RNA-Seq Analyse van differentiële genexpressie in Geëlektroporeerde Chick Embryonale Spinal Cord

Samenvatting

Deze video toont de basisstappen voor het uitvoeren van een volledige transcriptoomanalyse op gedissecteerde vogelembryonale ruggenmergmonsters na transfectie met in ovo elektroporatie.

Samenvatting

In ovo elektroporese van de neurale buis van het kippenembryo is een snelle en goedkope methode voor het identificeren van genfunctie tijdens neurale ontwikkeling. Genoombreed analyse van differentieel tot expressie gebrachte transcripten na een dergelijke experimentele manipulatie heeft het potentieel om een bijna compleet beeld te onthullen van de downstream effecten veroorzaakt door het getransfecteerde construct. Dit werk beschrijft een eenvoudige methode voor het vergelijken van transcriptomen van monsters van getransfecteerde embryonale ruggenmerghelften, inclusief alle stappen tussen elektroporese en identificatie van differentieel tot expressie gebrachte transcripten. De eerste fase bestaat uit richtlijnen voor elektroporese en instructies voor het dissekeren van getransfecteerde ruggenmerghelften van HH23-embryo's in een ribonuclease-vrije omgeving en de extractie van hoogwaardige RNA-monsters die geschikt zijn voor transcriptoomsequentiebepaling. De volgende fase is die van bio-informaticaanalyse met algemene richtlijnen voor het filteren en vergelijken van RNA-Seq-datasets op de openbare Galaxy-server, waardoor de noodzaak van een lokale computationele structuur voor kleine tot middelgrote experimenten wordt geëlimineerd. De representatieve resultaten tonen aan dat de dissectiemethoden hoogwaardige RNA-monsters genereren en dat de transcriptomen verkregen uit twee controlemonsters in wezen hetzelfde zijn, een belangrijke vereiste voor de detectie van differentieel tot expressie gebrachte genen in experimentele monsters. Verder wordt een voorbeeld gegeven waarin experimentele overexpressie van een DNA-construct visueel kan worden geverifieerd na vergelijking met controlemonsters. De toepassing van deze methode kan een krachtig hulpmiddel zijn om nieuwe ontdekkingen over de functie van neurale factoren betrokken bij de vroege ontwikkeling van het ruggenmerg te vergemakkelijken.

Inleiding

Genetische studies voor levende organismen gebruiken regelmatig het kippenembryo als model omdat in ovo elektroporatie is een snelle en goedkope manier gedeeltelijk transfecteren embryonale structuren in vivo met DNA constructen ^1-5. Bicistronische expressie vectoren die een transcript met een fluorescerende reporter tezamen met het gen van belang, zoals pCIG ⁶ of ⁷ PME's coderen, zodat snelle verificatie van transfectie kwaliteit in het gewenste gebied onder een stereomicroscoop voor verwerking embryo voor downstream analyse.

Met de recente vooruitgang in DNA sequencing, is het nu mo....

Protocol

1. electroporate de Construct of Interest in de Neural Tubes van HH12-13 kippenembryo's In ovo

Gebruik een fluorescerende reporter, bij voorkeur in een bicistronisch transcript of gefuseerd met het eiwit van belang met een intercalerende virale 2a peptide ^11, snel identificeren van personen met bevredigende niveaus van transfectie mogelijk. OPMERKING: Typische incubatietijd voor deze fase bedraagt ​​ongeveer 48 uur bij 37,8 ° C.

1. Open een klein venster in de eieren na het verwijderen van 3 ml van albumine met een spuit gekoppeld aan een 18 G x 1 1/2 naald. Embryo visualisatie verbeteren, injecteert een kl....

Resultaten

Om de beschreven methode te valideren, werden twee controlemonsters gegenereerd uit embryo geëlektroporeerd met de lege vector PMEs ⁷ en één monster uit embryo's getransfecteerd met dezelfde vector die het insert construeren SCRT2-ZNF, die het zink-vinger domeinen van kip SCRT2 ¹⁸ codeert. Monsters waarbij 11-22 ug totaal RNA elk werden verkregen van pools van 8 tot 12 embryo. Alle drie monsters scoorden optimale RIN waarde van 10 in een kwaliteitscontrole uitgevoerd met de Bioanalyzer instrume.......

Discussie

Hier geven we richtlijnen voor het analyseren van effecten na elektroporatie van de kip ruggenmerg. Hoewel elektroporatie van DNA vectoren wordt vaker gebruikt om een gen van interesse overexpressie kan men ook constructen coderen voor dominant negatieve, quimeric eiwitten of precursors gebruiken siRNAs van genfunctie neerhalen voorwaarden ^19-21 genereren. In feite kan de vergelijking van transcriptome profielen als gevolg van zowel de gain en verlies-van-functie analyse wijzen genen verschillend tot expressi.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Indiaanse inkt	Elke leverancier
18G x 1 1/2 naald	BD	305196
3 ml spuit	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye gebruikt om DNA-injectie te visualiseren
Ringer's oplossing (1 L)
- 7,2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0,225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0,217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O tot 800 ml en pas pH aan tot 7,4
- ddH2O tot 1 L
- Filter en autoclaveer
PBS (fosfaat gebufferde oplossing) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1,15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O tot 800 ml en pas pH aan tot 7,2
- ddH2O tot 1 L en filter
- 1 ml DEPC (diethylpyrocarbonaat)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Schakel krachtig en laat een nacht op kamertemperatuur staan
- Autoclaveer
Gezeefde lepel	Elke leverancier
Steriele 60 x 15 mm polystyreen petrischalen	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontaminatieoplossing	Life Technologies	AM9780
Fijne chirurgische schaar	Elke leverancier
Rechte fijne punt tang	Elke leverancier
Getrokken glazen naald gemaakt van 1,1 x 75 mm glazen capillaire buisjes	Kimble Chase	40A502
9' glazen Pasteurpipet	Elke leverancier
Handmatige pipettenpomp	Elke leverancier
Doorzichtige 1,5 ml microcentrifugepolypropilene buisjes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Elke leverancier
RNAlater oplossing voor RNA-stabilisatie	Life Technologies	AM7020
RNAqueous totaal RNA-isolatiekit	Life Technologies	AM1912
Moleculaire biologiekwaliteit Ethanol	Elke leverancier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002