt acute inhalatie- en dermale toxiciteit, en is zeer ontvlambaar (met mogelijkheid tot ontstekingsfeedback over aanzienlijke afstanden), daarom moet het in een afzuigkast worden gebruikt, weg van ontstekingsbronnen
NitrilhandschoenenKleenguard57372http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Beschikbaar bij meerdere bedrijven.
Glazen dekglasjes #0Knittel glassKN00010022593http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Zeer kwetsbaar. Voorzichtig hanteren.
Scherpe rechte pincettenSPI0WSSS-XDhttp://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml buisBD Falcon352070http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Beschikbaar bij meerdere bedrijven.
PDMSDow CorningSylgard 184 kithttp://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
De verpakking bevat zowel PDMS-basis als uithardingsmiddel. Vergelijkbare elastomeren zijn verkrijgbaar bij meerdere bedrijven.
Microscoop glasplaatjesDutscher100001http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Beschikbaar bij meerdere bedrijven.
DMEM hoog-glucose mediumFisher Scientific41965-039http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Rund kalfs serumSigma-AldrichC8056-500MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA
0.25% Trypsine-EDTAFisher Scientific25200-072http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&from

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548(2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019(2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D celkweekmicrocavity arrayreplicagietenPDMS eikoppjescelpositioneringorganelvisualisatiesluiting van de cytokinetische ringdelingsgistgepersonaliseerde geneeskunde

Gerelateerde artikelen