Methodenartikel

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

DOI:

10.3791/51937

⸱

29 november 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry, The Bruce and Ruth Rappaport Faculty of Medicine, The Technion-Israel Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwitinteracties zijn cruciaal voor de meeste, zo niet alle, fysiologische processen, en het begrijpen van de aard van dergelijke interacties is een centrale stap in biologisch onderzoek. Surface Plasmon Resonance (SPR) is een gevoelige detectietechniek voor het label-vrije onderzoek van biomoleculaire interacties in real time. In een typisch SPR-experiment wordt een component (meestal een eiwit, aangeduid als 'ligand') geïmmobiliseerd op een sensorchipoppervlak, terwijl de andere (de 'analyt') vrij in oplossing is en over het oppervlak wordt geïnjecteerd. Associatie en dissociatie van de analyt van de ligand worden gemeten en geplot in real time op een grafiek genaamd een sensogram, waaruit pre-evenwicht en evenwichtsgegevens worden afgeleid. Doordat SPR label-vrij is, kleine hoeveelheden materiaal verbruikt en pre-evenwicht kinetiekgegevens biedt, is het vaak de methode bij uitstek bij het bestuderen van de dynamische aspecten van eiwitinteracties. Echter, men moet in gedachten houden dat vanwege de hoge gevoeligheid van de methode, de verkregen gegevens zorgvuldig moeten worden geanalyseerd en ondersteund door andere biochemische methoden.

SPR is bijzonder geschikt voor het bestuderen van membraaneiwitten omdat het kleine hoeveelheden gezuiverd materiaal verbruikt en compatibel is met lipiden en detergentia. Dit protocol beschrijft een SPR-experiment dat de kinetiek van de interactie tussen een membraaneiwit (een ABC-transporter) en een oplosbaar eiwit (het cognate substraatbindende eiwit van de transporter) karakteriseert.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit interacties (PPI); de vorming en dissociatie van eiwitcomplexen, zijn belangrijke gebeurtenissen in veel biologische processen (bijvoorbeeld, replicatie, transcriptie, translatie, signalering, cel-cel communicatie). Semi-kwantitatieve studies van de PPI worden vaak uitgevoerd met behulp van pull-down of immuno-neerslag experimenten. Echter, deze (en dergelijke) technieken beperkt het bereik van affiniteiten die meetbaar (lage micromolaire affiniteit en hoger) door de wasstappen die inherent zijn aan dergelijke technieken. Dergelijke "eindpunt" technieken kunnen niet van voorbijgaande of lage affiniteit interacties die vaak van grote biologische g....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. eiwitmonster en Buffer Voorbereiding

  1. Monstervoorbereiding: zuiveren het eiwit van belang en of alle aggregaten worden verwijderd door het injecteren van het proteïne voorafgaand aan het experiment op een gelfiltratie kolom of ultracentrifugatie (meestal 10 min bij 100.000 xg is voldoende).
    OPMERKING: Hoewel wenselijk, zeer zuivere eiwit voorbereidingen zijn geen must. SPR is met succes gebruikt bij minder dan perfecte zuiveringen en zelfs droge stof 8,9.
  2. Buffer voorbereiding:
    1. Bereid de buffer van het experiment (genoemd "running buffer" of RB). Voor de hier beschreven protocol gebruikt 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM N....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het hier beschreven systeem wordt een NiNTA chip gebruikt om de His-tag membraan transporter 6,7 immobiliseren. Omdat het een homo-dimeer, wordt elke transporter dubbel gelabeld, verbetering van de binding aan de NiNTA chip. Volgende nikkellading, ligand A (de vervoerder van belang) wordt geïmmobiliseerd op Fc = 2, tot ~ 3500 RU (protocol cyclus 2, figuur 2A zwart label). Vervolgens worden met dezelfde stroomsnelheid en inspuitduur, ligand B (controle ligand) wordt geïnjecteerd Fc = 1, aan.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SPR is een zeer gevoelige methode om moleculaire interacties te bestuderen, en is vaak de enige aanpak die real-time monitoring van voorbijgaande aard (nog belangrijker) interacties zorgt. Een voorbeeld is de transiënte interactie hierin gepresenteerde, die niet kan worden gedetecteerd door een andere methode (pull-down assays liposomen sedimentatie 6 assays). Bovendien, terwijl andere werkwijzen zijn beperkt tot metingen evenwicht (kwantitatief of kwalitatief), SPR is een van de weinige technieken die meten .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek in het Lewinson-lab wordt ondersteund door subsidies van de Israel Academy of Science, het Rappaport Institute for Biomedical Research, de Meriuex Research Foundation en de Marie Curie carrière reïntegratie-subsidie (OL). EV wordt ondersteund door de Fine-beurs en door de Technion Faculty of Medicine. NLL wordt ondersteund door subsidies van de Israel Academy of Science.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01
Sensor Chip NTA GE Healthcare14100532
BIAevaluationGE Healthcare
Biacore T200 Software GE Healthcare
Nickel chlorideSigmaN6136
Sodium tungstate dihydrateSigmaT2629
Sodium Chloride Bio-Lab LTD.19030591
Trizma baseSigmaT1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)SigmaE5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)AffymetrixD310
Sodium dodecyl sulfate solution Sigma05030
Kimwipes KIMTECHKimberly-Clark34120
Hydrochloric acidGADOT7647-01-0
Nylon (NY) Membrane FilterSartorius25007--47------N
ModBC ABC transporterLewinson lab
RbsBC ABC transporterLewinson lab
ModA Substrate Binding ProteinLewinson lab

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
  2. Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interactie tussen eiwitreceptormembraaneiwit ABC transporterligandimmobilisatieinjectie van analytvoorbereiding van sensorchipconfiguratie van stroomcelassociatie dissociatiekinetiekevenwichtsdissociatieconstante

Gerelateerde artikelen