Methodenartikel

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

DOI:

10.3791/51899

⸱

15 september 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, University of California, San Diego, 2School of Biomedical Engineering and Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, 3Department of Anesthesiology, University of California, San Diego, 4VA San Diego Healthcare System

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Axonale transport van BDNF, een neurotrofe factor, is van cruciaal belang voor de overleving en functie van verschillende neuronale populaties. Sommige degeneratieve stoornissen worden gekenmerkt door verstoring van axonale structuur en functie. We toonden de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BDNF speelt een belangrijke rol in diverse aspecten van neuronale overleving, differentiatie en functie. Structurele en functionele tekorten in axonen worden steeds meer gezien als een vroeg kenmerk van neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Huntington (HD). Vooralsnog onduidelijk is het mechanisme (s) van die axonale letsel wordt veroorzaakt. We meldden de ontwikkeling van een nieuwe techniek om biologisch actieve produceren monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) die kunnen worden gebruikt axonaal transport van BDNF sporen. Quantum dot-gelabeld BDNF (QD-BDNF) werd geproduceerd door het vervoegen van quantum dot 655 tot mBtBDNF. Een microfluïdische apparaat werd gebruikt om de axonen van neuron cellichamen isoleren. Toevoeging van QD-BDNF het axonale compartiment toegestane levende beeldvorming van BDNF transport in axonen. We hebben aangetoond dat QD-BDNF verhuisde in wezen uitsluitend retrogradely, met zeer weinig pauzes, op een bewegende snelheid van ongeveer 1,06 um / sec. Dit systeem kan worden gebruikt om me onderzochtchanisms van verstoorde axonale functie AD of HD, en andere degeneratieve aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen waarvan de lange en vaak zeer uitgewerkte processen zijn essentieel voor het opzetten en onderhouden van de structuur en functie van neurale circuits. Het axon speelt een vitale rol bij het uitvoeren vracht naar en van synapsen. Eiwitten en organellen gesynthetiseerd cel soma moeten worden getransporteerd door axonen in de presynaptische terminal bereikt neuronale functie ondersteunen. Dienovereenkomstig ontvangen signalen bij het distale axons moeten worden getransduceerd en overgebracht naar de soma. Deze processen zijn essentieel voor neuronale overleving, differentiatie en onderhoud. In dat axonaal transport in sommige neuronen worden uitgevoerd door middel afstanden meer dan 1000 maal de diameter van het cellichaam, is de mogelijkheid gemakkelijk beoogd dat zelfs kleine tekorten aanzienlijk kunnen beïnvloeden neuronale en circuitfunctie.

Hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), een lid van de neurotrofine familie van groeifactoren, aanwezig in ma isny gebieden van de hersenen, inclusief de hippocampus, cerebrale cortex en basale voorhersenen. BDNF speelt een cruciale rol in cognitie en geheugenvorming door ondersteuning van de overleving, differentiatie en functie van neuronen die deelnemen aan cognitieve circuits. BDNF bindt aan zijn receptor, het tyrosine kinase TrkB bij het axon terminal waar activeert TrkB-gemedieerde signaalwegen inclusief mitogeen geactiveerde proteïne kinase / extracellulair signaalgereguleerde proteïne kinase (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) en fosfolipase C-gamma (PLCy). De eiwitten die deelnemen aan deze signaalroutes verpakt op endocytische vesiculaire structuren om de BDNF / TrkB signalering endosoom 1-6 die vervolgens retrograde getransporteerd naar de neuronale soma vormen.

De microfluïdische cultuur kamer is een zeer nuttig platform voor het bestuderen van axonale biologie onder normale omstandigheden als in de setting van letsel en ziekte 7,8. Door het isoleren van axonenuit de cel lichamen, heeft het apparaat mag een tot vervoer specifiek bestuderen in axonen 8-10. De PDMS microfluïdische gebaseerde platforms met 450 urn microgroove belemmeringen die in deze studie werden commercieel aangeschaft (zie Materialen tabel). Om BDNF vervoer te onderzoeken, ontwikkelden we een nieuwe technologie om monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) produceren. We hebben geprofiteerd van de biotine acceptor peptide, AP (ook bekend als AviTag). Het is een 15 aminozuursequentie die een lysine-residu die specifiek een biotine kan worden geligeerd door het Escherichia coli enzym biotine ligase, BirA bevat. We gefuseerd de AviTag de C-terminus van het muis vooraf proBDNF cDNA door PCR (Figuur 1A). Het construct werd gekloneerd in de zoogdier expressievector pcDNA3.1 myc-vector zijn. We gekloneerd ook BirA bacterieel DNA in de pcDNA3.1 myc-vector zijn. De twee plasmiden werden transiënt gecotransfecteerd in HEK293FT cellen beide eiwitten tot expressie. BirA gekatalyseerde de ligatie van biotin het bijzonder de lysine in de AviTag bevinden bij de C-terminus van BDNF bij een 1: 1 verhouding produceren monobiotinylated BDNF monomeer. Gebiotinyleerde, volwassen BDNF met een molecuulgewicht van ~ 18 kDa werd teruggewonnen en gezuiverd van media met Ni-hars (figuur 1C). De biotinylering van BDNF was voltooid, zoals beoordeeld door het onvermogen om ongemodificeerde BDNF detecteren door immunoblotting (figuur 1D). Streptavidine geconjugeerde quantum dots, QD 655, werden gebruikt om mBtBDNF labelen naar QD-BDNF maken. De aanwezigheid van de AviTag niet interfereert met de activiteit van BDNF als het mBtBDNF kon gefosforyleerd TrkB (figuur 1E) activeren en stimuleren uitgroei van neurieten (figuur 1F) voor zover van recombinant humaan BDNF (rhBDNF). Immunokleuring aangetoond dat QD-BDNF colocalized met TrkB in de hippocampus axonen, wat aangeeft dat QD-BDNF is bioactieve (figuur 1G). Om het transport BDNF bestuderen, werd QD-BDNF toegevoegd aan distale axon compartiment vanmicrofluidic kweken die E18 rat hippocampale neuronen (Figuur 2A). QD-BDNF retrograde transport binnen axonen werd gevangen genomen door real-time live imaging van de rode fluorescerende tag (Ondersteunende video's S1, S2). Door het analyseren van de kymograaf gegenereerd, werd QD-BDNF waargenomen retrogradely worden vervoerd bij een bewegende snelheid van ongeveer 1,06 um / sec (Figuur 3A). GFP of mCherry-gelabeld BDNF zijn gebruikt om axonale verkeer van BDNF te volgen. De belangrijkste nadelen zijn dat ze niet helder genoeg voor single molecule studies. Ook de aanwezigheid van zowel anterograde en retrograde BDNF bewegingen maakt het moeilijk te beoordelen of de retrograde getransporteerd BDNF was een neurotrophin / receptorcomplex.

In deze video tonen we de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken. De ultrabrightness en uitstekende fotostabiliteit van quantum dots makes het mogelijk om lange termijn volgen van BDNF transport voeren. Deze technieken kunnen worden benut om de studies van axonale functie te verbeteren in AD, HD, en andere neurodegeneratieve aandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgische en dier procedures worden uitgevoerd strikt volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Alle experimenten met het gebruik van dieren worden goedgekeurd door UCSD Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1 plasmideklonering, Expressie en zuivering van Mono-gebiotinyleerd BDNF (mBtBDNF)

OPMERKING: Construct pre-proBDNFavi en BirA cDNA in pcDNA3.1 vector en coexpress in HEK293FT cellen 10. Zuiver mBtBDNF gebruik van Ni-NTA korrels volgens eerder gepubliceerde werkwijze voor het produceren volwassen en biologisch actieve monobiotinylated nerve growth factor (mBtNGF) 10.

2 Voorbereiding van Microfluidic Chambers

Microfluïdische neuron kweken apparaat maakt het mogelijk fluïdisch isoleren axonen van neuron cellichamen. Assembleren kamers met vers gecoate dekglaasjes vlak voor elke dissectie. Microfluïdische kamers gebruiktIn dit protocol zijn de winkel heb gekocht (zie materialen en tafel apparatuur's). Handwas en hergebruikt in de winkel gekochte kamers tot 5-6x.

  1. Handwas microfluïdische kamers in 1% Alconox. Spoel driemaal met Milli-Q water gedurende 30 minuten elk. Handwas kamers weer in 70% ethanol.
  2. Indeling kamers te drogen op Parafilm in de laminaire stroming kap. Uitstralen en steriliseren beide zijden van de kamers voor 20 min onder UV. WINKEL gesteriliseerd kamers in een steriele 15 cm schaal met Parafilm afgesloten bij kamertemperatuur.
  3. Plaats 24 x 40 mm nummer 1 dekglaasjes in een glazen container. Week de dekglaasjes in 35% zoutzuur overnachten op een rotator. Op de volgende dag, spoel de dekglaasjes driemaal gedurende 30 min elk met water.
  4. Steriliseer de dekglaasjes voor een door dompelen elk dekglaasje in 100% ethanol en vlammen op een Bunsen brander. Bewaar droge dekglaasjes in een steriele petrischaal en bewaar deze op kamertemperatuur tot coating.
  5. Lag out de dekglaasjes in een 15 cm kweekschaal. Coat elk dekglaasje met 0,7 ml 0,01% poly-L-lysine (PLL) en incubeer in de kap bij kamertemperatuur.
  6. Na 1 uur, spoel de dekglaasjes driemaal met steriel water. Droog coverslips met vacuum en plaats elke dekglaasje in een 6 cm cultuur schotel.
  7. Om de microfluïdische kamer monteren, plaatst u de kamer met microgroove kant aan de onderkant op de PLL gecoat dekglaasje voorzichtig de microgroeven niet aan te raken. Voorzichtig ingedrukt de kamer met een pipet tip om ervoor te zorgen de kamer werd goed afgesloten.

3 Dissectie van neuronale Cultuur en plaat op Chambers

  1. Plaats twee E17-E18 ratten hippocampus (een brain) ontleed in een 15 ml conische buis met 2 ml dissectie buffer (HBSS, zonder calcium, geen magnesium, met 1% pen / strep en 10 mM HEPES. Spoel de weefsels met 3x 5 ml dissectie buffer elke keer. Verwijder de dissectie buffer zoveel mogelijk en voeg 900 ul vers dissection buffer.
  2. Om het weefsel te verteren, voeg 100 ul van 10x trypsine (2,5%) in de dissectie buffer 1x werkconcentratie maken. Plaats de conische buis in een 37 ° C waterbad. Na 10 min digestie, voeg 100 ul van 10 mg / ml DNase I bij een eindconcentratie ongeveer 1 mg / ml.
  3. Met een brand gepolijste Pasteur pipet glas voorzichtig vermaal het weefsel met en neer te pipetteren 5-10x. Direct na tritureren, doven de trypsine met 2 ml plaatmedium (Neurobasal met 10% FBS, 2 mM GlutaMax, 2% B27).
  4. Laat het monster in de kap 5 minuten om vuil van de weefsels laten beneden naar de bodem. Verwijder voorzichtig 2 ml supernatans in een schone steriele 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Resuspendeer de pellet in 50 ul plating media
  5. Tel de cellen met hemocytometer. Load 15-20 pi celsuspensie (~ 40.000 cellen) in een compartiment van de microfluïdische kamer. Plaats de kamerin de incubator gedurende 10 minuten om de cellen te hechten aan het dekglaasje. Na 10 min, voeg meer plating media te vullen beide compartimenten van de kamer.
  6. Op de tweede dag van dissectie, volledig vervangen van de beplating media onderhoudsmedium (Neurobasal met 2 mM GlutaMax, 2% B27) in zowel het cellichaam en axon compartiment. Axonen van de hippocampus neuronen beginnen om de microgroeven steken in dag 3 en bereikt de axon compartiment tussen dag 5-7. Gedurende deze periode, vervangt de helft van de kweekmedia met vers onderhoudsmedium elke 24 ~ 48 uur.

4 Axonale Vervoer van QD-BDNF

  1. Voorafgaand aan wonen beeldvorming van QD-BDNF axonale transport, afbrekende BDNF van zowel het cellichaam en axon compartimenten van de microfluïdische kamer door grondig spoelen beide compartimenten met BDNF-vrij, serum vrije Neurobasal media elke 30 min gedurende 2 uur.
  2. Tijdens BDNF uitputting, bereiden de QD-BDNF conjugaten. Meng 50 nM van mono-gebiotinyleerde BDNF dimeer met 50 nM QD655-streptavidine conjugaten in Neurobasal media en incubeer op ijs gedurende 60 minuten.
  3. Verwijder media in de axon compartiment en voeg 300 ul QD-BDNF met een eindconcentratie van 0,25 nM gedurende 4 uur bij 37 ° C. De verspreidende van QD-BDNF in het cellichaam compartiment minimaliseren, is het zeer belangrijk om altijd een hoger media in het cellichaam compartiment onderhouden dan in de axon compartiment. Afwassen ongebonden QD-BDNF na incubatie voor live-imaging.
  4. Uitvoeren van live-imaging van QD-BDNF transport met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met een 100X olie objectief. Verwarm de reikwijdte en de klimaatkamer verbonden aan een constante temperatuur (37 ° C) en CO2 (5%). Gebruik een set van Texas rood excitatie / emissie kubussen de QD655 signaal visualiseren.
  5. Verwerven en vastleggen van time-lapse beelden binnen het midden axonen met de snelheid van 1 frame / sec voor een totaal van 2 min met behulp van een CCD-camera. Gebruik microgroeven zonder axonen that hebben geen QD en dus geen signaal als controle voor infiltratie.
  6. Analyseer BDNF transport met behulp van een software voor beeldanalyse of NIH ImageJ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Productie en zuivering van biologisch actieve Mono-gebiotinyleerde BDNF

De expressievector van BDNF gefuseerd met een sequentie AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) werd gecre volgens een eerder gepubliceerd protocol 10. De molecuulmassa van de volledige lengte fusie-eiwit werd voorspeld ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated rijpe BDNF met een voorspelde molecuulmassa van 18 kDa (Fi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie rapporteren we de ontwikkeling van een nieuwe techniek om biologisch actieve produceren monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) die kunnen worden gebruikt axonaal transport van BDNF sporen. Door het combineren van het eiwit aan quantum dot streptavidine, en met behulp van een microfluïdische kamer, de methode maakt het mogelijk om axonale transport van BDNF in primaire neuronen met 'single molecule gevoeligheid, in real-time en met ruimtelijke en temporele resoluties te detecteren. De instrumenten hierin gebr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag Yue (Pauline) Hu, Rachel SINIT bedanken voor hun technische bijstand. Het onderzoek wordt ondersteund door NIH-subsidie ​​(PN2 EY016525) en door de financiering van het syndroom van Down Research and Treatment Foundation en de Larry L. Hillblom Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Platinum pfx DNA polymerase Invitrogen11708021
EcoRI FermentasFD0274
BamHI FermentasFD0054
HEK293FT cellsInvitrogenR70007
DMEM-high glucose mediaMediatech10-013-CV
D-biotin SigmaB4639
TurboFect FermentasR0531
PMSF  SigmaP7626
AprotininSigmaA6279
Ni-NTA resinsQiagen30250
Protease inhibitors cocktailSigma S8820
Silver staining kit G-Biosciences786-30
Human recombinant BDNFGenentech
Microfluidic chambersXonaSND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips VWR48393-060
Poly-L-Lysine Cultrex3438-100-01
HBSSGibco14185-052
DNase IRoche10104159001
TrypsinGibco15090-046
Neurobasal Gibco21103-049
FBS Invitrogen16000-044
GlutaMax Invitrogen35050-061
B27  Gibco17504-044
QD655-streptavidin conjugatesInvitrogen Q10121MP
anti-Avi tag antibodyGenScriptA00674
streptavidin-agarose beads Life Technology SA100-04
Trichloroacetic acidSigmaT6399
HRP-streptavidin Thermo ScientificN100
anti-pTrkB antibodya generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibodyBD Science610101

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
  2. Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
  3. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
  4. Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
  5. Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).
  6. Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
  7. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
  8. Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  9. Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
  10. Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
  11. Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
  12. Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
  13. Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
  14. Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
  15. Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
  16. Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
  17. Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
  18. Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BDNF transportQuantum Dot labelingmicroflu dische kamerlive imagingfluorescentiemicroscopieretrograd transportQuantum Dot BDNFhippocampale neuronen

Gerelateerde artikelen