Hierin tonen we kwantificering van retinale de- en regeneratie en de impact ervan op de visuele functie met behulp van N-methyl-N -nitrosourea in de volwassen zebravissen. Verlies van gezichtsscherpte en verminderde fotoreceptor nummers volgde proliferatie in de binnenste kernlaag. Compleet morfologische en functionele regeneratie trad 30 dagen na de eerste behandeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Retinale degeneratieve ziekten, zoals retinitis pigmentosa, met de daaruit voortvloeiende schade fotoreceptor maken het merendeel van gezichtsverlies bij de industriële wereld. Diermodellen zijn van cruciaal belang om deze ziekten te bestuderen. In dit verband de fotoreceptor-specifieke toxine N-methyl-N -nitrosourea (MNU) is op grote schaal gebruikt in de knaagdieren om farmacologisch induceren retinale degeneratie. Eerder hebben we een MNU geïnduceerde retinale degeneratie model in de zebravis, een andere populaire modelsysteem visueel onderzoek vastgesteld.
Een fascinerende verschil met zoogdieren is de aanhoudende neurogenese in de volwassen zebravissen netvlies en de regeneratie na beschadiging. Om deze waarneming hebben wij gezichtsscherpte metingen die werkzaam zijn in de volwassen zebravissen kwantificeren. Daardoor werd de optokinetische reflex gebruikte functionele mutaties in niet-verdoofde vis volgen. Dit werd aangevuld met histologie en immunohistochemie staining apoptose (TUNEL) en proliferatie (PCNA) de ontwikkeling morfologische veranderingen correleren.
Samengevat, apoptose van fotoreceptoren treedt drie dagen na MNU behandeling, gevolgd door een duidelijke vermindering van cellen in de buitenste nucleaire laag (ONL). Daarna wordt proliferatie van cellen in de binnenste nucleaire laag (INL) en ONL waargenomen. Hierin tonen we dat niet alleen een volledige histologisch maar ook een functionele regeneratie plaatsvindt gedurende een tijdsverloop van 30 dagen. Nu illustreren we de methoden te kwantificeren en op te volgen zebravis netvlies de- en regeneratie met behulp van MNU in een video-formaat.
Inleiding
Visie is de meest essentiële zin voor de mens en zijn bijzondere waardevermindering heeft een hoge sociaal-economische impact. In de ontwikkelde wereld, retinale degeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van gezichtsverlies en blindheid bij oudere volwassenen 1. De oorzaak van de meeste degeneratieve retinale ziekten is nog niet duidelijk en therapeutische oplossingen voor verloren gezichtsvermogen herwinnen zeer beperkt. Retinitis pigmentosa is een typisch voorbeeld van een retinale degeneratieve ziekte primaire fotoreceptor verlies 2-3. N-methyl-N -nitrosourea (MNU) induceert retinale degeneratie en wordt daarom veel gebruik....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten gehandeld op grond van de verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek van de Vereniging voor Onderzoek naar Visie en Oogheelkunde (ARVO).
1 Dieren
- Handhaaf de wildtype zebravis (Danio rerio) van de AB (Oregon) stam onder standaardomstandigheden tussen 6-12 maanden in water met een temperatuur van 26.5 ° C en een 14/10 uur licht / donker cyclus 15.
- Volg het dier zorg richtlijnen van de betrokken instellingen voor de dierproeven na goedkeuring door de kantonrechter Veterinair Bureau.
2 MNU Behandeling
- Ber....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gezichtsscherpte:
De experimentele set-up [ruimtelijke frequentie: 0.042 cirkels / graad (c / d); contrast: 100%; drift snelheid: 20 graden / seconde (d / src); achtergrondverlichting helderheid: 152 cd / m 2] van deze studie mogelijk OKR beoordeling van volwassen zebravissen. De gemiddelde duur van VA meting was ongeveer 5 - 10 minuten per zebravis, dat de procedure goed verdragen. Gezichtsscherpte vóór MNU blootstelling was 0.577 ± 0.014 cycli / graad (c / d). Figuur 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerder heeft onze groep de MNU model van fotoreceptor degeneratie overgedragen van knaagdieren in de zebravis systeem 9. De daaropvolgende gebeurtenissen werden beschreven en gevolgd gedurende maximaal 30 dagen. In deze periode volledige retinale degeneratie en morfologische regeneratie trad na de eerste behandeling. Eerst histologie onthult een verminderde staaf celgetal vanaf dag 3 op met een minimum op dag 8 Dienovereenkomstig TUNEL kleuring identificeert apoptose van stang fotoreceptoren 3 dagen na MNU be.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Monika Kilchenmann, Federica Bisignani en Agathe Duda voor hun uitstekende technische assistentie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | A6283 | |
| Ammoniak | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | 294993 | 0,80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Denemarken | S2002 | |
| DAPI montagemedium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosine | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | 3989 | |
| Geit anti-konijn Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Zwitserland | A11012 | |
| Geit normaal serum | Dako, Glostrup, Denemarken | X0907 | |
| Zoutzuur | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | 320331 | 0,20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Zwitserland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalumoplossing | Merck, Darmstadt, Duitsland | 109249 | |
| Methylnitrosoure (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | N4766 | Toxisch |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.v.t. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | P6148 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Denemarken | S3004 | |
| Konijn anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, VS | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glasplaten | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Duitsland | 10149870 | |
| Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | P1379 | |
| XYleen | Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland | 534056 | |
| Zebravis (Danio rerio) AB (Oregon)-stam | Universiteit van Fribourg, Afdeling Biologie | n.v.t. | Eigen visinstallatie |
Referenties
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
