De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een live-cell based volbloed cytotoxiciteit assay (WCA), dat de toegang tot temporele informatie van de totale cel cytotoxiciteit laat is ontwikkeld met high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling. De beoogde tumorcel populaties eerst voorgeprogrammeerd immobilisatie in een array formaat en gelabeld met groen fluorescent cytosolische kleurstoffen. Na de cel matrix formatie, worden antilichamen drugs toegevoegd in combinatie met humaan volbloed. Propidium jodide (PI) toegevoegd aan celdood. De celmatrix wordt geanalyseerd met een automatische beeldvormingssysteem. Terwijl cytosole kleurstof etiketteert de beoogde tumorcel populatie, PI labelt de dode tumorcel populaties. Aldus kan het percentage van kanker doelwit celdoding gemaakt worden door het aantal overlevende doelcellen om het aantal dode doelcellen. Met deze methode, de onderzoekers in staat zijn om toegang te krijgen tot tijdsafhankelijke en dosis-afhankelijke cel cytotoxiciteit informatie. Opmerkelijk, geen gevaarlijke radiochemicaliën. De WCA hier gepresenteerde is getest met lymfoom, leukemie en solide tumor cellijnen. Daarom WCA stelt onderzoekers in staat om de werkzaamheid van geneesmiddelen te evalueren in een zeer relevante ex vivo toestand.
Inleiding
Recente vooruitgang in de farmaceutische industrie heeft geleid tot een toenemende belangstelling realiseren van de specifieke identificatie van tumorcellen antilichamen en gepersonaliseerde kankerbehandelingen; zijn echter een aantal belemmeringen bij het proces. Slechts 5% van de middelen die antikanker activiteit in preklinische ontwikkeling heeft zijn licentie na het tonen van onvoldoende werkzaamheid in fase II-III testen 1,2. De preklinische strategieën (zowel in vitro en in vivo) suboptimaal vele voorbeelden blijkt dat antitumorgeneesmiddelen zich anders gedragen in menselijke en in proefdieren vooral door hun verschillende bloedco....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Doel Celbereiding
- Handhaaf doelwitcellen (bijv. Raji lymfoomcellen) in kweekmedium (RPMI 1640-kweekmedium met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 4nM L-glutamine en 500 IE / ml penicilline / streptomycine) bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Centrifugeer het monster om de doelcellen pellet in een 15 ml buis. Centrifugeren varieert met verschillende celtypen; centrifugeer gedurende 3 min bij 468 xg gedurende Raji cellen.
- Zuig eerst eventuele luchtbellen gevormd op het oppervlak van de bovenstaande, en verwijder de gehele supernatant.
- Voeg 10 ml PBS aan de buis. Re-schorten ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Anti-CD20 antilichamen en lymfoom cellen (Raji cellen en MC / CAR) werd gekozen als modelsysteem voor de volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) 7,8 demonstreren. Raji cellen hadden hoge kopieaantal van CD20 op het celoppervlak, terwijl MC / CAR cellen had lage kopieaantal van CD20 op hun membraan. Doelcellen werden eerst gekleurd groen met groene fluorescentie cytosolische kleurstoffen en gerangschikt op de 96-well plaat. 10.000 - 50.000 doelwit lymfoomcellen werden geïmmobiliseerd in elk putje. 180 ul vers afge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
WCA is een cruciaal in vitro anti-kanker screening tool met enkele cel resolutie 12-16, idealiter gebruikt na de traditionele doelgroep screenings zoals CDC en ADCC testen 9-11, en voordat preklinische dierproeven. Momenteel, zijn primaire doel screening assays zoals CDC of ADCC testen allemaal uitgevoerd in een vereenvoudigd medium of een buffersysteem. Echter, kandidaat-geneesmiddelen die werkzaamheid vertonen in deze vereenvoudigde buffersysteem zijn niet altijd effectief in de comple.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken National Cancer Institute IMAT programma van NIH voor de financiering van dit werk [R33 CA174616-01A1].
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cellen |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 met L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal bovien serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolische kleurstof | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilaire) | Eureka Therapeutics | ||
| Menselijk volbloed | Allcells | WB001 | |
| Propidiumjodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatisch beeldvormingssysteem | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Celtellingsprogramma | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
Referenties
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
