Embolische midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) voor ischemische beroerte met homologe bloedstolsels in Ratten

Samenvatting

In dit artikel demonstreren we een standaardmethode voor het produceren van een embolische middelste hersenslagaderocclusie met homologe bloedstolsels (rijk aan fibrine) bij volwassen ratten. Dit model bootst de menselijke ischemische beroerte na en is geschikt voor preklinisch onderzoek van trombolytische therapie voor ischemische beroerte.

Samenvatting

Klinisch trombolytische therapie met gebruik van recombinant tissue plasminogen activator (tPA) altijd de meest effectieve behandeling van acute ischemische beroerte. Echter, het gebruik van tPA beperkt door de nauw therapeutisch en verhoogd risico hemorragische transformatie. Er is een dringende behoefte aan geschikte takt modellen te ontwikkelen om nieuwe trombolytica en strategieën te onderzoeken voor de behandeling van ischemische beroerte. Op dit moment zijn er twee belangrijke types van ischemische beroerte modellen ontwikkeld bij ratten en muizen: intraluminale hechtdraad MCAO en embolische MCAO. Hoewel MCAO modellen via de intraluminale hechting techniek zijn op grote schaal gebruikt in mechanisme aangedreven stroke onderzoek, deze hechting modellen niet de klinische situatie nabootsen en zijn niet geschikt voor trombolytische studies. Van deze modellen is de embolische MCAO model nabootst menselijke ischemische beroerte en is geschikt voor preklinische onderzoek trombolytische therapie. Dit embolische model werd eerst ontwikkeld in ratten Overgaard ea. ¹ in 1992 en verder gekenmerkt door Zhang et al. in 1997 ^2. Hoewel embolische MCAO heeft opgedaan steeds meer aandacht, er zijn technische problemen van veel laboratoria. Om de toenemende behoefte aan trombolytische onderzoek op te lossen, stellen we een zeer reproduceerbaar model van embolische MCAO in de rat, die een voorspelbare infarct volume binnen het gebied MCA kan ontwikkelen. In het kort wordt een gemodificeerd PE-50 buis voorzichtig geavanceerd van de externe halsslagader (ECA) in het lumen van de interne halsslagader (ICA) tot de punt van de catheter de oorsprong van de MCA bereikt. Door de catheter, wordt een homoloog bloedstolsel geplaatst aan de basis van de MCA. Om het succes van MCA occlusie te identificeren, werd de regionale cerebrale doorbloeding gecontroleerd, werden neurologische tekorten en infarct volumes gemeten. De technieken die in dit document moeten de onderzoekers van technische problemen voor de oprichting van dit model voor een beroerte onderzoek te overwinnen helpen. </ P>

Inleiding

Beroerte is de derde doodsoorzaak in de Verenigde Staten, maar opties voor de behandeling van acute beroerte beperkt blijven. Momenteel intraveneuze infusie van recombinant tissue plasminogen activator (tPA) het oplossen van bloedstolsels is de meest efficiënte behandeling van acute ischemische beroerte. Echter, het gebruik van tPA beperkt door de nauw therapeutisch en verhoogd risico intracerebrale bloeding. Daarom is een model van een beroerte die geschikt zijn voor trombolytische onderzoek dringend nodig.

De middelste cerebrale slagader (MCA) is de slagader meestal opgesloten in een beroerte bij mensen. Gericht op dit slagader, hebben veel dieren modellen van ischemische beroerte vastgesteld. Op dit moment zijn er twee belangrijke types van knaagdieren focale ischemie modellen door occlusie MCA ontwikkeld: hechtdraad MCAO model en embolische MCAO model. Hoewel MCAO modellen via de intraluminale hechtdraad techniek zijn op grote schaal gebruikt in-mechanisme gedreven beroerte onderzoek, deze hechtingen modellen nietnabootsen menselijke beroerte, zoals tot 80% van menselijke beroertes worden veroorzaakt door trombose of embolie. Echter, embolische beroerte model met behulp van bloedstolsels nauw bootst de menselijke beroerte en is geschikt voor trombolytische studie beschouwd. Dit embolische model werd voor het eerst ontwikkeld in ratten door Overgaard et al. ¹ in 1992 en verder gekenmerkt door Zhang et al. In 1997 ² en door Dinapoli et al. In 2006 ^3. Hoewel embolische MCAO heeft opgedaan steeds meer aandacht, er zijn technische problemen door vele laboratoria.

In dit artikel tonen we een standaard werkwijze voor het produceren embolische MCAO met homologe bloedstolsels in de volwassen rat, die een voorspelbare infarct binnen het grondgebied MCA kan ontwikkelen. De technieken die in dit artikel zou moeten helpen onderzoekers bij technische problemen te overwinnen voor het vaststellen van dit model voor een beroerte onderzoek.

Protocol

Ethiek Verklaring: Mannelijke volwassen Sprague-Dawley ratten (met een gewicht van 330-380 g) werden gebruikt in dit protocol. Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) bij de LSU Health Science Center-Shreveport en is in overeenstemming met de 'Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren' (achtste editie, National Academy of Sciences, 2011 ).

1 Voorbereiding van Modified PE-50 Tube

1. Het bezit van een 30 cm lange PE-50 buis boven een gashaard met de handen, geleidelijk zachter de buis. Voorzichtig rekken van de buis.
2. Selecteer een punt op de verstrekte buis met een digitale schuifmaat (figuur 1), markeren, en snijd de gemodificeerde PE-50 buis in een 25 cm lang segment met een 1 cm lang tip (buitendiameter: 0,30-0,34 mm).

2 Voorbereiding van homologe Bloedstolsels

1. Verdoven van de rat met isofluraan (5% voor inductie, 2-3% voor onderhoud) in 70% N ₂ O en 30% O _{2 door een gezichtsmasker voor bloedafname. Bevestig verdoving door een teen knijpen.}
2. Voeren femorale arteriële canule van een donor ratten met gepubliceerde methode ⁴ en overdragen slagader bloed direct in een 20 cm lange PE-50 buis. Plaats de buis 2 uur bij kamertemperatuur stollen van bloed, en behoudt de buis gedurende 22 uur bij 4 ° C. Opmerking: Canulatie wordt uitgevoerd met behulp van een aseptische techniek zoals beschreven in stap 3.1. De donor rat wordt teruggewonnen voor verdere bemonstering.
3. Snij de PE-50 buis in 50 mm segmenten en het spoelen van het stolsel uit de buis in een steriele petrischaal met een fysiologische zoutoplossing.
4. Breng de 50 mm lange stolsel in een 60 mm PE-10 buis en sluit elk uiteinde van de PE-10 buis een 20 cm lange PE-50 buis verbonden met 1 ml spuit met zoutoplossing met 23 G naald (figuur 2) .
5. Schuif het stolsel door continu alternerende beweging van de ene spuit naar de andere gedurende 5 min, die bloedcellen uit kan verwijderenhet stolsel en het minimaliseren van de fragiele van extravasculair gestolde stolsel, zonder verstoring van de fibrine-kern.
6. Snijd de klonter in een 40 mm lang segment en breng de klonter segment in een gemodificeerde PE-50 katheter zoals beschreven in stap 1.2 onder aseptische omstandigheden. Opmerking: Alle PE buis wordt gesteriliseerd met ethyleenoxide.

3 Embolische midden cerebrale slagader occlusie (figuur 3A, B)

1. Steriliseer alle chirurgische instrumenten autoclaaf (minimaal 121 ° C, 15 psi, gedurende 15 min). Ontsmetten van de operatie tafel en de bijbehorende chirurgische apparatuur met 70% ethanol.
2. Verdoven de rat met isofluraan zoals beschreven in stap 2.1. Test de diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een teen knijpen aan beide achterste poten, en alle waargenomen beweging (terugtrekken van de poot) geeft aan dat het dier is niet voldoende verdoofd om de operatie te doen. Breng een kleine hoeveelheid van de dierenarts zalf op beide ogen tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose. Scheer de vacht op de ventrale nek en hoofd reregio's met een elektrische tondeuse om de huid bloot.
3. Plaats de rat in rugligging op een verwarmingselement. Plaats een rectale sonde, controle en onderhoud van de lichaamstemperatuur tussen 36,5-37,5 ° C met behulp van een homeothermic deken regeleenheid.
4. Ontsmet de geschoren huid rondom bont met 10% povidon-jood, gevolgd door 70% ethanol.
5. Maak een 2-cm-lange middellijn incisie op de hals onder een stereomicroscoop. Gebruik retractors aan het chirurgische veld bloot te leggen en te ontleden de juiste gemeenschappelijke halsslagader (CCA), externe halsslagader (ECA), de interne halsslagader (ICA), en pterygopalatine slagader (PPA) vrij van omliggende zenuwen en fascia (Figuur 3A). Opmerking: Voor de operatie, veranderen steriele handschoenen als er geen assistent helpt om het dier te bereiden.
6. Ontleden de CCA vrij van de omliggende zenuwen (zonder nadelige gevolgen voor de nervus vagus) en plaats een steriele 5-0 zijden hechtdraad onder de slagader. Bind een slip knoop (# 1) en pak de hechtdraad met een kleine Hemostat en trek onderwezen in de richting van het lichaam.
7. Ontleden van de Europese Rekenkamer en de twee takken, de occipitale slagader (OA) en de superieure schildklier slagader (STA). Stollen twee takken met behulp van een veterinaire elektrochirurgische eenheid. Leg twee stukken van steriele 6-0 zijde hechtingen onder de Europese Rekenkamer.
8. Scheid de beide zijde onder de slagader, een stuk naar de kop (distale uiteinde) en de andere naar het lichaam geplaatst. Das een strakke ligatuur (# 2) aan de kant die het dichtst bij het hoofd, pak de zijde met kleine hemostats en trek onderwezen in de richting van het hoofd. Bereid een losse knot (# 3) met de andere zijde om later te gebruiken.
9. Ontleden de ICA en de PPA van de omliggende zenuwen (zonder nadelige gevolgen voor de nervus vagus). Bind de PPA met een 6-0 hechtdraad (# 4). Maak een slip knoop met 6-0 hechtdraad rond de ICA (# 5). Of knip de ICA met een microvasculaire clip.
10. Knip een klein gaatje (1/2 thru) naar de Europese Rekenkamer tussen de strakke (2 #) en losse (# 3) ligaturen met een Vannas-stijl voorjaar schaar. Plaats de aangepaste PE-50-bade met bloedstolsel in de incisie en vooraf aan de splitsing van de CCA. Draai de losse ligatuur (# 3) rond het lumen net genoeg om veilig te bewaren mobiliteit van de in-woning buis.
11. Afgesneden van de Rekenkamer op de plaats van kleine gat om de stomp te bevrijden en de positie van de stomp onder de splitsing van de Rekenkamer en ICA; Dit zal toelaten de gewijzigde buis gemakkelijk in de ICA. Open de ICA en voorzichtig vooraf de buis uit het lumen van de ERK in de ICA totdat de punt van de catheter de oorsprong van de MCA bereikt (~ 17 mm van de bifurcatie). Opmerking: Voordat steek de punt van de buis in de ECA, steriele het buitenste oppervlak van de buis met 70% ethanol, en daarna wassen met steriele fysiologische zoutoplossing.
12. Injecteer de prop door de gemodificeerde PE-50 katheter samen met 10 pi zoutoplossing dan 10 seconden met 100 pl Hamilton spuit (Figuur 3B).
13. Trek de katheter van de Rekenkamer 5 min later. Bind de Rekenkamer en heropenen CCA. Hecht de incisie in de nek.

4 Monitoring Regionale Cerebral Blood Flow (rCBF)

1. Vóór MCA occlusie, maak 1,2 cm middellijn incisie in de hoofdhuid aan de schedel bot bloot. Verwijder de weefsels op de schedel bot met een tandheelkundig schraper en steriele wattenstaafjes. Opmerking: Voor de operatie, het blootgestelde hoofdhuid stippellijn rond bont ontsmet met 10% povidon-jood, gevolgd door 70% ethanol.
2. Boor een 1,5 mm diameter boorgat zich op 2 mm posterior en 5 mm lateraal van de bregma met 0,7 mm roestvrij staal sferische burr (figuur 4).
   OPMERKING: Houd de dura intact.
3. Plaats de probe 0,5 mm boven het oppervlak dura. Controleer de rCBF met 0 (baseline), 5, 15, 30, 60, 90 en 120 minuten na embolisatie en verder met 5, 15, 30, 45 en 60 minuten na intraveneuze toediening van tPA. Na de laatste meting van rCBF, wordt de hoofdhuid incisie gesloten met hechtdraad. Opmerking: Voorafgaand aan nek incisie meten we rCBF als basislijn voor MCA occlusion. Bericht MCA occlusie meten we rCBF na hechtdraad sluiting van nek incisie. Zo wordt de nek incisie steriel bewaard.

5 Post-operatieve Zorg

1. Injecteer 2,5 ml zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen en injecteer Buprenex (0,05 mg / kg, SC) onmiddellijk na de operatie en elke 6-12 uur als nodig voor pijnbestrijding.
2. Stop isofluraananesthesie. Plaats de rat in een 37 ° C veterinaire recovery kamer (houden van dieren warm) en houd observatie. Het duurt meestal 10 min voor de rat om te herstellen van de anesthesie. Zet dan het dier in een gesteriliseerde kooi, plaats enkele bevochtigd eten in een petrischaal in de kooi, en terug de kooi om dieren sterilisatie kamer.
3. 24 uur na een beroerte, euthanaseren de rat met een overdosis van natriumpentobarbital (100 mg / kg lichaamsgewicht, IP).

6 neurologische uitval Score

1. Voer de Bederson score voor en 2 uur na embolisatie. Gebruik een grading scale 0-3 zoals eerder beschreven ^5: 0, waardoor de rat door staart, het dier uitstrekkende beide voorpoten naar de vloer en vertonen geen andere gebreken (normale verplaatsing); 1, het verhogen van de rat door de staart, buig de contralaterale voorpoot; 2, verminderde weerstand tegen zijdelingse druk (en voorpoot flexie) zonder cirkelen; 3, hetzelfde gedrag als graad 2 met cirkelen.
   OPMERKING: Ratten tonen Bederson score = 0 (geen tekort) op 2 uur na embolisatie worden uitgesloten van verdere studie.

Resultaten

Laser Doppler flowmetry (LDF) werd gebruikt voor bewaking rCBF tijdens de inductie van cerebrale ischemie ^6,7. Veel laboratoria waaronder ons laboratorium hebben gebruikt rCBF dieren met succesvolle MCA occlusie identificeren, maar de drempelwaarden basislijn varieerde tussen laboratoria die verband houden met de plaats van de meting. De sonde van de LDF is gepositioneerd op 2 mm posterior en 5 mm lateraal aan de bregma zoals eerder beschreven ^6. rCBF werd bij 0, 5, 15, 30, 60, 90 en 120 minuten na...

Discussie

In deze studie hebben we aangetoond een standaard werkwijze voor het uitvoeren van een embolische beroerte MCAO model in de rat, waarbij de oorsprong van de MCA wordt afgesloten door een fibrine-rijke stolsel. Het grote voordeel van dit model is: de occlusie van de steel van MCA met een fibrine-rijke bloedstolsel lijkt op trombo-embolische beroerte bij mensen, het embolische beroerte model kan preklinisch onderzoek fibrinolyse en dat dit model kan ontwikkelen een reproduceerbare en voorspelbare infarctvolume binnen de d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
rh-tPA	Chemisch	Genentech
2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride	Chemisch	Sigma	T8877
Anesthesie-verdamper	Uitrusting	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Oplaadbare hoge snelheid microboor	Uitrusting	Fine Science Tools	18000-17
Gebogen schaar	Uitrusting	Fine Science Tools	14117-14
Dumont-tang (Medisch #7)	Uitrusting	Fine Science Tools	11270-20
Dumont-tang (Medisch #5)	Uitrusting	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-stijl veerschaar	Uitrusting	Fine Science Tools	15000-03
Veterinaire herstelkamer	Uitrusting	Peco Services	V1200
Genie plus spuitpomp	Uitrusting	Kent Scientific Corporation
Rattenbreinmatrix	Uitrusting	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digitale schuifmaat	Uitrusting	World Precision Instruments	501601
Dissectiemicroscoop	Uitrusting	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton-spuit	Uitrusting	Hamilton	model 710
Homeotherme dekenregelunit	Uitrusting	Harvard Apparatus
Elektrische tondeuse	Uitrusting	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinaire elektrochirurgische unit	Uitrusting	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Bloedflowmeter	Uitrusting	Adinstruments
PowerLab 4/30	Uitrusting	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml-spuit	Verbruiksartikel	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G-naald	Verbruiksartikel	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G-naald	Verbruiksartikel	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 slang	Verbruiksartikel	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 slang	Verbruiksartikel	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Zijde-draad	Verbruiksartikel	Harvard apparatus	723287
5-0 Zijde-draad	Verbruiksartikel	Harvard Apparatus	517607