Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters

Samenvatting

Het gebruik van cytobrush-sampling om lymfocyten en monocyten uit de endocervix te verzamelen is een minimaal invasieve techniek die monsters levert voor analyse van de immuniteit van het vrouwelijke genitale kanaal. In dit protocol beschrijven we het verzamelen van cytobrush-monsters en het isoleren van immuuncellen voor flowcytometrie-analyses.

Samenvatting

Ondanks het belang van mucosale pathogenen (inclusief HIV) voor de volksgezondheid, is er relatief weinig bekend over mucosale immuniteit, met name in het vrouwelijk genitale kanaal (FGT). Omdat heteroseksuele overdracht nu het dominante mechanisme van HIV-overdracht vertegenwoordigt, en gezien de voortdurende verspreiding van seksueel overdraagbare infecties (soa's), is het van cruciaal belang om de wisselwerking tussen gastheer en pathogeen in het genitale slijmvlies te begrijpen. De aanzienlijke kennisgapen rond FGT-immuniteit zijn gedeeltelijk te wijten aan de moeilijkheid om succesvol mucosale monsters te verzamelen en te verwerken. Om studies met voldoende steekproefomvang mogelijk te maken, moeten verzameltechnieken minimaal invasief en efficiënt zijn. Daartoe is een protocol voor het verzamelen van cervicale cytoborstelmonsters en het daaropvolgende isoleren van cervicale mononucleaire cellen (CMC) geoptimaliseerd. Met behulp van ex vivo flowcytometrie-gebaseerde immunofenotypisering is het mogelijk om CMC-lymfocyt/monocytepopulatiefrequenties en -fenotypen nauwkeurig en betrouwbaar te kwantificeren. Deze techniek kan worden gekoppeld aan het verzamelen van cervicovaginale lavasje (CVL), dat oplosbare immuunbemiddelaars bevat, waaronder cytokinen, chemokinen en anti-proteasen, die allemaal kunnen worden gebruikt om de anti- of pro-inflammatoire omgeving in de vagina te bepalen.

Inleiding

De meerderheid van de nieuwe hiv-infecties wereldwijd ontstaan ​​door heteroseksuele overdracht, met vrouwen die 47% van de nieuwe infecties in 2011 (UNAIDS ^1). Inzicht in de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), een van de belangrijkste toegangspoort portals voor HIV en andere seksueel overdraagbare ziekteverwekkers, is van groot belang op de weg naar het vinden van efficiënte strategieën om infectie te voorkomen. Immuunreacties op de genitale slijmvliezen zijn duidelijk uniek en verschillen van die gemeten in het perifere bloed ^2. Echter, de huidige kennis van het immuunsysteem dynamiek de FGT hoogstens beperkt. Tot op heden, hebben de studies van het mucosale immuunsysteem milieu grotendeels gericht op de darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT), waar het duidelijk is geworden dat de vroege gebeurtenissen in mucosale weefsels na infectie hebben een sterke invloed op latere progressie van de ziekte ^3,4. Monsters van het genitale slijmvlies vormt een grote uitdaging en is ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk voor de lack aan inzicht in de immunologie van de FGT. Oplossen van de puzzel van het immuunsysteem dynamiek tussen gastheer en pathogeen in het kader van de verschillende milieu dat de FGT vereist efficiënte methoden voor het verzamelen en analyseren van monsters van deze locatie.

De FGT is verdeeld in twee delen: het bovenste voortplantingsorganen dat de eileiders, endometrium en endocervix en de onderste luchtwegen die de ectocervix bevat en de vagina bevat (beoordeeld door Kaushic et al. ^5). Het is nog onduidelijk wat de relatieve bijdrage van deze verschillende locaties is voor HIV-infectie, maar aangenomen wordt dat beide sites kunnen bijdragen aan HIV ingang ^6. T-cellen vertegenwoordigen 40-50% van de leukocyten in de bovenste en onderste voortplantingsstelsel, terwijl macrofagen omvatten ongeveer 10% (beoordeeld in Rodriguez-Garcia et al. ^2). T-cellen kunnen worden gedetecteerd in de vagina, cervix en endometrium. Macrofagen sterker localized in het endometrium en het myometrium bindweefsel dan de baarmoederhals, hoewel zij kunnen worden gedetecteerd in beide weefsels. Tenslotte kan plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) en Langerhans-cellen worden gedetecteerd in FGT weefsels. Het fenotype en verhoudingen van immune populaties en de gevoeligheid voor HIV-infectie belangrijk variëren hormonale cycli, het gebruik van hormonale anticonceptiemiddelen, bacteriële vaginose of seksuele activiteiten ^5,7-9.

Diverse werkwijzen zijn ontwikkeld om het immuunsysteem bevolking en omgeving van de FGT bestuderen. Cervicale biopsie, cervicale cytobrushes en cervicovaginal lavages (CVL) ^10-12 worden het meest gebruikt in de literatuur. CVL collectie PBS spoeling de eenvoudigste werkwijze en maakt de studie van immuun modulerende eiwitten maar resulteert in extreem lage celopbrengst, en is daarom niet geschikt voor het bestuderen van de immuuncel populaties van de FGT ^13. CVL monsters, anderzijds, very nuttig voor de beoordeling immune omgeving van de FGT door het meten van de expressie van verschillende cytokinen, chemokinen of antimicrobiële factoren behulp van methoden zoals ELISA, cytokine bead matrix ¹⁴ of massaspectrometrie ^15,16. Karakterisering van immuuncellen frequenties fenotypes en functies kunnen worden gerealiseerd door het verzamelen van cervicale cellen (CMC) door cervicale cytobrush of cervicale biopsie bemonstering.

Cervicale biopsie sampling is een invasieve methode die het ongemak en risico van bloeden verhoogt en duurt 2-11 dagen om te genezen na de procedure, afhankelijk van de immuunstatus van de vrouw ^12. Anderzijds, cervicale cytobrushes, ondanks de lagere opbrengst aan cellen gewonnen, is een minder invasief en meer handige methode om immuuncellen te verzamelen van de FGT. Beide methoden kunnen dezelfde opbrengst van CD45 + leukocyten bereiken, maar twee opeenvolgende cervicale cytobrushes nodig zijn om dezelfde hoeveelheid cellen bevatte vinden in een biopsie ^13. Toch cytobrush sampling geeft nog een aanvaardbaar aantal cellen (ongeveer 5.000 CD45 + cellen / cytobrush) voor verdere ex vivo fenotypering van flowcytometrie ^14. Ook functionele karakterisering kan worden uitgevoerd op deze monsters uitgevoerd, zoals stimulatie en intracellulaire flowcytometrie of qPCR zijn uitgevoerd met behulp van cytobrush afgeleid CMC HIV-specifieke immuunrespons ¹⁷ of Th cel polarisatie ¹⁸ identificeren. Uitbreiding van de populatie T-cellen kunnen ook functionele studies met CMC ¹⁹ vergemakkelijken.

Het is belangrijk op te merken dat de biopsieën en cytobrushes proeven van verschillende gedeelten van de FGT. Biopsies afkomstig van de superieure deel van het epitheel en stroma van de ectocervix ^12,13, terwijl cervicale cytobrushes proeven van de baarmoederhals, het verzamelen cellen afkomstig van het epitheel van endocervix en vermoedelijk de transformatie zone. Cytobrush monsters proeven dus een reGion samengesteld uit een enkele laag van cilinderepitheel, terwijl biopten, omvatten een gebied omzoomd door een geschubde gelaagd epitheel ^5. Dientengevolge, de aard van de leukocyt populaties door cervicale biopsie en cytobrush verzameld verschilt. Biopten verzamelen van een groter deel van de CD3 + T-cellen, terwijl cytobrushes resulteren in collectie van een groter deel van CD14 + monocyten / macrofagen ^13.

Het bestuderen van de immunologie van de FGT heeft een belang al vele jaren ^20-22 en we hebben veel expertise met de studie van cytobrush afgeleide CMC geaccumuleerd. Onze studies richten zich vooral op de studie van HIV-geïnfecteerde, niet-geïnfecteerde en HIV-blootgestelde seronegatieve (HESN) vrouwelijke sekswerkers uit Nairobi, Kenia. HIV voorkeur repliceert in geactiveerde T-cellen ²³ en lagere aantallen van geactiveerde cellen die kunnen worden gericht door HIV in de FGT zou kunnen bijdragen tot de bescherming tegen HIV overname. In lijn met deze hypothese, diverse studies hebben lagere immuunactivatie onder HESN sekswerkers die zeer blootgesteld aan HIV beschreven Nog blijven geïnfecteerde ^24,25 en dit latente fenotype wordt ook waargenomen in de FGT ^14. We beschrijven hier methodologie voor verwerking en evaluatie van T-cellen activatie CMC monsters verkregen uit cervicale cytobrushes door ex vivo flowcytometrie.

Protocol

Ethiek verklaring: Het onderzoek ethiek van bestuur van zowel de Universiteit van Manitoba en Kenyatta National Hospital / Universiteit van Nairobi keurde deze studie en schriftelijk toestemming is verkregen van alle deelnemers aan de studie.

1. Voorbereiding van de media en CMC Collection Tubes

1. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na ₂ HPO _4, 1,47 mM KH _{2PO 4).} Autoclaaf voor steriliteit. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
2. Pre-monster 5 ml PBS in 50 ml Falcon buis (een per monster af te halen) en bewaar bij 4 º C tot monstername tijd.
3. Label 2-4 cryovials of 1,5 ml microcentrifugebuisjes per monster lavage voor opslag verzamelen.
4. Bereid celkweekmedium: RPMI 1640 + 1% penicilline / streptomycine / amfotericine B (eindconcentratie 100 eenheden / ml, 100 ug / ml en 250 ng / ml, respectieely, zonder FCS / FBS toegevoegd.

2. Verzameling van Cytobrush Monsters

Het verzamelen van cytobrush monsters is een niet-invasieve procedure die moet worden uitgevoerd door een getrainde MD of gynaecoloog.

1. Verzamel cervicale cellen (CMC) met behulp van zowel een cytobrush en een houten of plastic schraper. Verzamel CMC van de deelnemer onder speculum onderzoek door het plaatsen van de schraper en roteren om de baarmoederhals (figuur 1). Steek de cytobrush in het endocervicale os, draaien 360 °, en zij plaatst zowel de cytobrush en schraper in de 50 ml falcon buis met 5 ml PBS.
2. Blijf monsters op ijs / bij 4 º C tot verwerking. Levensvatbaarheid van de cellen, het verwerken van monsters te handhaven binnen 2 uur na afname.
3. Indien mogelijk, verzamel afgestemd bloedmonsters in groene top heparine vacutainers perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) geïsoleerd om te dienen als een comparator / controle voor CMC analyse.

3. Isolatie van CMC

Voer monster verwerking in een bioveiligheidsniveau 2 laboratorium, in een steriele bioveiligheid kast met dubbele handschoenen.

1. Tijdens de inzameling, kan CMC monsters verontreinigd met bloed. Monsters met zichtbaar bloed verontreiniging van het onderzoek uitsluiten, om de verstorende opname van PBMC in de uiteindelijke steekproef voorkomen. Vanwege het lage aantal lymfocyten geïsoleerd van CMC monsters, kunnen minder ernstige verontreiniging bloed gemakkelijk de CMC lymfocyt component overweldigen.
2. Vortex falcon buizen met zowel de cytobrush en schraper voor 45 seconden om cellen te distantiëren van de borstels. Monsters kunnen schuimend worden tijdens dit proces; dit is normaal.
3. Gebruik de cytobrush om alle resterende materiaal af te schrapen de schraper en de schraper dient het naar een bleekmiddel oplossing. Om cellen gehecht is aan de borstel / schraper verzamelt, gebruikt een nieuwe handschoen naar de schraper tussen de duim en wijsvinger knijpen.Glijden de borstel, waardoor de cellen en PBS af te halen in dezelfde 50 ml tube. Gooi de cytobrush in een bleekmiddel oplossing, en de handschoen gooi.
   BELANGRIJK: Gebruik een nieuwe handschoen voor elk monster.
4. Monteer een 100 um nylon cel zeef om een ​​frisse 50 ml Falcon buis. Met behulp van een overdracht pipet, het verzamelen van de PBS-celsuspensie uit het monster buis en filteren door de zeef in de nieuwe buis.
5. Voeg 5 ml RPMI 1640 de oorspronkelijke monsterbuis. De overdracht pipet was de zijkanten van de monsterbuis met RPMI en overdracht via het filter op de nieuwe verzamelbuis. Was de onderkant van het nylon filter met RPMI ook.
6. Centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 514 x g. Het is cruciaal om de centrifuge rem van verlaten tijdens deze stap, om loskomen van de CMC pellet voorkomen.
7. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof uit de tube, en zorg dat de pellet niet storen. Korrelgrootte zal zeer variabel zijn; in zome monsters, de pellet is vrij groot door de aanwezigheid van grote aantallen epitheelcellen, terwijl in andere gevallen de pellet nauwelijks zichtbaar en zeer transparant.
8. Resuspendeer de pellet door voorzichtig schudden van de falcon buis. Voeg 5 ml PBS om het monster te wassen.
9. Centrifugeer opnieuw gedurende 10 min bij 514 xg zonder centrifuge rem.
10. Gooi voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet als hierboven. De cellen zijn klaar voor of cryopreservatie (met behulp van een PBMC cryopreservatieprotocol), stimulatie of flowcytometrie fenotypering.

4. CMC Surface kleuring en flowcytometrie

1. Resuspendeer de pellet uit stap 3,10 100 ui blokkerende oplossing en overdracht wordt in een 96-well plaat of FACS buis. De blockingbuffer (om Fcy receptoren blokkeren) recept is als volgt: 1,8 pl muis IgG (uiteindelijke concentratie 0,2 ug / ul) 5 ui FBS en 93,2 pi FACS wassen (PBS +2% FBS).Kleuring kan in een plaat met 96 putjes worden uitgevoerd als pellet klein genoeg zijn, maar moet in FACS buisjes worden uitgevoerd als pellets routinematig groot. Het is belangrijk dat antilichamen dienovereenkomstig titreren.
2. Blokkeer de monsters gedurende 10 min op ijs / bij 4 ° C.
3. Was de cellen met 100 ul FACS wassen (PBS +2% FBS) in 96-well platen of 500 gl in FACS buisjes. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met de rem op lage (of uit, als een lage rem instelling niet beschikbaar is).
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet door roeren. Voeg levensvatbaarheid Stain (Live Dead fixable levensvatbaarheid kleurstof). Bereid levensvatbaarheid kleurstof volgens de instructies van de fabrikant. Het moet worden getitreerd voor gebruik in elk laboratorium / cytometer opstart. Incubeer gedurende 30 min in het donker bij 4 ° C.
5. Was de cellen μl/500 100 pi PBS (96-well plaat / FACS buizen). Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 minuten met een lage / geen rem. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen.
6. Incubeer de cellen met de cocktail oppervlakte marker antilichamen, in een totaal volume van 100 pl. BELANGRIJK: Optimaliseer en titreer elk flowcytometrie panel voorafgaand aan kleuring proeven. Incubeer cellen gedurende 30 min in het donker bij 4 ° C.
7. Herhaal stap 4.5. Als kleuring in een 96-well plaat, overdracht cellen om een ​​FACS buis en verdund tot een eindvolume van 750 pi FACS wassen met 1% paraformaldehyde (PFA) (of Cytofix, verdund 1 op 4). Ga verder met data-acquisitie op een flowcytometer.

5. Verzamelen en bereiden van cervicovaginaal Lavage (CVL)

1. Vóór de bemonstering Cytobrush, door met een spuit de endocervix wassen met 2 ml steriele PBS en zuig de lavage van de achterste fornix.
2. Verzamel de aangezogen lavage monster in een 15 ml falcon buis en blijf op ijs / bij 4 º C tot verwerking.
3. Centrifugeer monster bij 400 xg gedurende 7 min om celafval te verwijderen.
4. Collect de supernatant monster het monster in 1 ml of 500 ul porties en bewaar bij -70 ° C. Monsters kunnen worden ontdooid voor ELISA of bead array analyse van CVL eiwitten, maar vermijd meerdere vries / dooi cycli.
5. Desgewenst resuspendeer de pellet van cellulair afval in RNA Volgende RNA expressie meten volgens het protocol van de fabrikant.

6. Data Acquisition

1. Bereid een reeks buizen vergoeding die overeenkomt met het paneel antilichaam. Voer de compensatie buizen spectrale overlap aan te passen. Voer de monsters op een meerkleurig flowcytometer die is geconfigureerd voor het fluorochroom geconjugeerde antilichamen die in het paneel.
2. Schaf een PBMC monster eerste voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) voltage aan te passen om de lymfocytenpopulatie detecteren. Probeer ze te houden op 100 op elke as op een lineaire schaal. Het runnen van een PBMC controle zal het aanzienlijk gemakkelijker om de CMC lymfocytenpopulatie vinden.
3. De FSC drempel voor CMC monsters moeten worden verhoogd ten opzichte van PBMC monsters vanwege smeren van de SSC-as bij lage FSC waarden.
4. Vortex elke buis voordat u tot aanschaf. Het verwerven van de gehele buis het aantal lymfocytpoort gebeurtenissen verzameld maximaliseren. Bewaken van de machine zorgvuldig om verstopping te voorkomen.
5. De gegevens te exporteren naar een flowcytometrische analyse programma zoals FlowJo.

7. Gating Strategie

1. Selecteer Doorsturen zijwaartse verstrooiing hoog (FSC-H) / Forward zijwaartse verstrooiing gebied (FSC-A) om de singlet bevolking te bepalen.
2. Selecteer Tijd versus TL-marker (zoals bijvoorbeeld FITC) om te controleren voor de kwaliteit van de overname. Verandering in de stroomsnelheid kunnen artefacten in de data te introduceren. Uitsluiten geen gebied dat verschil in debiet toont.
3. Identificeer de lymfocytpopulatie op SSC-A/FSC-A perceel. Gebruik een PBMC controle om de identificatie te vergemakkelijken. Merk op dat de CMC lymfocyt populatie niet zo duidelijk als de PBMC besturing lopen.
4. Gate aan SSC-A/viability kleurstof om dode cellen te sluiten van levende cellen. Dode cellen kunnen niet-specifiek omvatten de antilichamen, die artefacten zal introduceren.
5. Gate aan de SSC-A/CD3 aan de T-celpopulatie te identificeren. Uit deze poort identificeren het CD4 + en CD8 + populaties.

Resultaten

Multiparameter flowcytometrie is een krachtig hulpmiddel om de fenotypes en functies van celondergroepen ontleden in voorheen uncharacterized weefsels. Analyse van CMC monsters kunnen informatie over zowel lymfocyten en monocyten populatie opleveren met de juiste gating strategieën.

Een representatieve CMC gating strategie, vergeleken met een PBMC profiel, weergegeven in figuur 2. Het FSC-A versus FSC-H plot maakt de uitsluiting van cel doubletten, die veel voorkomen in CMC ...

Discussie

Gezien de grote hiaten in de kennis met betrekking tot de immuniteit bij de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), kan fenotypische analyse van CMC's een breed scala aan inzichten in meerdere lymfocytenpopulaties op de baarmoederhals. In combinatie met proteomics analyse en viral load metingen in cervicale lavage, kan immuniteit voor seksueel overdraagbare aandoeningen (soa) s en andere ziekteverwekkers worden ontleed in verschillende populaties.

Technische overwegingen - CMC:

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 μm celstrainer voor 50 ml Falcon buisje	BD	352360	CMC verwerking
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC verwerking
Foetaal bovien serum	Life technology	16000044	CMC verwerking
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC verwerking
Penicilline/streptomycine	Sigma	P4333-20ml	CMC verwerking
50 ml Falcon buisje	Fisher	14-959-49A	CMC verwerking
Blood Bank wegwerp overdracht pipetten	Fisher	13-711-6M	CMC verwerking
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC bemonstering
Wegwerp cervicaal schraper	Quick medical	2183	CMC bemonstering
15 ml Falcon buisje	Fisher	14-959-70c	CVL verwerking
1,5 ml Eppendorf buisje	Fisher	05-402-18	CVL opslag
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Verschillende	Flow cytometrie reagens
Fixatie buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometrie reagens
IgG muis	Sigma	I8765	Flow cytometrie reagens