Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest

Samenvatting

De analyse van eiwitexpressie in jonge embryonale muiskleppen is belemmerd door het beperkte beschikbare weefsel. Dit manuscript biedt een protocol voor het bereiden van eiwitten uit zich ontwikkelende embryonale muisklepgebieden voor western blot-analyse.

Samenvatting

Western blot-analyse is een veel gebruikte techniek voor het detecteren en kwantificeren van eiwitniveaus. Echter, voor kleine weefselmonsters kan deze analysemethode niet voldoende gevoelig zijn om een eiwit van belang te detecteren. Om deze moeilijkheden te overwinnen, hebben we protocollen onderzocht voor het verkrijgen van eiwitten uit volwassen menselijke hartkleppen en deze protocollen aangepast voor de zich ontwikkelende vroege embryonale muisvarianten. In het kort, worden de embryonale aortische klepregio's van de muis, inclusief de aortaklep en de omringende aortawand, verzameld in het minimale mogelijke volume van een Tris-gebaseerde lysbufer met proteaseremmers. Indien vereist op basis van de kweekstrategie, worden embryo's gegenotypiseerd voordat vier embryonale aortische klepregio's voor homogenisatie worden gepoold. Na homogenisatie wordt een SDS-gebaseerde monsterbuffer gebruikt om het monster te denatureren voor gebruik op een SDS-PAGE-gel en daaropvolgende western blot-analyse. Hoewel de eiwitconcentratie te laag blijft om te kwantificeren met behulp van spectrofotometrische eiwitkwantificeringsassays en er monster overblijft voor verdere analyses, kan deze techniek worden gebruikt om met succes gefosforyleerde eiwitten via western blot te detecteren en semi-kwantificeren uit gepoolde monsters van vier embryonale dag 13,5 muis aortaklepregio's, waarvan elk ongeveer 1 μg eiwit oplevert. Deze techniek zal van voordeel zijn voor het bestuderen van celsignaleringspadactivering en eiwitexpressieniveaus tijdens vroege embryonale muisklepontwikkeling.

Inleiding

In staat zijn om eiwit expressie niveaus te identificeren en te kwantificeren is een standaard techniek voor dier-en cel-gebaseerde experimenten. Ondanks een langdurige interesse in vroege embryonale ontwikkeling hartklep, evalueren eiwitexpressie in dit specifieke weefsel tijdens ontwikkeling momenteel beperkt tot immunohistochemie in zowel het kuiken en muis ^1,2. Een deel van de moeilijkheid kwantificeren eiwitexpressie in de ontwikkeling kleppen meeste modelorganismen (bijvoorbeeld kuiken en muis) is de kleine omvang van de kleppen die de hoeveelheid eiwit die kan worden verkregen beperkt. Zo kwantitatieve analyses, onderzoekers normaliter afhankelijk RNA-extractie en amplificatie voor daaropvolgende kwantitatieve PCR of microarray-analyse ^2-5. Echter, RNA en eiwit expressie niveaus niet geheel correlatieve ^6, dus gericht op RNA expressie kan geen strenge wegens de vele veranderingen die optreden in een bepaalde signaleringroute op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling. Op basis van deze grens in de momenteel beschikbare methoden het doel van deze procedure is een protocol voor het betrouwbaar om voldoende hoeveelheden eiwitten van de muis embryonale ontwikkeling hartklep gebieden voor kwantitatieve analyse van veranderingen die optreden in verschillende signalisatiewegen belang te ontwikkelen de rijping van dit weefsel.

Embryonale kleppen zijn reeds algemeen ontleed uit muizen voor RNA isolatie en vervolgens genexpressieanalyse ^2-5. Echter, deze studies beperkt tot het gebruik genexpressie als uitlezen van signaleringsroute activatie, waarbij de detectie van sporen posttranslationele eiwit modificaties die stroomafwaartse signalering beïnvloeden niet toestaat. De RNA-isolatietechnieken als uitgangspunt, begonnen we met het ontleden van de gebieden van belang. Omdat onze interesse was het opsporen van gefosforyleerd eiwitten die indicatief zijn voor het signaleren pat warenHWAY activiteit gedurende een bepaalde periode aortaklep ontwikkeling (E13.5-14.5), voerden we alle dissecties in fosfaatvrije Tris buffer en de kleppen in een Tris-gebaseerde lysis buffer met fosfatase en proteaseremmers verzameld. In het specifieke geval enkel de aortaklep gebieden werden opgevangen, maar de pulmonaalklep regio kan gemakkelijk worden verkregen op hetzelfde moment. De klep gebieden werden vervolgens gehomogeniseerd en gecombineerd met een monsterbuffer die momenteel wordt gebruikt voor eiwitexpressie bij volwassen hartkleppen ⁷ bestuderen. Via kleine monstervolumes (bijvoorbeeld 2 ui) en samenbrengen klepgebieden van embryo's met hetzelfde genotype, waren we in staat om gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde eiwitten detecteren embryonale dag 13.5 ^8. Omdat de klep gebieden worden ingevroren en opgeslagen in lysis buffer, kan embryo genotyperen indien nodig voordat bundelen.

Deze techniek verbreedt de set van tools die beschikbaar zijn voor het evalueren van cel signaling wegen tijdens de ontwikkeling en biedt een kwantitatieve compliment voor immunohistochemie, in het bijzonder voor de ontwikkeling van hartkleppen. Deze techniek moet niet alleen nuttig om ontwikkelingsstoornissen cardiologen, maar ook voor alle ontwikkelings-biologen die werken met een vroeg stadium embryo's geïnteresseerd zijn in regio's die beperkte weefsel bevatten.

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.

1 Accijnzen de aortaklep

1. Met een goedgekeurde euthanasie techniek voor het embryonale stadium plaats, euthanize een zwangere muis met pups op de gewenste embryonale dag (E) van ontwikkeling.
2. Gebruik van 70% ethanol aan de buik van de zwangere vrouw te steriliseren. Til de huid en spieren van de onderbuik omhoog en van de inwendige organen en ontleden onderste buikholte van het wijfje open toegang tot de baarmoeder hoorn mogelijk.
3. Om de baarmoeder hoorn op te halen, houdt u de baarmoederhals met een pincet en knip voorzichtig caudaal van de tang. Til de baarmoeder hoorn, snijden elke bindweefsel dat de hoorn op zijn plaats houdt, en voltooi de verwijdering door het snijden van de kruising van de baarmoeder hoorn met de eileider.
4. Plaats de uitgesneden uterushoorn in een petrischaal met cold 0,1 M Tris buffer (pH 7,6) en spoelen indien nodig. Snij vervolgens de baarmoedertak geopend lengte-wijs om de embryonale zakken bloot.
5. Om het embryo bloot opengesneden een embryonale sac op de kruising van de placenta en de embryo en de navelstreng schepen de embryo lossnijden. Plaats de ontleed embryo in een tweede petrischaal met koude 0,1 M Tris buffer. Zet de eerste petrischaal met de resterende undissected embryo ijs tot klaar voor de volgende embryo.
6. Om borstwand toegang binnen het embryo te verbeteren, onthoofden het embryo. Als genotypering is nodig, te verwijderen en op te slaan een extra stuk weefsel in een Eppendorf buis geplaatst op ijs.
7. Plaats het embryo op zijn rug, en snijd de borstwand verticaal langs de kant van de ribbenkast, bij een voorpoot en horizontaal boven het membraan naar het hart te visualiseren. Open vervolgens de borstwand naar het hart bloot te leggen.
8. Met behulp van een tang te houden hoog langs de grote vaten, til het hart met behulp van een tang, en de vaten onder te snijden. Hetn, bezuiniging de tang naar het hart bevrijden. Als de longvaten ongesneden blijven, kunnen de longen worden verwijderd met het hart en dienen alvorens verder worden verwijderd.
9. Snij en verwijder de longslagader boven het niveau van de afsluiter; in de embryonale stadia hierin beschreven, de longslagader enigszins ondoorzichtig, hetgeen helpt bij het onderscheid van het klepgebied. Snij net onder de pulmonaalklep, het vermijden van de trabeculated ventriculaire myocard en verzamelen zoals beschreven in stap 1.10 als dit gebied is ook van belang. Hier en in de volgende stap gebruikt capillaire werking overtollige Tris buffer verwijderd van het interessegebied trekken vóór verzamelen in lysis buffer.
10. Verwijder voorzichtig de aorta distaal van de aortaklep, juist boven het niveau van de afsluiter; zoals de longslagader, de aorta blijft enigszins ondoorzichtig op deze embryonale stadia, hulp bij de verwijdering ervan. Snij net onder de aortaklep, opnieuw de trabeculated ventriculaire myocard vermijden, en de overdracht van delos met een tang om een ​​Eppendorf buis met 2 ui lysis buffer (in de tabel Materials beschreven) die protease en fosfataseremmers op ijs.
11. Herhaal stappen 1,6-1,10 totdat de kleppen zijn uitgesneden uit alle embryo, verzamelen elke klep in een aparte Eppendorf buis. Als alle embryo hetzelfde genotype kunnen alle kleppen worden opgevangen in een Eppendorf buis.
12. Als genotypering wordt uitgevoerd om te bepalen welke kleppen poolen moeten onmiddellijk monsters in lysis buffer bij -80 ° C tot verder gebruik. Monsters kunnen vervolgens worden samengevoegd na genotypering (stap 2.1.1).

2 Protein Extraction

1. Ontdooi verzamelde weefsels op ijs en centrifugeer bij 13.100 xg gedurende 1 min naar de weefsels in lysis buffer verzamelen op de bodem van de buis.
   1. Als embryo's werden het genotype, gebruik maken van een pipet om voorzichtig te verzamelen en het zwembad lysis buffer met de klep regio's van embryo's met gelijkaardige genotypes. Om een ​​sterke b zorgenen, het bundelen van 3-4 klepgebieden van E13.5 embryo's per monster wordt aanbevolen.
   2. Als alle embryo's waren van hetzelfde genotype en al klepgebieden werden gebundeld in stap 1.10, lyseren het gehele monster, zoals beschreven in stap 2.2.
2. Controleer het volume van het resulterende samengevoegde monster en voeg lysis buffer tot een totaal volume van 40 ui; Vervolgens, verstoren en homogeniseren monsters met behulp van 5 mm rvs kralen in Eppendorf buizen. Bedien de lyser 2-4 minuten bij 50 Hz, volgens instructies van de fabrikant. Spin buizen kort (~ 13.100 xg gedurende 1 min), en doorvoermonsters nieuwe buizen, met achterlating van de onoplosbare brokstukken.
3. Voorbereiden en afzonderlijke monsters voor SDS-PAGE en daaropvolgende transfer voor western blot analyse volgens een protocol zoals Eslami e.a. ^9. Vloeipapier voor een laad-controle-eiwit is essentieel voor eiwit kwantificering.

Resultaten

Met behulp van deze voorbereiding techniek, waren we in staat om gefosforyleerd Smad- ^1,5,8 (pSmad) op te sporen in enkele aortaklep regio van E13.5 embryo's. Zoals getoond in figuur 1A, het eiwit geïsoleerd uit zelfs een enkele klepgebied volstaat een zwakke band pSmad detecteren. Intensiteit van het signaal toeneemt evenredig met het aantal klepgebieden die worden samengevoegd. Belangrijk is dat de pSmad / β-actine-ratio blijft vrijwel constant over de verschillende steekproefomvang

Discussie

De mogelijkheid om eiwit niveaus hartklep regio's te kwantificeren in de vroege embryonale muis en kuiken biedt een extra instrument voor het begrijpen van de kritische cellulaire signalering evenementen voor klep ontwikkeling. Ons protocol hierin beschreven verschilt niet veel van de standaard eiwitisolatie procedures. Echter, door het wijzigen van een aantal belangrijke stappen, hebben we met succes gefosforyleerd eiwitten verkregen uit zeer kleine steekproeven. Om dit resultaat te bereiken, zijn de volgende stapp...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tijdszwangere muis			Te disseceren in het embryonale stadium van belang
Stereoscopisch microscoop	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microschaar	Fine Science Tools	15003-08
Fijne pincet, #5	Fine Science Tools	11251-30
Dissectie naaldhouders	Ted Pella Inc.	13560
Dissectie naalden	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipet, 20 μl, met tips
Lyse buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Voeg 1 tablet toe aan 10 ml lyse buffer
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Roestvrijstalen kralen	Qiagen	69989
Microcentrifuge