We geven een in vitro muizen foetale lever erytroblast kweeksysteem dat de vroege en late stadia van terminal erytropoëse ontleedt. Dit systeem vergemakkelijkt de functionele analyse van specifieke genen in verschillende ontwikkelingsstadia.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muis foetale lever Cultuur System Doel Gene functies ontleden in de vroege en late stadia van Terminal Erytropoëse
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Erytropoëse omvat een dynamisch proces dat begint met erytroïde burst vormende eenheden (BFU-E), gevolgd door snel delende erytroïde kolonievormende eenheden (CFU-E). Na CFU-Es, cellen zijn morfologisch herkenbare en algemeen genoemd terminal erytroblasten. Een van de uitdagingen voor de studie van terminal erytropoëse is het ontbreken van experimentele benaderingen genfuncties ontleden chronologisch wijze. In dit protocol beschrijven we een unieke strategie genfuncties bepalen de vroege en late stadia van terminal erythropoiese. In dit systeem, muis foetale lever TER119 (volwassen erytroïde-cel marker) negatief erytroblasten werden gezuiverd en getransduceerd met exogene expressie van cDNA's of kleine hairpin RNAs (shRNAs) voor de genen van belang. De cellen werden vervolgens gekweekt in medium dat dan erythropoietine (Epo) hun voorlopercellen stadium behouden gedurende 12 uur terwijl het exogene cDNA's of shRNAs groeifactorente drukken. De cellen werden veranderd naar Epo medium na 12 uur tot celdifferentiatie en proliferatie induceren terwijl het exogene genetische materiaal al werden uitgedrukt. Dit protocol maakt analyse van genfuncties in het beginstadium van terminal erythropoiese. Te laat stadium terminal erytropoëse te bestuderen, werden de cellen onmiddellijk gekweekt in Epo medium na transductie. Zo werden de cellen reeds gedifferentieerd dat late stadium van terminal erytropoëse wanneer de getransduceerde genetisch materiaal werden uitgedrukt. Wij raden een algemene toepassing van deze strategie die zou helpen gedetailleerde gen functies in de verschillende stadia van de terminal erytropoëse begrijpen.
Inleiding
Erytropoëse is het proces van differentiatie van multipotente hematopoëtische stamcellen erytrocyten rijpen. Deze stapsgewijze werkwijze omvat de vorming van erytroïde burst vormende eenheden (BFU-E), de snel delende erytroïde kolonievormende eenheden (CFU-E) en morfologisch herkenbare erytroblasten 1,2. Terminal erythropoiesis van CFU-E stamcellen betreft sequentiële erytropoëtine-afhankelijke en onafhankelijke fasen 2,3. In het vroege stadium van terminal erytropoëse, Erytropoëtine (Epo) bindt aan zijn receptor op het celoppervlak en induceert een reeks stroomafwaartse signalering pathways die cel apoptose te voorkomen en snelle celdelingen en genexpressie 1,4. In de late fase van de terminal erytropoëse, erytroblasten ondergaan terminal celcyclus exit, chromatine en nucleus condensatie, en extrusie van de sterk gecondenseerde kernen 5.
Ons begrip van de terminalerytropoëse is sterk verbeterd in de afgelopen decennia, dat is grotendeels te danken aan het succesvolle gebruik van verschillende in vitro en in vivo muismodellen 6-9. Van deze modellen in vitro kweek van muizen foetale lever erythroblasten biedt vele voordelen, waaronder het gemak van cel zuivering, snelle proliferatie en differentiatie, en een dichter imiteren menselijke erytropoëse 10,11. In dit systeem kunnen grote aantallen erythroïde progenitorcellen uit muizen foetale levers gemakkelijk worden geïsoleerd door het enkele stap zuivering van TER119 (marker voor het rijpe erytroïde cellen) negatief erytroblasten. Tijdens de tweedaagse kweek van de erytroblasten, kan de differentiatie van deze cellen worden door een flowcytometrische analyse op basis van oppervlakte-expressie van de transferrine receptor (CD71) en TER119 antigen 12. Bovendien kan enucleatie van terminaal differentiatie erytroblasten worden gedetecteerd door een DNA maker (Hoechst 33342) 13. Ook het gezuiverde voorlopercellen kunnen genetisch gemodificeerd door exogene expressie van cDNA's of kleine hairpin RNAs (shRNAs) voor de genen van belang, waarvan de mechanistische studies van de functies van genexpressie op erytropoëse 11,13,14 vergemakkelijkt.
Anderzijds kan de snelle celgroei tempo een tweesnijdend zwaard zijn, aangezien het moeilijk is om genfuncties karakteriseren in verschillende stadia van terminal erythropoiese. In de meeste gevallen is het moeilijk te bepalen of een specifieke genfuncties in het vroege stadium van terminal erytropoëse sinds de tijd dat de cDNA's of shRNAs tot expressie, de cellen reeds vroeg stadium gepasseerd. Om dit probleem op te lossen, ontwikkelden we een uniek systeem voor de vroege en late stadia van de terminal erytropoëse ontleden. Bij de vroege fase van terminal erytropoëse genetisch gemodificeerde TER119 negatieve erythroblasten werden gekweekt in Epo-medium maar bevat stamcel factor (SCF), IL-6 en FLT3ligand hun progenitor status te behouden en laat de getransduceerde cDNAs of shRNA expressie 13. De cellen werden veranderd naar Epo bevattende medium na 12 uur tot celproliferatie en differentiatie induceren. Op deze manier, wanneer de cellen beginnen te differentiëren, de getransduceerde cDNA's of shRNAs reeds expressie. Voor het late stadium van terminal erytropoëse, TER119 negatieve erythroblasten werden in Epo bevattend medium onmiddellijk na transductie. Daarom kan men analyseren de functies van de genen van belang in het late stadium van terminal erythropoiese. Samengevat zou een brede toepassing van deze regeling te ontleden genfuncties in verschillende stadia van terminal erythropoiese.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De in dit protocol beschreven experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het bepaalde bij Northwestern University Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen en voorschriften.
1 Bereiding van kweekmedium
- Bereid fibronectine oplossing. Voeg 1 ml water toe aan een injectieflacon van menselijke fibronectine (1 mg). Laat de oplossing in weefselkweek kap voor 30 minuten zonder schudden. Breng de totale vloeistof 50 ml PBS tot een eindconcentratie van 20 ug / ml te maken en meng voorzichtig. Voeg de fibronectine oplossing zoet voor het bekleden van de plaat (zie hieronder).
- Bereid 50 ml van Epo-vrij medium (SCF medium). Combineer de genoemde ingrediënten in tabel 1. Het medium kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand Wanneer gemaakt.
- Bereid 50 ml Epo bevattend medium. Combineer de genoemde ingrediënten in Tabel 2. Het medium kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand Wanneer gemaakt.
2 fibronectine gecoate plaat
- Voeg 1 ml fibronectine oplossing in elk putje van een 6-well plaat (of 0,5 ml aan elk putje van een 12 putjes plaat). Laat de plaat in de weefselkweek kap 1 uur.
- Spoel putten met steriel water twee keer en de lucht droog de plaat.
- Wikkel de plaat en op te slaan in de koude kamer bij 4 ° C.
3 Zuivering van foetale lever erytroblasten
OPMERKING: Gebruik foetale levers van E13 naar E15 getimede zwangere muizen (C57BL / 6). E13.5 levers voorkeur om de opbrengst van CFU-E voorlopers maximaliseren. Om de getimede zwangere muizen verkrijgen, werden 6-8 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen geplaatst in een kooi (meestal een man met een of twee vrouwtjes). Vrouwelijke vaginale plugs werden de volgende ochtend gecontroleerd om te bepalen of de dekking succesvol was. De eerste dag van de zwangerschap was de dag nadat de stekker werd gevonden.
- Voorbereiding van de totale foetale levercellen
- Offer de mouse door CO 2 inademing en cervicale dislocatie. Spray de buik met 70% ethanol voor desinfectie. Open de buik met het ontleden van een schaar om de baarmoeder te verwijderen. Was de baarmoeder in 1x PBS.
- Ontleden de foetussen onder steriele omstandigheden met behulp van een weefselkweek kap en geautoclaveerd gereedschappen en was in 1x PBS.
- Ontleden de foetale levers van de foetussen. Houd het lichaam van de foetus met een pincet, trek de foetale lever (roze van kleur) uit de buurt van het lichaam met een andere tang. Reinig de foetale lever met de tang om de geassocieerde fibrotische weefsels te verwijderen. Plaats alle foetale levers in vers 1 x PBS bevattende 10% foetaal runderserum.
- Mechanisch verstoren foetale levers door en neer te pipetteren.
- Filter de celsuspensie door een 40 um cel zeef in een 50 ml conische buis. Pellet de cellen bij 800 g gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml PBS met 10% FBS (ongeveer 8 E13.5 foetale leverper ml).
- Zuivering van TER119 Negatieve erytroblasten
- Blokkeer de cellen met rat IgG (0,2 mg / ml) op ijs gedurende 15 minuten.
- Zonder wassen of centrifugeren, voeg gebiotinyleerd anti-TER119 antilichaam aan de celsuspensie (1 ug / ml). Incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
- Was in 1x PBS met 10% FBS (01:10) en gecentrifugeerd bij 800 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in 1 ml PBS met 10% FBS.
- Voeg 75 ul streptavidine geconjugeerd met magnetische deeltjes en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Voeg het volume op 2,5 ml met PBS dat 10% FBS. Breng de celsuspensie in een 5 ml polypropyleen buisje met ronde bodem.
- Plaats de buis in een magnetische celsortering inrichting en incubeer gedurende 10 minuten. TER119 positieve cellen hechten aan de zijkant van de buis. De losse TER119 negatieve erytroblasten zal in de suspensie blijven.
- Giet de celsuspensie in een nieuwe 5 ml polypropyleen buisje met ronde bodem.
- Herhaal de stappen 3.2.6 en 3.2.7 van de resterende TER119 positieve cellen te verwijderen.
- Pellet de cellen bij 800 g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml PBS dat 10% FBS en tel levende cellen met trypaanblauw.
4 Transduction met Virussen Encoding cDNA of shRNA
- Plate het gezuiverde TER119 negatieve foetale levercellen bij 3-5 x 10 5 / putje in een fibronectine gecoate 12-well plaat (Pas het aantal cellen of een andere plaat).
- Polybreen Naar een eindconcentratie van 10 ug / ml virale transductie te vergemakkelijken. Spin infecteren van de cellen met lentivirussen of retrovirussen, codeert cDNA of shRNA bij 800 xg gedurende 1-1,5 uur bij 37 ° C.
5. cultuur van de getransduceerde TER119 Negative Mouse Fetal Liver erytroblasten
- Om genen te testen in een vroeg stadium van terminal erytropoëse (figuur 1 stippellijnen).">
- Cultuur de getransduceerde cellen in Epo vrij medium (SCF medium) gedurende 12 uur om de expressie van het getransduceerde genen en onderhoud van de progenitor staat toe.
- Centrifugeer de cellen bij 800 g gedurende 5 minuten. Zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml Epo bevattend medium in elk putje van een 12-well plaat.
- Na cultuur voor 24 of 48 uur, oogsten van de cellen voor verdere testen.
- Test genfuncties in het late stadium van terminal erytropoëse (figuur 1 getrokken lijnen).
- De cultuur van de getransduceerde cellen direct in Epo bevattend medium.
- Na cultuur voor 24 of 48 uur, oogsten van de cellen voor de verdere analyses.
6 kleuring van de gekweekte foetale lever Cellen voor Flowcytometrische Analyse
- Wassen en resuspendeer de cellen in 1x PBS. Oogst 2 x 10 5 gekweekte cellen voor flowcytometrische analyse.
- Incubatede cellen met fluorofoor geconjugeerde antilichamen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Om differentiatie testen gebruikt APC geconjugeerd anti-CD71 en PE geconjugeerd anti-TER119. Om enucleatie testen gebruikt Hoechst 33342 vlek naast de andere antilichamen.
- Was de cellen met 1x PBS. Resuspendeer de cellen in 0,5 ml PBS met 1% FBS en propidium jodide (PI) (1 ug / ml) om de dode cellen te kleuren en uitsluiten van analyse.
- Gedrag stroom cytrometric analyse. Analyseer enkele kleur gebeitst en onbesmet controle cellen eerst voor aanpassing en compensatie van de flowcytometer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 schetst de experimentele strategieën. Het protocol bestaat uit twee onafhankelijke voorwaarden voor targeting naar de functies van de signaalmoleculen in de vroege en late stadia van terminal erythropoiese. TER119 negatieve foetale lever erythroblasten werden gezuiverd uit E13.5 muis foetus. Flow cytometrische analyse van foetale lever erythroïde cellen voor en na zuivering aangetoond dat de zuivering werd efficiënt (Figuren 2A en 2B). Bij de vroege fase van te...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren we een uniek systeem om chronologisch te analyseren muis foetale lever terminal erytropoëse. Door de toepassing van verschillende kweekomstandigheden, we met succes ontleed terminal erytropoëse in de vroege en late stadia. Dit is bijzonder belangrijk om de mechanismen van genen met meerdere functies bepalen. Bijvoorbeeld, Rac GTPases spelen een belangrijke rol in verschillende stadia van terminal erythropoiese. Remming van Rac GTPases in het beginstadium van terminal erytropoëse invloeden celdifferentia...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door NIH R00HL102154, en een American Society of Hematology geleerde award naar P Ji.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicilline-Streptomycine oplossing | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Muis FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Muis Recombinant Interleukine-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectine | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovien Serum Albumine (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietine(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3.000 U/ml stock |
| Streptavidine deeltjes Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropyleen ronde bodembuis, 5 ml | FALCON | 352063 |
Referenties
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
