Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Samenvatting

Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.

Samenvatting

Methoden voor het opsporen en monitoren mitochondriale buitenste membraan eiwit componenten in dierlijke weefsels zijn van vitaal belang om mitochondriale fysiologie en pathofysiologie bestuderen. Dit protocol beschrijft een techniek waarbij mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel immunologisch en door flow cytometrie geanalyseerd. Mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren ruggenmerg en onderworpen aan een snelle verrijkingsstap om myeline, een belangrijke verontreiniging van mitochondriale fracties bereid uit zenuwweefsel verwijderen. Geïsoleerde mitochondria worden dan gelabeld met een antilichaam van keuze en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam. Analyse door flow cytometrie controleert de relatieve zuiverheid van mitochondriale preparaten door kleuring met een mitochondriale specifieke kleurstof, gevolgd door detectie en kwantificering van eiwit immunologisch. Deze techniek is snel, kwantificeerbare en high-throughput, waardoor de analyse van honderden duizenden mitochondria per monster. Het is van toepassing op nieuwe p beoordelenroteins het mitochondriale oppervlak onder normale fysiologische omstandigheden en de eiwitten die in pathologie mislocalized kunnen worden bij dit organel. Belangrijk is, kan deze methode worden gekoppeld met fluorescentie-indicator kleurstoffen verslag over bepaalde activiteiten van mitochondriale subpopulaties en haalbaar is voor mitochondriën van het centrale zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) en lever.

Inleiding

Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die meerdere rondes van kernsplijting en kernfusie ondergaan, worden vervoerd naar sites van hoge vraag naar energie en snel te reageren op fysiologische stimuli ^1. Aangezien meer en meer erkend dat mitochondriën in verschillende weefsels, zelfs verschillende cellulaire compartimenten, hebben verschillende functionele profielen nieuwe methoden nodig om deze verschillende mitochondriale subsets identificeren.

Microscopie verschaft een middel waarmee individuele mitochondria worden gevisualiseerd en de aanwezigheid van een eiwit op of in mitochondriën kan worden bepaald door immunofluorescentie ^2. Echter, kwantitatieve analyse van deze methode is arbeidsintensief en is meer geschikt voor experimenten met geïmmortaliseerde of primaire cellijnen. De studie van individuele mitochondria uit weefsel aanzienlijk moeilijker en de meeste methoden niet mogelijk voor gemakkelijke identificatie van mitochondriale subsets gelijktijdig met de evaluatie van de mitochondriale functie ^3.

Om deze hindernis, een nieuwe werkwijze voor mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsels en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie immunolabel aanpakken ontwikkeld. Dit maakt de snelle detectie en kwantificering van eiwitten gelokaliseerd in de buitenste mitochondriale membraan, die aan microscopie opzichte analyse is veel minder arbeidsintensief en maakt de analyse van duizenden mitochondria in een enkel monster. Deze test kan worden toegepast op het lot en de relatieve hoeveelheid mitochondriaal buitenste membraaneiwitten die geacht constitutief aanwezig in de mitochondriën te volgen, de rekrutering van eiwitten aan het oppervlak mitochondriale of de detectie van proteïnen mislocalized naar de mitochondriën bij pathologische omstandigheden. Bovendien is de integratie van conventionele fluorescente indicator kleurstoffen maakt het gelijktijdige evaluatie van bepaalde aspecten van mitochondriale functie in verschillende mitochondrialesubpopulaties.

Protocol

Dieren die in deze studie werden in strikte overeenstemming met een protocol (N08001CVsr) door het Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Universite de Montreal (CRCHUM) Institutionele Commissie voor de bescherming van dieren goedgekeurd die de nationale normen zoals die door de Canadese volgt behandeld Raad over Animal Care (CCAC).

Bereid alle reagentia die nodig zijn om dit protocol (Tabel 1) uitvoeren. Alle andere details met betrekking tot uitrusting, voorraden en leveranciers zijn te vinden in de lijst van materialen.

Tabel 1 Buffer Samenstellingen.

1 Verzameling van Rat Spinal Cord

1. Diep verdoven van de rat (Sprague Dawley) met 4% isoflorane. Verifiëren verdoving door een gebrek aan reflex na knijpen van the voorpoot. Euthanaseren de ratten onthoofd via guillotine. Deze methode van euthanasie de voorkeur boven andere, die het ruggenmerg kan vervalsen.
2. Snijd de huid van de rug naar de ruggengraat bloot. Snijd de wervelkolom met been schaar net boven het schaambeen. Visualiseer de opening van de wervelkolom.
3. Plaats een injectiespuit 10 ml, met een 200 ul pipetpunt (verbonden via enigszins smelten boven vlam), gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), in de wervelkolom.
4. Spoel het ruggenmerg door een medium voldoende druk op de plunjer.
5. Als er bloed aanwezig is op het ruggenmerg, spoelen met PBS alvorens de volgende stap.
   OPMERKING: Deze methode is ook gevalideerd voor de hersenen en de lever. Als waaronder deze weefsels verzamelen halve hersenen van de rat gedood en een stuk lever gelijk gewicht aan het ruggenmerg. Alle andere stappen blijven identiek.

2 Isolatie van Spinal Cord Mitochondria (Aangepast van Vande Velde et al. ⁴⁾

1. Verzamel de gehele intact ruggenmerg en plaats in 5 ml glashomogenisator met 5 volumes (~ 3,25 ml) homogenisatiebuffer (HB). Voor een optimaal herstel van geïsoleerde mitochondriën, voeren alle stappen op het ijs of in een koude kamer. Homogeniseren weefsel met de hand tot er geen grote stukken weefsel blijven, ongeveer acht slagen. Plaats homogenaat in twee (2 ml) of drie (1,7 ml) microcentrifuge buisjes. Centrifuge 1300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een microcentrifuge benchtop.
2. Recover supernatant en plaats in een 5 ml ultracentrifuge buis. Voeg 750 ul (~ 0,5 volumes) HB aan de pellet met microcentrifugebuisje en voorzichtig resuspendeer de pellet. Herhaal centrifugeren en resuspensie stappen nog twee keer. Pool alle bovenstaande vloeistoffen (S1a en S1b) in dezelfde 5 ml ultracentrifuge buis boven. Deze stap dient om kleine vuil te verwijderen.
3. Centrifuge gepoolde S1 met behulp van een ultracentrifuge uitgerust met een swingende emmer rotof en centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
4. Blijf supernatant (S2) voor verdere verwerking als de cytosolische fractie van belang (bijvoorbeeld Western blot analyse). Resuspendeer de pellet (P2), het ruwe mitochondriale fractie in 4 ml HB + 50 mM KCl. Centrifuge 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in een swinging bucket rotor. Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de pellet (P3) in 800 ul HB.
   OPMERKING: Mitochondria worden gewassen met HB + 50 mM KCl alle niet-specifieke mitochondriën geassocieerde verontreinigingen.
5. In een nieuwe 5 ml ultracentrifuge buis, voeg precies 800 ul geresuspendeerde pellet (P3).
6. Om deze tube, 200 pl iodixanol (dichtheidsgradiënt medium), waardoor een eindconcentratie van 12% iodixanol maken. Meng de inhoud van de buis voorzichtig maar grondig door pipetteren met een P1000. Toevoeging van iodixanol eerste, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd pellet (P3) kan de voorkeur verdienen om grondig mengen te vergemakkelijken. Centrifugeren in een ultracentrifuge met een swinging bucket rotor bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
7. OPMERKING: Lever geen myeline bevatten en daarom is deze stap is niet nodig als alleen de lever wordt verwerkt. Echter, als de lever wordt gelijktijdig verwerkt met CNS mitochondriën, is het raadzaam om alle weefsels gelijk te behandelen.
8. Zuig de laag van myeline bovenaan de buis en verwijder de bovenstaande vloeistof. Pellet mogelijk los zit. Resuspendeer de pellet in 4 ml HB. Centrifugeer opnieuw bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 4 ml HB. Herhaal het centrifugeren en de bovenstaande vloeistof.
9. Resuspendeer de uiteindelijke pellet (P7) in 100-200 ul HB en overbrengen in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Deze steekproef bevat geïsoleerde mitochondriën.
10. Ga verder met eiwit kwantificering. Verdun monsters en de standaard kromme in 2% natriumdodecylsulfaat (SDS) passende solubilisatie van mitochondria duri waarborgenng eiwit kwantificering.

3 immunolabeling van Geïsoleerde Mitochondriën voor flowcytometrie

1. Voor elke kleuring mengsel te testen, pipet 25 ug geïsoleerde mitochondria in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Inclusief een ongekleurde monster in elk experiment; en voor elk antilichaam, moet u een monster voor de juiste isotypecontrole bevatten.
2. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C in een bench-top microcentrifuge.
3. Verwijder de supernatant en resuspendeer geïsoleerde mitochondria in 50 ul Buffer Mitochondria (M buffer) aangevuld met 10% vetzuurvrij BSA gedurende 15 min bij 4 ° C (blokkeringsstap).
   OPMERKING: Bij etikettering incubaties uitgevoerd in een koelkast bij 4 ° C.
4. Voeg primair antilichaam (konijn anti-MFN2, 20 ug per ml) aan de buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
   OPMERKING: Bepaal een optimale concentratie van elk antilichaam empirisch door titratie. Vanwege de variabiliteit in concentratie en / of purity, verschillende partijen van hetzelfde antilichaam van dezelfde fabrikant kan leiden tot verschillende resultaten; Daarom titratie nodig voor elke nieuwe partij antilichamen.
5. Spoel ongebonden primaire antilichaam: Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig in 200 pl M-buffer. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 50 ul M Buffer.
6. Voeg secundair antilichaam (ezel anti-konijnen IgG fycoerythrine (PE), 0,5 ug per ml) aan de buis en incubeer de monsters gedurende 30 min bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
7. Spoel ongebonden secundair antilichaam: Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 pl M-buffer. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 500 pi M Buffer.
8. Om ervoor te zorgen gebeurtenissen zijn in feite mitochondriën, vlek geïsoleerd mitochondria met eenmitochondriën specifieke fluorescente kleurstof gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Als kleuring van andere functionele parameters (mitochondriale transmembraanpotentiaal- of superoxide productie) gewenst is, ga dan naar stap 4 Zo niet, ga dan naar stap 5 voor de overname.
   OPMERKING: Het is belangrijk om te controleren of het emissiespectrum van het secundaire antilichaam is compatibel met dat van de functionele kleurstoffen. Bijvoorbeeld als controle mitochondriale zuiverheid met een commercieel kleurstof met spectrale eigenschappen die vergelijkbaar FITC en transmembraanpotentiaal met tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), een levensvatbare tweede antilichaam moet allofycocyanine (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Voeg compensaties controles, dat wil zeggen, een monster immunolabeled of gekleurd met een enkele fluorofoor, indien van toepassing.
9. Over te dragen aan een buis die geschikt zijn voor het laden doorstroomcytometer. (Voor de kleine steekproef, een microtiterplaat buis wordt geplaatst binnen 3 ml stromingscytometer buis te vergemakkelijken.) Houd monsters op ijs en onmiddellijk overgaan totstromingscytometer voor overname.

4 Het testen Mitochondriale transmembraanpotentiaal- en Mitochondriale superoxide productie door flowcytometrie

1. Controleer geïsoleerde mitochondria een intact transmembraanpotentiaal door kleuring met 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) ^5, in stap 3.8, gedurende 15 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Ter vergelijking van transmembraanpotentiaal tussen monsters en populaties, gebruik van lagere / niet-quenching concentratie van TMRM (1 tot 30 nM) meer geschikt kunnen zijn ^6.
   1. Als controle voor TMRM kleuring, vlek geïsoleerde mitochondria 100 nM TMRM in aanwezigheid van 100 uM carbonyl cyanide m-chloor fenyl hydrazine (CCCP), een mitochondriale ontkoppelaar die mitochondria zal depolariseren. De concentratie van CCCP vereist om de mitochondriën depolariseren kan lager zijn indien lagere concentraties kleurstof worden gebruikt.
2. Controleer of geïsoleerde mitochondria produceren mitochondriale superoxide door staining met een geschikt mitochondrial superoxide indicator ^7, ook in stap 3.8, gedurende 15 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
   1. Als controle voor mitochondriële superoxideproductie, vlek geïsoleerde mitochondria kleurstof in aanwezigheid van 10 uM Antimycin A, een remmer van complex III van de mitochondriale ademhalingsketen dat superoxide productie verhogen.

5 Verwerving en Analyse van immunolabeled Geïsoleerde Mitochondriën door flowcytometrie

1. Instrument opgezet: Switch voltages van lineair naar de modus te melden bij de analyse van geïsoleerde mitochondriën en stel spanningen vergemakkelijken (FSC: 450; SSC: 250). Controleer of gebeurtenissen verzameld FSC-A (stippellijn) modus als FSC-W (breedte) en FSC-H (hoogte), kunnen wambuizen (exclusief dwz twee gebeurtenissen, die door de detector tegelijkertijd ) in de analyse van de collectie post-data. Stel het aantal evenementen te innen tot 100.000. Verwerven compensatie controles, Indien van toepassing.
2. Data-acquisitie: Voor data-acquisitie, vermijd vortexen monsters. In plaats meng door zachtjes te tikken buis. Aanvankelijk events verzamelen bij een lage druk gedurende gating. Poort op de totale bevolking. Pas spanningen histogrammen bijgevolg meestal de piek van het ongekleurde monster is gelijk aan het tweede decennium (10 ^2). Zodra poorten zijn gevestigd, en monsters worden verwerkt, kan de druk worden overgeschakeld naar hoog.
3. Analyse: Visualiseer wambuizen door het plotten van FSC-W versus FSC. Identificeer borstrokken en wambuizen. Poort op singlets. Selecteer de mitochondriale populatie door gating op gebeurtenissen die positief zijn gekleurd met een mitochondriaal-selectieve kleurstof.
4. Bepaal achtergrond labeling van isotype controle. De isotype controlemonster, het percentage bepalen van de mitochondriale etikettering positief MFN2 antilichaampopulatie.

Resultaten

Mitochondriën afgeleid van rat ruggenmergen kunnen immunologisch met een antilichaam gericht op Mitofusin2 (MFN2), een eiwit betrokken bij de fusie van de buitenmembraan van mitochondria ^8. Na isolatie en labeling met een MFN2 specifiek antilichaam en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam, mitochondria worden verwerkt door flowcytometrie (figuur 1). Volgende data-acquisitie, worden monsters geanalyseerd met behulp van flowcytometrie analyse software, door eerst te visualiseren al...

Discussie

Het wordt steeds duidelijker dat de mitochondriën zijn belangrijke spelers in zowel de normale fysiologie en ziekte. Terwijl immunoblotting kan bepalen welke eiwitten binnen mitochondria of het mitochondriale oppervlak in een bepaalde toestand, deze methode rapporten over het gemiddelde van de gehele populatie. Deze methode kan geen informatie over de relatieve abundanties van mitochondriale subpopulaties of subsets opleveren. Hoewel het is al eerder werd aangenomen dat alle mitochondriën zijn gemaakt gelijk, wordt het ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ratten	Charles River	Stamcode 400	Volwassen (9 weken tot 18 weken) mannelijke of vrouwelijke ratten kunnen worden gebruikt voor het isolatieprotocol. Het gewicht van ratten is afhankelijk van geslacht en leeftijd (mannen tussen 300 tot 500 g en vrouwen tussen 200 tot 350 g) worden doorgaans gebruikt.
Dounce homogenisator	Kontes Glass Co.	885450-0022	Duall 22
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultracentrifugebuizen	Beckman Coulter	344057	Transparant, dunwandig
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor en emmers	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Iodixanol, dichtheidsgradiëntmedium
Vetzuurvrij bovien Serum Albumine	Sigma	A8806	Moet vetzuurvrij zijn voor mitochondriën
Natriumsuccinaat dibasic hexahydraat	Sigma	S9637
Konijn anti-Mitofusin2 antilichaam	Sigma	M6319
Konijn IgG	Jackson Immuno Research	011-000-003
Anti-Konijn IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Micro titerbuis	Bio-Rad	223-9391	Voor monsteropname door middel van flowcytometrie
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycin A	Sigma	A8874
LSR II flow cytometer	BD
BD FACSDiva Software	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Software gebruikt voor analyse
BCA-eiwitbepaling kit	Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford-test wordt niet aanbevolen omdat deze niet compatibel is met hoge concentraties SDS