Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes

Samenvatting

Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.

Samenvatting

Stekelhuidigen zijn al lang een favoriet model voor studies van voortplanting en ontwikkeling, en meer recent voor de studie van genregulatie en evolutie van ontwikkelingsprocessen. De zee ster, Patiria miniata, is het verkrijgen van de prevalentie als een modelsysteem voor dit soort studies die vroeger bijna uitsluitend werden uitgevoerd in de zee-egels, Strongylocentrotus purpuratus en Lytechinus variegatus. Een voordeel van deze modelsystemen is het gemak van productie gemodificeerde embryo waarin een bepaald gen omhoog of omlaag gereguleerd gegevens voor een groep cellen, of het introduceren van een reportergen. Een enkele microinjectie werkwijze in staat is om een ​​grote verscheidenheid van dergelijke gemodificeerde embryo. Hier presenteren we een werkwijze voor het verkrijgen van gameten P. miniata, produceren zygotes, en de invoering van storende reagentia via micro-injectie. Gezonde morphant embryo's worden vervolgens geïsoleerd voor kwantitatieve en kwalitatieve studies van gene functie. De beschikbaarheid van genoom en transcriptome gegevens voor dit organisme heeft de soorten onderzoeken die zijn uitgevoerd en het gemak van de uitvoering ervan verhoogd.

Inleiding

De zee ster, Patiria miniata, (algemeen bekend als de bat-sterren) is in opkomst als een interessant en veelzijdig model voor een verscheidenheid van cellulaire ^{1 tot 3,} ontwikkelingsstoornissen ^4,5, evolutionaire ^6-8, en ecologisch onderzoek ^{9- 11.} Volwassen P. miniata zijn verdeeld langs de Pacifische kust van Sitka, Alaska naar Baja, Californië ¹² en worden gemakkelijk gehandhaafd in zeewateraquaria. Eicellen zijn verkrijgbaar het hele jaar door en elk vrouwtje kan werpen tienduizenden eieren. Eicellen zijn gemakkelijk gerijpt en extern ¹³ bevrucht. De resulterende embryo's zijn transparant waardoor u gemakkelijk observatie; zij ontwikkelen synchroon en vereisen slechts zeewater voor ontwikkeling. Gehele genoom assemblage en meerdere transcriptomes zijn ook beschikbaar voor P. miniata ( Echinobase.org ). Dergelijke voordelen maken ze ideaal voor een scala van onderzoeken onderwijsdoeleinden.

In de afgelopen jaren, P. miniata is uitgegroeid tot een model voor de ontwikkelingsbiologie genregulerend netwerkanalyses ^14-16. Het doel van deze studies is de volledige compliment van regulerende genen en het netwerkadres bepalen van hun interacties. Veel van dit werk betekent storende genexpressie door invoering van antisense oligonucleotiden of in vitro gesynthetiseerd mRNA. Daarnaast zijn cis regulerende analyses gebruikt om de functie van regulatoire DNA ¹⁵ karakteriseren. Deze analyses vereisen invoering van verstoring reagentia en / of DNA reporter constructen in embryo. Teneinde voorts de stroomafwaartse effecten van deze verstoringen karakteriseren, moet men vele embryo testen op veranderingen in genexpressie van potentiële doelwitten. Technieken voor micro-injectie van zygoten honderden centraal voor dit werk.

Stekelhuidigen, waaronder P. miniata , vereisen vele maanden tot seksuele rijpheid te bereiken. Hierdoor is het meestal niet praktisch te ontwikkelen en transgene lijnen van deze dieren voor experimenten te handhaven. Daarom fokken van transgene volwassenen kunnen niet efficiënt creëert gewijzigd embryo. In plaats daarvan moet verstoring plaatsvinden de novo door micro-injectie. Micro-injectie biedt de mogelijkheid om embryo's te wijzigen met reagentia die niet cell-permeabel. Het volgende protocol beschrijft een methode om DNA, mRNA, cel tracers en morfolino antisense oligonucleotiden introduceren in honderden bevruchte eieren in een 2-3 uur zitten door middel van micro-injectie. Dit levert voldoende materiaal voor verschillende stroomafwaartse experimenten waaronder, maar niet beperkt tot, qPCR, in situ hybridisatie, RNA-Seq en western blotting.

Protocol

Houd alle zeewater of kunstmatig zeewater (SW), volwassen dieren, en culturen bij 15 ° C zo veel als praktisch is. Zorgen voor eieren en Zygoten worden gehouden ondergedompeld in SW.

Commercieel bereid zee zouten opgelost in gedestilleerd water of osmosewater fungeert zowel als een bron van SW. Controleer het zoutgehalte met een hydrometer en zouten of water aan te passen aan een optimaal niveau te bereiken. Blijf dichtheid niveaus tussen 1,020-1,025. Houd alle uit glas en plastic te scheiden van alle andere laboratorium om besmetting met chemicaliën te voorkomen. Schoon embryo rang laboratorium door spoelen met gedeïoniseerd water of incidentele onderdompelen in verdunde natriumhypochloriet, gevolgd door verscheidene malen spoelen met water.

1 Het verkrijgen en rijping van gameten Patiria miniata Volwassenen

1. Selecteer een dier geslachtsklieren accijnzen. Bepaal sex na excisie door te kijken naar de aanwezigheid van eierstokken en testes omdat P. miniata zijn niet sexually dimorphic.
2. Snijd een kleine opening, niet groter dan 1 cm, langs de kant van een zee ster arm met een scalpel (Figuur 1A). Met behulp van kleine-stomp pincet terugtrekken randen van de incisie om de gonaden weefsel en trek gonad weefsel via de incisie.
   OPMERKING: Vermijd trekken darmweefsel, dat een losse grijs of bruin weefsel (Figuur 1B). Eierstokken zijn meestal oranje, geel of licht bruin (figuur 1C), terwijl de testes zijn wit of beige en wanneer verstoord zal veroorzaken zeewater te melkachtig of troebel is (figuur 1D) geworden.
3. Terug vrouwtjes naar de aquaria. Isoleer mannen voor een uur of twee in een container van SW, omdat de stress van behandeling kan paaien veroorzaken. Dieren genezen langs de incisie en blijven gameten voor verscheidene maanden.
4. Verzamel testes in een 1,5 ml Eppendorf buis met zo weinig mogelijk SW en opgeslagen op ijs tot gebruik. Bewaren alle testes niet onsed op de dag van inzameling bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
5. Verzamel eierstokken in een kleine glazen cultuur schotel in een enkele milliliters SW. De eicellen vrij uit de eierstok weefsel plagen elkaar het weefsel met twee paar pincetten tot er geen grote stukken blijven.
   OPMERKING: Optimaal is de meerderheid van de oöcyten volledig ontwikkeld. Dergelijke eicellen zijn groot, rond en helder geel of lichtbruin met een duidelijke kiemblaasje in de eicel (Figuur 2A), tegenover de subset van onontwikkelde eicellen die kleiner, bruin, korrelig en ondoorzichtige (Figuur 2B). Indien groter dan ongeveer 25% van de eicellen van de onontwikkelde variëteit, selecteer een ander vrouwtje om eicellen te verkrijgen.
6. Giet de eicellen en het resterende weefsel door een zeef beker met een 200 micrometer poriegrootte en verzamel doorstromen. Hierdoor worden alle varianten van eicellen bevatten, maar verwijder eierstokweefsel. Verjagen overgebleven eicellen uit het weefsel gevangen door het filter door middel van spuiten wet SW van een spuit fles. Filter cups zijn gemaakt met een 50 ml conische buis (figuur 3A-A ').
7. Giet de doorstroming van stap 1.6 door middel van een 100 um zeef cup. Gooi kleine eicellen in doorstroming. Grote volledig ontwikkelde eicellen die klaar zijn voor de rijping blijft op het filter zijn. Spoel de eicellen in een schone beker van 200 ml.
8. Voeg 95 ml van de SW aan de 200 ml bekerglas van eicellen. Voeg 5 ml van 200 uM 1-methyladenine een eindconcentratie van 10 uM.
9. Breng de eicellen een grote ondiepe kweekschaal en plaats bij 15 ° C. Een hoge oppervlak tot volume kweekschaal maakt zuurstofuitwisseling. De eicellen niet rijpen dan niet goed ontwikkelen als ze overvol tijdens deze rijping fase. Opgesplitst in verschillende gerechten van SW plus 10 uM 1-methlyadenine tot cultuur is minder dan 200 eicellen / ml.
10. Laat de eicellen rijpen 45-90 minuten, maar niet meer als deze de oöcyten niet zijn zal maken fertilized. Om te bepalen of rijping voltooid is, op de oöcyten onder ontleden scope. De kiemblaasje beweegt naar en zekeringen met de celmembraan tijdens de rijping. Het Dan bezwijkt en dus niet meer zichtbaar in rijpe oöcyten (figuur 2C).

2 Bemesting van rijpe eicellen

1. Koos voor een kleine cluster van testis weefsel, ongeveer grootte van een erwt, en gehakt in een kleine glazen cultuur schotel met ongeveer 1 ml van de SW.
2. Met een Pasteur pipet 2-3 druppels van de verkregen melkachtige zeewater dragen aan ongeveer 100 ml van het rijpe oöcyten en zwenk de kweekschaal te mengen. Vermijd overdracht stukjes testis weefsel. Vermijd het toevoegen van grotere hoeveelheden sperma, omdat dit kan leiden tot polyspermie en de daaropvolgende slechte ontwikkeling.
3. Na enkele minuten houden aan de eicellen onder een dissectie scope. Bevruchte eieren of zygoten, een bemesting envelop, een doorzichtige koepel die stijgt van de cell membraan (figuur 2D).
   OPMERKING: Ga niet verder met de cultuur als minder dan ongeveer 90% van de eieren te bevruchten, omdat slechte bevruchting tarieven zijn een indicatie van een ongezonde cultuur die kan ook niet goed ontwikkelen.
4. Na de bevruchting is voltooid, verandert de SW op de zygotes door het gieten door een 100 um zeef en spoelen in een cultuur schotel met verse SW. Het is belangrijk om de overmaat sperma zuurstofgebrek voorkomen verwijderen. Plaats de kweekschaal bij 15 ° C gedurende 15-30 minuten.

3 De-jellying en Roeien bevruchte eieren

1. Bereid injectie maaltijden door nemen van de deksel van een 60 x 15 mm polystyreen Petri dish.
   1. Teken een permanent markeerstift lijn op de achterkant van de schaal ter plaatse van het gezichtsveld overeenkomt met de micro-injectie microscoop. Dit zorgt ervoor dat alle geroeid embryo's zijn binnen de microscoop gezichtsveld.
   2. Gebruik een glazen Pasteur pipet om een ​​lijn te scoren door de cirkel, preferably aan een kant van de cirkel (Figuur 3B). Gebruik deze lijn later injectienaalden (Stap 4.5) te doorbreken.
      OPMERKING: Reagentia vaak gebruikt voor zee-egel embryo's, bijvoorbeeld, protamine sulfaat of poly-L Lysine, overbodig houden. De-jellied P. miniata zygotes kleven heel goed op ongecoate plastic. Let op dat ze niet goed vasthouden aan glazen schalen.
2. Voeg ongeveer 10 ml SW bij elk gerecht, zodat het oppervlak bedekt is, maar het water zal niet overmatig spatten in het gerecht als dit Geroeide embryo's kunnen verstoren.
3. Verwijder de P. miniata zygote gelei jas met zuur SW voorafgaand aan roeien. Deze jelly jas is uitgebreider dan die waargenomen voor model zee-egel soorten.
   1. Bereid zuur SW in het bereik van pH 4,0-4,2. De pH-waarde is essentieel voor efficiënte verwijdering van jelly jas staan ​​terwijl het toelaten van de normale ontwikkeling.
   2. Voeg enkele druppels van 1 N (1 M) HCl in SW naar een 1 L voorraad van SW. Laat iedere druppel volledig wordt gemengden bewaken pH vóór toevoegen van meer HCl.
      OPMERKING: Een enkele ml HCl resulteert in de geschikte pH, maar niet het gehele volume tegelijk toevoegen.
      OPMERKING: Maak 1 N HCl in zuurkast met SW en 12 N (12 M) HCl.
   3. Verwijder SW op zygoten door ze gieten op een 100 um zeef. Spoel in een 200 ml bekerglas in de kleinste hoeveelheid SW mogelijk (ongeveer 10 ml). Vul de beker tot 150 ml met zuur SW (pH 4,0) en laat de zygoten zitten in het zuur SW 3 min.
4. Strippen gelei jas uit de zygotes door het gieten ze heen en weer tussen twee 200 ml bekers, elke keer passeren van de zygoten door een 200 micrometer zeef. Giet de zygoten door het filter rond 5-10x gedurende ongeveer 2 minuten tijdskader.
5. Verwijder zuur SW door overgieten zygoten op een 100 um zeef. Spoel de zygoten in een kleine glazen cultuur schotel met SW. De-jellied zygotes kan vasthouden aan plastic schaaltjes. Rij embryo's onmiddellijk; ze beginnen te meer j producerenelly vacht die leidt tot een slechte hechting aan plastic schaaltjes tijd.
6. Gebruik mondpipet (Figuur 3C-C ') op te halen zygotes uit het glas cultuur schotel en leg ze in een rechte lijn op de injectie gerechten. Smelt het midden van de dunne kant van een Pasteur pipet boven een vlam tot het glas zacht. Snel trek de uiteinden van de glazen elkaar om een ​​zeer dunne strook van glas te produceren. Zodra het glas is afgekoeld, breek het smalle uiteinde van het Pasteur pipet (voor aanvullende informatie over het voorbereiden van een mond pipet zie Wessel et al. 2004 ¹⁷ of Sweet et al. 2004 ^18).
   1. Wordt roeien pipet zodanig dat de diameter net groter is dan de diameter van de embryo zodat slechts een enkele zygote zal in en uit de pipet tegelijk. Dit zal toestaan ​​dat een enkele rij te vormen. Kleinere pipetten diameter kan de bevruchting envelop strippen en verstoren de zygoten als P. miniata zygotes hebben geen hyaline membraan eennd zijn vrij zacht.
   2. Als de zygotes niet houden aan de plastic schotel, bewaar ze voor extra tijd in zuur SW (tot enkele minuten). Als alternatief kan een kleinere diameter pipet kan helpen bij het verwijderen van gelei jas zodat de zygotes om effectiever te plakken.
   3. De zygoten zijn iets positief drijfvermogen en hebben de neiging te drijven of zweven boven de bodem van de schaal. In dat geval plaatst u het roeien pipet zodat de zygotes voorzichtig worden geperst op het oppervlak van de schotel als ze de pipet (Figuur 3D) af te sluiten.
      OPMERKING:. Het is toegestaan ​​om vele rijen passen op deze gerechten P. miniata embryonale membranen niet moeilijker te penetreren tijd en daarom kan men honderden zygoten injecteren van een gerecht.

4 Injectie van Zygotes

1. Bereid injectieoplossingen met geschikte concentraties van morfolino antisense oligonucleotiden (MASO), mRNA of DNA in een eindconcentration 200 mM KCl. 400-800 uM MASO en 2,5 ng / ul van DNA hebben de neiging om morphant fenotypes produceren terwijl het minimaliseren van toxiciteit. De eindconcentratie in het ei zal 1/125 ^ste de beginconcentratie ^14. Voor injectieoplossingen die MASOS, warmte 65 ° C gedurende 5 minuten onmiddellijk voor gebruik en bewaar bij kamertemperatuur.
   1. Voor het gemak sorteren geïnjecteerde embryo, commentaar rhodamine dextran tracer aan de injectieoplossing om een ​​concentratie van 0,1% verkregen.
2. Bereid injectienaalden door aan glazen capillaire buis (1,0 mm OD x 0,75 mm ID, 100 mm lengte) in een naald trekken instrument volgens de instructies van de fabrikant. Naalden geschikt voor injectie in zee-egels ook goed werken voor zeesterren, dus gebruik van soortgelijke parameters ^19.
3. Laad ongeveer 2 ui injectieoplossing in een injectienaald met een microloader pipetpunt.
4. Plaats het stompe einde van de naald in de manipulator. Stel picospritzer 100 msec puls en een luchtdruk van 40 psi.
5. Plaats een schotel van geroeid embryo's op de microscoop podium en alle embryo's in het gezichtsveld van. Oriënteren de schotel zodanig dat de ingesneden lijn aan de zijde het dichtst bij de naald. Plaats de naald onder een hoek van ongeveer 60 ° zodat de punt in het midden van de lijn en boven het oppervlak van het water.
6. Focus op de ingesneden lijn en laat de naald tot aan de punt komt in beeld. Laat de tip een beetje meer en breek hem open draaien door hem voorzichtig in de randen van de ingesneden lijn. Breng de punt van het oppervlak van de schaal en plaats het bovenaan de eerste rij van zygoten en focus op de zygoten.
7. Laat de tip zodanig dat het het centrum van de zygote komen uit rond een hoek van 60 ° zal spietsen. De naald dringt makkelijk P. miniata zygotes. Trap het voetpedaal (of ander materiaal dwingen van de injectienaald) een bolus van Inje introducerenctie oplossing in het embryo.
8. Doel een bolus die 20-30% van de diameter van de embryo, of tussen 25 en 80 pl. Indien de bolus groter of kleiner dan dit, passen de duur van injectie in de picospritzer en injecteer de volgende embryo. Blijf de duur op de gewenste bolusgrootte verkrijgen. Beginnen op 100 msec. Opnieuw breken de naald indien groter dan ongeveer 200 msec nodig om de juiste bolus voeren. Gooi de naald en een nieuwe te bereiden als minder dan 15-20 msec is nodig om deze bolusgrootte verkrijgen als de naald is te groot en kan de normale ontwikkeling verstoren.
9. Ga verder met de resterende zygotes injecteren op de injectie schotel. Embryo's kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd tot splitsing begint en in enkele blastomeren na de eerste splitsing. Periodiek til de naald boven het wateroppervlak te zygoten die stok op de naald te verwijderen. Indien noodzakelijk opnieuw breken de punt van de naald of plaats een nieuwe naald indien blokkering optreedt.

5. Verzamelen geïnjecteerde embryo's voor Downstream Analyse

1. Laat de embryo's ontwikkelen bij 15 ° C in SW. Een hoge oppervlak tot volume in de kweken om voor zuurstofuitwisseling. Zorgen embryo's zijn niet overvol; houden kweken op of onder 200 embryo / ml. Afhankelijk van de gewenste fase van embryo, van plan om geïnjecteerde embryo's te verzamelen om ongeveer 20-24 uur na de bevruchting.
   OPMERKING: Dit is vaak een ideale tijd om te sorteren en te verzamelen en omdat normaal ontwikkelende embryo's worden snel morfologisch onderscheiden, maar zijn nog niet zwemmen.
2. Als embryo's uitgekomen, zacht zout schok voor het zwemmen te voorkomen. Voeg 200 ul van 5 M NaCl tot 10 ml van SW in de injectie gerecht terwijl voorzichtig schudden van de SW. Na een paar minuten, zullen de embryo's vallen op de bodem van de schaal. Verzamel deze en verplaats deze naar de normale zoutgehalte SW.
3. Verzamel geïnjecteerde embryo's onder een geschikte fluorescerende lichtbron compatibel met de tracer in de injectieon oplossing. Indien geen tracer gebruikt rangschikken embryo te selecteren op normale morfologie.
4. Met mondpipet opneming fluorescerende embryo met een minimale hoeveelheid SW en blaas ze uit in een kleine kweekschaal gevuld met SW. Ideaal mond pipetten over een voldoende grote opening voor embryos in en uit te trekken zonder deze te beschadigen, maar niet zo groot dat ongewenste embryo en vreemde SW ook worden opgetrokken.
5. Zodra alle gewenste embryo's zijn verzameld in de nieuwe schaal, rekening met de embryo's onder tl-licht en verwijder alle niet-geïnjecteerde embryo of slecht ontwikkelde embryo's.
6. Cultuur naargelang embryo's om de gewenste stappen in een incubator en verder te gaan met beeldvorming of andere gewenste protocollen.

Resultaten

Het doel van dit protocol is om de reagentia te introduceren in embryo's. We tonen de effectiviteit van het protocol door het injecteren van een DNA-reporter-construct dat de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) aandrijft. Geïnjecteerde embryo express GFP in klonale pleisters (Figuur 4A-B) als de DNA bevat tijdens de vroege splitsing. Veel reagentia die wenselijk om in embryo zijn giftig in grote hoeveelheden en suboptimale partijen embryo. Toxiciteit manifesteert door het uitstellen van de o...

Discussie

Er zijn twee belangrijke stappen die moeilijk zijn voor beginnende gebruikers van deze techniek zijn, maar zijn essentieel voor het succesvol creëren van morphant embryo. De eerste is het selecteren van gezonde eicellen die rijpen en goed bemesten. Het percentage normale ontwikkeling in een cultuur afhankelijk van het seizoen, de gezondheid van de dieren en het aantal keren dat de eicellen van een enkel individu geoogst. Eicellen meestal van betere kwaliteit van april tot en met oktober te zijn. Het is van belang te let...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri schotels, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillairbuisjes	FHC, Inc	30-30-0	Voor het trekken van micro-injectienaalden
Model P-97 Naaldtrekker	Sutter Instruments	P-97
Dextraan, Rhodamine Groen	Life Technologies	D7163	Als je een GFP expressiereporter injecteert, is het handig om Texas Red dextran als injectietracer te gebruiken
Instant Ocean Zeezout	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Ook verkrijgbaar in veel dierenwinkels
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003