Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters

Summary

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Abstract

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Introduction

De meerderheid van de nieuwe hiv-infecties wereldwijd ontstaan ​​door heteroseksuele overdracht, met vrouwen die 47% van de nieuwe infecties in 2011 (UNAIDS ^1). Inzicht in de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), een van de belangrijkste toegangspoort portals voor HIV en andere seksueel overdraagbare ziekteverwekkers, is van groot belang op de weg naar het vinden van efficiënte strategieën om infectie te voorkomen. Immuunreacties op de genitale slijmvliezen zijn duidelijk uniek en verschillen van die gemeten in het perifere bloed ^2. Echter, de huidige kennis van het immuunsysteem dynamiek de FGT hoogstens beperkt. Tot op heden, hebben de studies v....

Protocol

Ethiek verklaring: Het onderzoek ethiek van bestuur van zowel de Universiteit van Manitoba en Kenyatta National Hospital / Universiteit van Nairobi keurde deze studie en schriftelijk toestemming is verkregen van alle deelnemers aan de studie.

1. Voorbereiding van de media en CMC Collection Tubes

1. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na ₂ HPO _4, 1,47 mM KH _{2PO 4).} Autoclaaf voor steriliteit. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
2. Pre-monster 5 ml PBS in 50 ml Falcon buis (een per monster af te halen) en bewaar....

Results

Multiparameter flowcytometrie is een krachtig hulpmiddel om de fenotypes en functies van celondergroepen ontleden in voorheen uncharacterized weefsels. Analyse van CMC monsters kunnen informatie over zowel lymfocyten en monocyten populatie opleveren met de juiste gating strategieën.

Een representatieve CMC gating strategie, vergeleken met een PBMC profiel, weergegeven in figuur 2. Het FSC-A versus FSC-H plot maakt de uitsluiting van cel doubletten, die veel voorkomen in CMC .......

Discussion

Gezien de grote hiaten in de kennis met betrekking tot de immuniteit bij de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), kan fenotypische analyse van CMC's een breed scala aan inzichten in meerdere lymfocytenpopulaties op de baarmoederhals. In combinatie met proteomics analyse en viral load metingen in cervicale lavage, kan immuniteit voor seksueel overdraagbare aandoeningen (soa) s en andere ziekteverwekkers worden ontleed in verschillende populaties.

Technische overwegingen - CMC:

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50 ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5 ml tube Eppendorf	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant