Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Summary

Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.

Abstract

Methoden voor het opsporen en monitoren mitochondriale buitenste membraan eiwit componenten in dierlijke weefsels zijn van vitaal belang om mitochondriale fysiologie en pathofysiologie bestuderen. Dit protocol beschrijft een techniek waarbij mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel immunologisch en door flow cytometrie geanalyseerd. Mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren ruggenmerg en onderworpen aan een snelle verrijkingsstap om myeline, een belangrijke verontreiniging van mitochondriale fracties bereid uit zenuwweefsel verwijderen. Geïsoleerde mitochondria worden dan gelabeld met een antilichaam van keuze en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam. Analyse door flow cytometrie controleert de relatieve zuiverheid van mitochondriale preparaten door kleuring met een mitochondriale specifieke kleurstof, gevolgd door detectie en kwantificering van eiwit immunologisch. Deze techniek is snel, kwantificeerbare en high-throughput, waardoor de analyse van honderden duizenden mitochondria per monster. Het is van toepassing op nieuwe p beoordelenroteins het mitochondriale oppervlak onder normale fysiologische omstandigheden en de eiwitten die in pathologie mislocalized kunnen worden bij dit organel. Belangrijk is, kan deze methode worden gekoppeld met fluorescentie-indicator kleurstoffen verslag over bepaalde activiteiten van mitochondriale subpopulaties en haalbaar is voor mitochondriën van het centrale zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) en lever.

Introduction

Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die meerdere rondes van kernsplijting en kernfusie ondergaan, worden vervoerd naar sites van hoge vraag naar energie en snel te reageren op fysiologische stimuli ^1. Aangezien meer en meer erkend dat mitochondriën in verschillende weefsels, zelfs verschillende cellulaire compartimenten, hebben verschillende functionele profielen nieuwe methoden nodig om deze verschillende mitochondriale subsets identificeren.

Microscopie verschaft een middel waarmee individuele mitochondria worden gevisualiseerd en de aanwezigheid van een eiwit op of in mitochondriën kan worden bepaald door immunoflu....

Protocol

Dieren die in deze studie werden in strikte overeenstemming met een protocol (N08001CVsr) door het Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Universite de Montreal (CRCHUM) Institutionele Commissie voor de bescherming van dieren goedgekeurd die de nationale normen zoals die door de Canadese volgt behandeld Raad over Animal Care (CCAC).

Bereid alle reagentia die nodig zijn om dit protocol (Tabel 1) uitvoeren. Alle andere details met betrekking tot uitrusting, voorraden en leveranciers zijn te vinden in de lijst van materialen.

Results

Mitochondriën afgeleid van rat ruggenmergen kunnen immunologisch met een antilichaam gericht op Mitofusin2 (MFN2), een eiwit betrokken bij de fusie van de buitenmembraan van mitochondria ^8. Na isolatie en labeling met een MFN2 specifiek antilichaam en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam, mitochondria worden verwerkt door flowcytometrie (figuur 1). Volgende data-acquisitie, worden monsters geanalyseerd met behulp van flowcytometrie analyse software, door eerst te visualiseren al.......

Discussion

Het wordt steeds duidelijker dat de mitochondriën zijn belangrijke spelers in zowel de normale fysiologie en ziekte. Terwijl immunoblotting kan bepalen welke eiwitten binnen mitochondria of het mitochondriale oppervlak in een bepaalde toestand, deze methode rapporten over het gemiddelde van de gehele populatie. Deze methode kan geen informatie over de relatieve abundanties van mitochondriale subpopulaties of subsets opleveren. Hoewel het is al eerder werd aangenomen dat alle mitochondriën zijn gemaakt gelijk, wordt het .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Charles River	Strain code 400	Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.
Dounce homogenizer	Kontes Glass Co.	885450-0022	Duall 22
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344057	Transparent, thin walled
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor and buckets	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Iodixanol, density gradient medium
Fatty acid free Bovine Serum Albumin	Sigma	A8806	Must be fatty acid free for mitochondria
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma	S9637
Rabbit anti-Mitofusin2 antibody	Sigma	M6319
Rabbit IgG	Jackson Immuno Research	011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Micro titer tube	Bio-Rad	223-9391	For sample acquisition by flow cytometry
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycin A	Sigma	A8874
LSR II flow cytometer	BD
BD FACSDiva Software	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Software used for analysis
BCA protein assay kit	Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS