De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een live-cell based volbloed cytotoxiciteit assay (WCA), dat de toegang tot temporele informatie van de totale cel cytotoxiciteit laat is ontwikkeld met high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling. De beoogde tumorcel populaties eerst voorgeprogrammeerd immobilisatie in een array formaat en gelabeld met groen fluorescent cytosolische kleurstoffen. Na de cel matrix formatie, worden antilichamen drugs toegevoegd in combinatie met humaan volbloed. Propidium jodide (PI) toegevoegd aan celdood. De celmatrix wordt geanalyseerd met een automatische beeldvormingssysteem. Terwijl cytosole kleurstof etiketteert de beoogde tumorcel populatie, PI labelt de dode tumorcel populaties. Aldus kan het percentage van kanker doelwit celdoding gemaakt worden door het aantal overlevende doelcellen om het aantal dode doelcellen. Met deze methode, de onderzoekers in staat zijn om toegang te krijgen tot tijdsafhankelijke en dosis-afhankelijke cel cytotoxiciteit informatie. Opmerkelijk, geen gevaarlijke radiochemicaliën. De WCA hier gepresenteerde is getest met lymfoom, leukemie en solide tumor cellijnen. Daarom WCA stelt onderzoekers in staat om de werkzaamheid van geneesmiddelen te evalueren in een zeer relevante ex vivo toestand.
Inleiding
Recente vooruitgang in de farmaceutische industrie heeft geleid tot een toenemende belangstelling realiseren van de specifieke identificatie van tumorcellen antilichamen en gepersonaliseerde kankerbehandelingen; zijn echter een aantal belemmeringen bij het proces. Slechts 5% van de middelen die antikanker activiteit in preklinische ontwikkeling heeft zijn licentie na het tonen van onvoldoende werkzaamheid in fase II-III testen 1,2. De preklinische strategieën (zowel in vitro en in vivo) suboptimaal vele voorbeelden blijkt dat antitumorgeneesmiddelen zich anders gedragen in menselijke en in proefdieren vooral door hun verschillende bloedcomponenten 3-5.
Om de noodzaak van een anti-tumor drug discovery platform te pakken en om een check-point voor dure dierproeven en klinische proeven te verschaffen, is een humaan volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) voorgesteld voor de evaluatie van anti-tumor werkzaamheid van het geneesmiddel in een meer relevante biologische omgeving. Hetvolbloed cytotoxiciteit assay kan worden gebruikt om de respons van de individuele cellen om antilichamen en andere geneesmiddelkandidaten in humaan volbloed evalueren.
De WCA wordt ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met high-throughput en high-inhoud imaging 6. Door gebruik van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem, kan het aantal van zowel levende en dode cellen te bepalen met een hoge nauwkeurigheid. Vanwege het feit dat de doelcellen worden geïmmobiliseerd op dezelfde focal plane, WCA kan kwantitatieve analyse cytotoxiciteit in realtime verschaffen zonder het verwijderen van rode bloedcellen. Bovendien is het automatisch afbeeldingssysteem verschaft verscheidene voordelen zoals dat alleen doelcellen dat de opgegeven criteria bereikt (bijv., Fluorescent gelabelde cellen en celmorfologie) worden afgesloten en verwerkt. Ook maakt de productie van 144 platen per dag. Bijgevolg deze imaging mogelijkheden en doorvoer maakt werking van high-cNHOUD en high-throughput experimenten gelijktijdig. Door het combineren WCA en het automatische beeldvormingssysteem kunnen hoge throughput kwantitatieve cel cytotoxiciteit analyse worden verwezenlijkt in een biologisch relevante omgeving.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Doel Celbereiding
- Handhaaf doelwitcellen (bijv. Raji lymfoomcellen) in kweekmedium (RPMI 1640-kweekmedium met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 4nM L-glutamine en 500 IE / ml penicilline / streptomycine) bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Centrifugeer het monster om de doelcellen pellet in een 15 ml buis. Centrifugeren varieert met verschillende celtypen; centrifugeer gedurende 3 min bij 468 xg gedurende Raji cellen.
- Zuig eerst eventuele luchtbellen gevormd op het oppervlak van de bovenstaande, en verwijder de gehele supernatant.
- Voeg 10 ml PBS aan de buis. Re-schorten de cellen door pipetteren de oplossing op en neer meerdere malen te breken van de cel klomp.
- Centrifugeer het monster gedurende 3 min bij 468 x g.
- Zuig eventuele luchtbellen gevormd op het oppervlak van de bovenstaande, en verwijder de gehele supernatant.
2. Bereiding van Cell Microarrays
- Obtain celaanhechting 96 well plaat kits of single cell array-8 goed kamer dia's (zie tabel van materialen / reagentia).
- Breng 1.2 ul van de activator aan het DNA reagens uit de set. Cap de flacon, omkeren, en schud om de oplossing te mengen.
- Laat de oplossing reageren gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Breng de gemengde oplossing aan de doelcellen pellet (in de 15 ml buis).
- Voeg groene fluorescentie cytosolische kleurstoffen bij een uiteindelijke concentratie van 500 nM.
- Incubeer de doelcellen met de gemengde oplossing en de kleurstof gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat.
- Was de cellen tweemaal met 5 ml PBS en resuspendeer de cellen in 10 ml groeimedium.
- Breng 100 pi van de oplossing uit stap 2.7 in elk putje. Tel het aantal cellen met behulp van een hemacytometer. Zorg ervoor dat mobiele nummers variëren tussen 5 × 4-1 oktober × 10 6 cellen per well.
- Na 10-15 min incubatie bij kamertemperatuur voorzichtig te wassen de monsters tweemaal met 200-300 ul groeimedia naar ongebonden cellen te verwijderen.
OPMERKING: Over 5-10 ul groeimedia blijft in elk putje na het wassen.
3. volbloed cytotoxiciteitsbepalingen
- Voeg 180 ul humaan totaal bloed elk monster goed.
- Verkrijgen Anti-CD20 antilichaam oplossing bij 5 mg / ml, en uitvoeren seriële verdunning om 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml anti-CD20 antilichaam oplossing in 1,5 ml buizen. Voeg 20 pl van elke concentratie van anti-CD20 antilichaam aan elk monster goed maken triplo.
- Voeg Propidiumjodide bij een uiteindelijke concentratie van 500 nM in elk putje.
- Incubeer de verkregen plaat bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 16 uur.
- Beeld de cellen op de dia's of 96 well platen met een automatische beeldvormingssysteem met 8x vergroting.
- Gebruik de celtelling programma automatisch beeldvormingssysteem het kwantificeren.
OPMERKING: De software van de automatische imaging systeem biedt eenvoudigestap voor stap handelingen voor celtelling. Het protocol van het gebruik van deze software is te vinden op de website van provider. - Selecteer [Bekijken Resultaten] vanaf de hoofdpagina van de software.
- Selecteer [het bestand hebt opgeslagen voor de monsters].
- Eerste poort FITC gemiddelde intensiteit> 50, dan poort TxRed gemiddelde intensiteit> 20.
- Selecteer [Plate Overzicht].
- Selecteer [Export Tables].
OPMERKING: Het percentage doden van cellen formule van het programma is hieronder weergegeven:
% Targeted killing = (# van cellen gekleurd zowel groen als rood / # van cellen gekleurd groen) * 100%
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Anti-CD20 antilichamen en lymfoom cellen (Raji cellen en MC / CAR) werd gekozen als modelsysteem voor de volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) 7,8 demonstreren. Raji cellen hadden hoge kopieaantal van CD20 op het celoppervlak, terwijl MC / CAR cellen had lage kopieaantal van CD20 op hun membraan. Doelcellen werden eerst gekleurd groen met groene fluorescentie cytosolische kleurstoffen en gerangschikt op de 96-well plaat. 10.000 - 50.000 doelwit lymfoomcellen werden geïmmobiliseerd in elk putje. 180 ul vers afge...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
WCA is een cruciaal in vitro anti-kanker screening tool met enkele cel resolutie 12-16, idealiter gebruikt na de traditionele doelgroep screenings zoals CDC en ADCC testen 9-11, en voordat preklinische dierproeven. Momenteel, zijn primaire doel screening assays zoals CDC of ADCC testen allemaal uitgevoerd in een vereenvoudigd medium of een buffersysteem. Echter, kandidaat-geneesmiddelen die werkzaamheid vertonen in deze vereenvoudigde buffersysteem zijn niet altijd effectief in de comple...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken National Cancer Institute IMAT programma van NIH voor de financiering van dit werk [R33 CA174616-01A1].
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cellen |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 met L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal bovien serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolische kleurstof | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilaire) | Eureka Therapeutics | ||
| Menselijk volbloed | Allcells | WB001 | |
| Propidiumjodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatisch beeldvormingssysteem | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Celtellingsprogramma | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
Referenties
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85(2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
