Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Samenvatting

Dit protocol geeft een efficiënte en betrouwbare methode voor de menselijke THP-1 macrofagen met siRNA of plasmide-DNA te transfecteren door elektroporatie met hoge transfectie efficiëntie met behoud van hoge cel vitaliteit en volledige capaciteit macrofaag differentiatie en polarisatie.

Samenvatting

Macrofagen, als de belangrijkste spelers van de aangeboren immuunrespons, zijn bij de focus van het onderzoek te maken met weefselhomeostase of verschillende pathologieën. Transfectie met siRNA en plasmide-DNA is een efficiënt hulpmiddel voor de functie bestuderen, maar transfectie van macrofagen is geen triviale zaak. Hoewel veel verschillende benaderingen voor transfectie van eukaryote cellen zijn beschikbaar, maar weinig toe betrouwbare en efficiënte transfectie van macrofagen, maar verminderde cel vitaliteit en ernstig gestoorde cel gedrag zoals verminderde mogelijkheden voor differentiatie en polarisatie worden vaak waargenomen. Een transfectie protocol is daarom nodig dat in staat is om siRNA en plasmide DNA in macrofagen zonder ernstige bijwerkingen waardoor het onderzoek van het effect van siRNA of plasmide in het kader van normale celgedrag. De hier gepresenteerde protocol verschaft een werkwijze voor het betrouwbaar en efficiënt transfecteren van humane THP-1 macrofagen en monocytes met hoge cel vitaliteit, hoge transfectie-efficiëntie en minimale effecten op cel gedrag. Deze benadering is gebaseerd op Nucleofection en het protocol werd geoptimaliseerd om maximale capaciteit voor celactivering na transfectie handhaven. Het protocol is geschikt voor hechtende cellen na losmaken alsook cellen in suspensie en kan worden gebruikt voor kleine tot middelgrote aantallen monsters. Dus de gepresenteerde werkwijze nuttig voor het onderzoeken genregulerend effecten tijdens macrofaag differentiatie en polarisatie. Naast het presenteren van de resultaten karakteriseren macrofagen getransfecteerd volgens dit protocol in vergelijking met een alternatieve chemische methode, wordt de impact van celcultuurmedium selectie na transfectie op mobiele gedrag besproken. De gepresenteerde gegevens wijzen op het belang van het valideren van de selectie voor de verschillende experimentele instellingen.

Inleiding

Van de cellulaire bestanddelen van het menselijke immuunsysteem, macrofagen van groot belang voor de aangeboren immuunrespons. Hun taken zijn divers; zij worden gebruikt voor fagocytose van pathogenen en necrotisch materiaal, spelen ze een belangrijke rol in weefsel homeostase en produceren en scheiden een groot aantal cytokinen te reguleren en orkestreren de immuunrespons ^1. Daarom macrofagen integraal betrokken bij vele fysiologische processen en pathofysiologische omstandigheden. Door de diversiteit van hun taken, macrofagen zijn een zeer heterogene en veelzijdige celtype. Dit wordt bereikt door verschillende polarisaties; afhankelijk van externe stimuli macrofagen kunnen ontwikkelen tot verschillende fenotypes ^2. Variabiliteit en de impact macrofagen 'op de immuunrespons maken ze een zeer interessant onderwerp. Om hun complexe metabolische en regulerende functies, nodig macrofaag ontrafelen in vitro modellen required die juist reflecteren macrofagen heterogeniteit en variabiliteit.

Transfectie van cellen met plasmide-DNA vectoren of kleine interfererende RNA's (siRNA's) teneinde cellulaire genexpressie veranderen is een veelgebruikt en krachtig instrument celbiologie voor het onderzoeken van zowel genregulatie en genfunctie. Momenteel is er een grote selectie van verschillende hulpmiddelen beschikbaar voor transfectie van eukaryote cellen. Deze hulpmiddelen omvatten de toepassing van virale vectoren, mechanische werkwijzen (bijvoorbeeld gen pistolen), chemische methoden (die berusten op polymeren of lipiden die complexen met nucleïnezuren kunnen vormen) en elektroporatie van cellen ^3. Al deze benaderingen hebben hun voordelen en nadelen en het kiezen van de meest geschikte uit deze gemak voor een specifiek celtype en toepassing kan een moeilijk en tijdrovend proces.

Macrofagen zijn notoir moeilijk om als bijna alle gerenommeerde Transfe transfecterenctie benaderingen levensvatbaarheid macrofagen 'drastisch te verminderen of interfereren met hun gedrag, dwz differentiatie en in het bijzonder polarisatie. Daarom presenteren we hier een efficiënt, niet-virale protocol voor humane THP-1 macrofagen via de elektroporatie gebaseerde Nucleofector technologie die een optimale elektroporatie waarbij met verminderde hoeveelheden DNA vertegenwoordigt transfecteren. Nucleofection is zeer geschikt voor gevoelige cellen zoals monocyten en macrofagen. Dit protocol is een aanpassing van de eerder gepubliceerde versies ^4,5.

In het kort, is forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) toegepast om menselijke THP-1 monocyten differentiëren gedurende 48 uur in premature macrofagen voor transfectie met siRNA of plasmide DNA. Voor transfectie de predifferentiated macrofagen zijn enzymatisch losgemaakt door Accutase I behandeling. De transfectie wordt uitgevoerd met een Nucleofector 2b inrichting voor elektroporatie van de cellen. Na transfectie verschillenentiation wordt gedurende nog eens 24 tot 48 uur vereiste. Tenslotte worden getransfecteerd rijpe macrofagen geïncubeerd met verschillende soorten van verbindingen voor functionele studies.

Deze benadering maakt de transfectie van cellijnen zoals humane THP-1 monocyten en macrofagen met succes in het verleden ^6-10 toegepast. In tegenstelling tot de meeste chemische transfectie methoden, onze gewijzigde Nucleofection procedure middels premature macrofagen levert hoge transfectie efficiëntie in combinatie met intacte cellevensvatbaarheid, zonder virale vectoren of nog extra dragende verbindingen met onbekende bijwerkingen. Bovendien, de macrofagen behouden hun mogelijkheden tot differentiatie en polarisatie waardoor ongehinderde functioneel onderzoek na transfectie ^11.

Bovendien, het celkweekmedium aangebracht na Nucleofection beïnvloedt sterk functionele studies na transfection; Met name kan de capaciteit van de macrofagen "polarisatie worden beïnvloed afhankelijk van de toegepaste kweekmedium. Hier vier verschillende celkweekmedium (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 en muis T-cellen Nucleofector medium) werden getest onder omstandigheden deactiveren middels interleukine (IL) 10 gebruiken THP-1 macrofagen, waargenomen dat celgevoeligheid naar IL10 is sterkst wanneer de muis T cel Nucleofector medium wordt gebruikt in vergelijking met de andere hierboven genoemde kweekmedium. Deze resultaten demonstreren dat geval optimalisatie van alle celkweekomstandigheden is essentieel voor een succesvolle transfectie und volgende functionele studies zoals deze aanzienlijk experimentele resultaten verbeteren.

Aangezien macrofagen betrokken zijn bij verschillende menselijke ziekten, is veel onderzoek gericht op het ophelderen macrofaag functie en regulerende mechanismen beïnvloeden macrofagen of beurt gecontroleerd door macrofagen. Daarom is dit protocol van belang is inveel verschillende onderzoeksgebieden.

Protocol

1 Predifferentiation van THP-1 macrofagen

1. Telen THP-1-cellen in RPMI-1640 medium gesupplementeerd met 10% (v / v) foetaal kalfsserum (FCS) en 1% (v / v) penicilline / streptomycine / L-glutamine (PSG) in een CO ₂ (5% ) incubator bij 37 ° C.
2. Voor transfectie, splitsen cellen en overbrengen naar verse RPMI medium als voorheen. Cultiveren cellen voor 24 uur.
3. Seed 1,0-1,5 x 10 ⁷ cellen in een 75 cm² weefselkweek kolf of 2,5 x 10 ⁷ cellen in een 150-cm² weefselkweek kolf in RPMI-1640 medium en voeg 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) natrium pyruvaat, 1% (v / v) niet-essentiële aminozuren, 10 ng / ml PMA en 50 uM β-mercaptoethanol gedurende 48 uur.

2 Voorbereiding van Nucleofection

1. Plaats Accutase I en alle media in een waterbad bij 37 ° C.
2. Zuig kweekmedium uit kolf en te vervangen door 6 ml (75 cm ² fles) of 12 ml (150 cm ² fles) vanAccutase I en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor het volledig losmaken van cellen. Let celmorfologie na Accutase I behandeld dat cellen een rond voorkomen. Als sommige cellen nog steeds lijken te worden bevestigd, zorgvuldig spoel de kolf met een micropipet of tik zachtjes aan onthechting te voltooien. Gebruik geen cel schrapers, omdat dit een negatief effect op cel vitaliteit zal hebben. Overdracht celsuspensie een 15 ml buis.
3. Tijdens Accutase ik de behandeling, de voorbereiding van de volgende media:
   1. Bereid transfectiemedium: supplement celkweekmedium met 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) van niet-essentiële aminozuren, 1% (v / v) natrium pyruvaat, en 5% (v / v) humaan serum (voor siRNA) of 20% (v / v) humaan serum (voor plasmide-DNA); een eindvolume van hetzij 3 ml / monster voorbereiding van een 6-well plaat of 4 ml / monster twee 12-well platen.
   2. Bereid kweekmedium: supplement kweekmedium met 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) van niet-essentiële aminozuren, 1% (v / v) natrium pyruvaat, en 5% (v / v) human serum (voor siRNA) of 20% (v / v) humaan serum (voor plasmide), 2,5 ng / ml PMA en 50 uM β-mercaptoethanol; een eindvolume van hetzij 3 ml / monster voorbereiding van een 6-well plaat of 4 ml / monster twee 12-well platen.
4. Centrifugeer celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur.
5. Zuig Accutase I en resuspendeer cellen in 1 ml RPMI medium voorverwarmd tot 37 ° C; tellen cellen om het aantal cellen te bepalen.
   OPMERKING: Bij het snelle automatische cel tellen procedures worden gebruikt, worden de stappen 2.4 en 2.5 kan worden weggelaten en cellen kunnen worden geteld onmiddellijk na onthechting voorwaarde dat langdurige blootstelling aan Accutase I wordt vermeden.
6. Voor elke transfectie monster te bereiden monsters in centrifugebuizen met 2,0-2,5 x 10 ⁶ cellen.

3 Nucleofection van THP-1 macrofagen

1. Centrifuge alle monsters gedurende 10 min bij 250 xg bij kamertemperatuur.
2. Verdun plasmide DNA of siRNA in nuclease-vrijwater of een geschikte buffer. Houd de vereiste hoeveelheid plasmide DNA of siRNA zo klein mogelijk.
3. Bereid een Nucleofector kuvet met 1 ug siRNA of 0,5 ug plasmide-DNA per transfectie.
4. Voer een transfectie tegelijk. Aspireren supernatant van cel portie.
5. Resuspendeer celpellets in Nucleofector oplossing tot een totaal volume van 100 ul DNA / siRNA en Nucleofector oplossing heeft geleid. Houd de tijd van blootstelling aan pure Nucleofector oplossing tot een minimum en zorgen dat de blootstelling tijd niet meer dan 15 minuten.
6. Meng geresuspendeerd cellen en DNA / siRNA in Nucleofector cuvette door zachtjes te tikken.
7. Transfecteren cellen door het uitvoeren van programma Y-001 in Nucleofector 2b apparaat.
8. Transfer getransfecteerde cellen in een reactie flacon met plastic wegwerp pasteurpipetten.
9. Onmiddellijk toevoegen van 500 pi bereid transfectiemedium.
10. Herhaal stap 3,4-3,9 voor elke transfectie monster.

4. Post-Nucleofection Care

1. Bereid hetzij 6-well of 12-well platen voor getransfecteerde cellen. Pipetteer 2,5 ml transfectie medium in elk putje van een 6-well plaat (1 en / transfectie) of 1,75 ml transfectie medium in elk putje van een 12-well plaat (2 putjes / transfectie).
2. Meng celsuspensies grondig met een micropipet.
3. Breng de getransfecteerde cellen in de voorbereide putjes (hetzij een putje in een plaat met 6 putjes of twee in een 12 wells plaat).
4. Incubeer de platen gedurende 4 uur in een bevochtigde incubator (5% _CO2, 37 ° C).
5. Controleer herbevestiging van de cellen microscopisch.
   OPMERKING: Een meerderheid van de cellen moeten weer aanhangend zijn. Af en toe, de verlenging van de incubatietijd van 1 uur verhoogt het aantal hechtende cellen bij onvoldoende herbevestiging.
6. Zuig voorzichtig transfectie medium met een micropipet en te vervangen door gelijke hoeveelheid kweekmedium. Zuig enige vormt tegelijk.
7. Incubeer cellen voor de vereiste termijn voor het maximale effect van plasmide of siRNA (24-72 uur). Als incubatieperiode meer dan 48 uur, te vervangen medium na 48 uur.
8. Voor extra behandeling met effectoren (bv. Cytokines, agonisten, antagonisten en remmers) gebruiken serumvrij medium zonder PMA en β-mercaptoethanol. Time het einde van de incubatieperiode van de effector met de tijd van maximale effect van het plasmide of siRNA en plan verandering drager en toevoeging van de effector daarvan. Niet cellen onder serum-vrije omstandigheden behouden langer dan 24 uur.

Resultaten

Met dit protocol voor transfectie van THP-1 macrofagen met siRNA we meestal transfectie percentages dan 90% zonder wezenlijke vermindering van celvitaliteit. Figuur 1 toont representatieve gegevens karakteriseren de toestand van de cellen 24 uur na transfectie met fluorescent gemerkt siRNA getransfecteerde versus een controle, die niet werden behandeld met Nucleofection reagentia en pols of siRNA maar kreeg alle veranderingen van de cultuur media als getransfecteerde monsters. In figuur 1A de celmorfologie wordt bepaald in flowcytometrische metingen. Microscopische beelden worden weergegeven in Figuur 1B Figuren 1C en 1D vertegenwoordigen de lage tarieven voor apoptose (controle: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). En necrose (controle: 2,0%; Nucleofection: 3,2%) aangeeft onaangetast cel vitaliteit. Necrose en apoptose zijn iets hoger voor de getransfecteerde monster getransfecteerde THP-1 macrofagen zijnmoeilijk los dan getransfecteerde cellen, waardoor de waarschijnlijkheid van celbeschadiging tijdens onthechting toeneemt. Tenslotte transfectie-efficiëntie wordt weergegeven in figuur 1E. Omdat het hele getransfecteerde populatie verschoven tegen de controle, betekent dit dat alle cellen worden getransfecteerd die wordt bevestigd door fluorescentie microscopische afbeeldingen (Figuur 2B). Beide flowcytometrische gegevens en fluorescentie microscopische beelden geven aan dat alle cellen consistent zijn getransfecteerd met homogene verdeling van siRNA tussen cellen en in cellen. Dit in tegenstelling tot vele chemische transfectie reagentia, ter vergelijking Figuren 2A en 2B tonen de respectievelijke flowcytometrische databank fluorescentie microscopische afbeeldingen voor een chemisch transfectie agens met een lipide gebaseerde benadering. Deze cijfers tonen aan dat twee verschillende populaties van getransfecteerde cellen kan worden gedetecteerd. De eerste populatie lijkt op de getransfecteerde cellen Follovleugel Nucleofection. Ze worden gekenmerkt door lage totale fluorescentie en homogene verdeling van siRNA in cellen. De tweede populatie wordt gekenmerkt door een intense fluorescentie die afkomstig is van zeer heldere intracellulaire agglomeraten van siRNA. De cellulaire morfologie niet beïnvloed zowel transfectie methoden zoals door differentiële interferentie contrast in figuur 2C. Transfecties met plasmide DNA yield effectief vergelijkbaar resultaten voor voorbeelden zie Robenek et al. (2009) ⁹ of Xie et al. (2006) ^7.

De keuze van de cel kweekmedium na transfectie van groot belang; derhalve verschillende celkweek media werden getest in vergelijking. De geselecteerde media zijn allemaal geschikt voor de teelt van THP-1 cellen en werden gekozen op basis van de aanbevelingen van Lonza als toepasselijke media voor post-Nucleofection teelt. Figuur 3 geeft het siRNA mediated knockdown efficiëntie met een siRNA gericht tegen IL10RB (interleukine 10 receptor β-keten) mRNA. Voor alle geteste media de expressie van IL10RB significant verlaagd tot ongeveer 10 tot 20% van het controleniveau (figuur 3). Echter de getransfecteerde cellen afhankelijk van het kweekmedium hun potentieel voor polarisatie. THP-1 macrofagen met danwel aspecifieke control siRNA of IL10RB-specifieke siRNA werden in verschillende media gekweekt na transfectie en behandeld met IL10. Vervolgens worden de expressieniveaus van de IL10-geïnduceerde gen SOCS3 (suppressor van cytokine signalering 3) op mRNA niveau werden gemeten met RT-qPCR. Verschillen tussen kweekmedia voordoen met betrekking tot de omvang van de inductie van SOCS3 mRNA-expressie (figuur 4), de inducties voor elk van de geteste media Mouse T Cell Nucleofector Medium, LGM3, X-VIVO 20 en IMDM werden 19,5 [17,7-21,5 ] 11,5 [8,5-15,7], 8,0 [4,6-14,2] en 7,2 [5,6-9,5] vouwen, respectievelijk. Hetor wij toepassing van de muis T Cell Nucleofector medium is van vitaal belang. Bovendien verschillen in de werking van de knockdown van IL10RB op SOCS3-expressie na behandeling IL10 werden waargenomen, werden expressieniveaus van SOCS3 mRNA verlaagd tot 9,5 [8,8-10,3] vouw in Mouse T Cell Nucleofector medium, 2,1 [1,1-4,1] vouw in LGM3, 4,8 [3,2-7,2] vouw in X-VIVO 20 en 3,3 [2,7-3,9] vouwen in IMDM. Deze waarden komen overeen met verminderingen van SOCS3-expressie in de verschillende media 49%, 18%, 60% en 45%, respectievelijk. Vermindering van IL-10-geïnduceerde SOCS3-expressie na transfectie van siRNA IL10RB bevestigt de succesvolle downregulatie van IL10RB de transfectie.

Figuur 1.Karakterisatie getransfecteerde THP-1 macrofagen. Het kenmerk status van de cellen is aangetast zoals blijkt uit lichtmicroscopische en stroom cytometrische analyse van getransfecteerde control cellen versus THP-1 macrofagen getransfecteerd volgens de gepresenteerde protocol. THP-1 macrofagen werden gedifferentieerd met 10 ng / ml PMA gedurende 48 uur en getransfecteerd met fluorescent gelabelde (Alexa 488) onspecifieke control siRNA. 24 uur na transfectie ofwel beelden van levende cellen werden genomen (B), of de cellen werden losgemaakt door behandeling Accutase I en door flow cytometrie (A) geanalyseerd. Apoptose en necrose kleuring werd uitgevoerd met Annexine V-fycoerythrine (PE) (C) en 7-amino-actinomycine (7-AAD) (D). Transfectie-efficiëntie (E) werd bepaald door flowcytometrie met de fluorescentie label aan de siRNA. De fluorescentie-signaal van de getransfecteerde cellen (zwart) wordt getoond tegen het stuursignaal (grijs). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2 Vergelijking van de intracellulaire distributie van siRNA na Nucleofection versus lipofectie. THP-1 cellen werden gedifferentieerd voor 48 uur volgens dit protocol en vervolgens getransfecteerd hetzij door Nucleofection of door lipofectie. De gepresenteerde lipofectie resultaten werden verkregen met de Xtremegene siRNA kit volgens aanbevelingen van de fabrikant met een lading verhouding van reagens tot siRNA 4: 1. 24 uur na transfectie werden de cellen ofwel losgemaakt met Accutase ik voor flowcytometrische analyse of microscopisch geëvalueerd met levende cellen. (A) Transfectie-efficiëntie en distributie van siRNA per cel in de populatie werd bepaald met flowcytometrie met de fluorescentie etiket op de siRNA wordt een controle getransfecteerd zonder siRNA in het grijs worden monsters getransfecteerd met siRNA zwart weergegeven. (B) Fluorescentie microscopiebeelden die intracellulaire verdeling van fluorescent gelabelde siRNA (Alexa Fluor 488); de schaal balk staat voor 40 micrometer. (C) het differentieel interferentie contrast overeenkomt met afbeelding van de fluorescentie; de schaal balk staat voor 40 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 siRNA-gemedieerde knockdown van IL10RB in getransfecteerde THP-1 macrofagen. THP-1 macrofagen werden getransfecteerd volgens het protocol geschetst. Na transfectie van de cellen in vier verschillende kweekmedia, namelijk Mouse T Cell Nucleofector medium (A), IMDM (B) werden gekweekt, LGM3 (C), en X-VIVO 20 (D), aangevuld zoals beschreven in het protocol. Cells werden ofwel getransfecteerd met niet-specifieke controle siRNA (Ctrl) of IL10RB-specifieke siRNA (IL10RB). Als extra controles de volgende monsters werden opgenomen: Impulssturing, dwz. cellen die transfectie in afwezigheid van siRNA (Pulse) en een controle van het medium, namelijk ondergingen. cellen die alleen de wijzigingen van de cultuur media ontvangen, maar bleef anders onbehandeld. 24 uur na transfectie werden de cellen geïncubeerd in serumvrij medium met of zonder 50 ng / ml IL10 verdere 24 uur. IL10RB expressie werd bepaald door RT-qPCR; diagrammen tonen het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde; * P <0,05; ** P <0.01; *** P <0,001 versus Ctrl. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4 IL10-afhankelijke regulatie van SOCS3 na knockdown van IL10RB in getransfecteerde THP-1 macrofagen. THP-1 macrofagen werden getransfecteerd volgens het beschreven protocol. Na transfectie van de cellen in vier verschillende kweekmedia Mouse T Cell Nucleofector medium (A), IMDM (B) werden gekweekt, LGM3 (C) en X-VIVO 20 (D) aangevuld zoals beschreven in de sectie Protocol. Cellen werden ofwel getransfecteerd met niet-specifieke controle siRNA (Ctrl) of IL10RB-specifieke siRNA (IL10RB). Als extra controles de volgende voorbeelden opgenomen: Impulssturing, dwz elementen die transfectie in afwezigheid van siNRA (Pulse) ondergingen, en een controle van het medium, dwz. cellen die alleen de wijzigingen van de cultuur media ontvangen, maar bleef anders onbehandeld. 24 uur na transfectie werden de cellen geïncubeerd in serumvrij medium met of zonder 50 ng / ml IL10 verdere 24 uur. SOCS3 expression werd gemeten door middel van RT-qPCR; diagrammen tonen het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde; *, # P <0,05; **, ## P <0.01; ***, ### P <0,001 versus Ctrl en versus Ctrl + IL-10, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Het protocol hier beschreven presenteert een betrouwbare en efficiënte manier om THP-1 macrofagen die meestal nogal moeilijk te transfecteren transfecteren. Transfectie kan worden bereikt met transfectie efficiënties van meer dan 90% voor siRNA zonder significante reductie van cel vitaliteit. Efficiënties voor plasmiden minder vanwege hun grootte, maar transfectie efficiënties van ongeveer 70% kan meestal worden bereikt. De efficiëntie van siRNA-gemedieerde knockdown bereiken 80 tot 90% afhankelijk van het toegepaste siRNA. Een groot voordeel van dit protocol is dat het niet interfereert met celdifferentiatie. Na transfectie van de cellen nog steeds normaal reageert op de differentiatie middel PMA (Figuur 1A tot 1B en figuur 4) ^12. Bovendien cellulaire polarisatie cytokine stimuli zoals IL10 of LPS / IFNy onaangetast ^12, hoewel dit ook sterk afhankelijk van de voor kweken na transfectie mediums getoond in figuur 4.

Er zijn verschillende opties binnen de procedure die met het oog op het protocol specifieke eisen aan te passen kan worden gewijzigd. Zoals getoond in figuur 4 verschillend cellen reageren dezelfde IL10 stimulus afhankelijk van het geselecteerde kweekmedium na transfectie. Dit geeft aan dat het medium samenstelling sterke invloed op celgedrag. Aangezien de door het medium kunnen verschillen voor verschillende experimentele stimuli effect is het mogelijk dat de optimale medium kan veranderen en daarom is het nodig om de geschiktheid van het medium voor verschillende experimenten onafhankelijk te verifiëren. Maar het RPMI-1640 medium, wat de standaard medium voor kweken van THP-1 cellen, is gebleken ongeschikt voor kweken na transfectie worden als significant verlies in cel vitaliteit waargenomen. Ook het protocol kan ook worden toegepast op THP-1 monocyten zonder voorafgaande PMA geïnduceerde differentiatie dit,kennelijk neemt de noodzaak voor mobiele uitdraaien tijdens de procedure maar alle overige stappen niet te worden aangepast. De THP-1 monocyten achteraf te onderscheiden indien nodig.

De kritische elementen van het protocol zijn enerzijds het losmaken en anderzijds de tijd nodig voor transfectie. De onthechting moet zo voorzichtig mogelijk worden uitgevoerd, teneinde een hoge cellevensvatbaarheid handhaven. Daarom raden wij het relatief milde enzymatische onthechting door Accutase ik dan vrij agressief methoden, zoals behandeling met trypsine. Verdere onthechting werkwijzen zoals behandeling met lidocaïne of schrapen bleken nogal schadelijk zijn en mogen niet worden gebruikt. In het geval dat 30 min van Accutase I behandeling niet voldoende om alle cellen los worden Zo is meestal een indicatie van onjuist opgeslagen of verlopen Accutase I oplossing of teveel vries-dooi cycli. Wij hebben goede resultaten verkregen door het opslaan van kleine hoeveelheden van Accutase I bij -20 °C het aantal vries-dooi cycli verminderen. Maar als er onvoldoende detachement ofwel vervangen Accutase ik met verse Accutase of verhogen incubatietijd tot 1 uur. Daarnaast zachtjes te tikken of spoelen van de kolf of de plaat kan onthechting te helpen. Wat betreft de vereiste tijd voor transfectie de belichtingstijd van de cellen Nucleofector zuivere oplossing heeft een groot effect op celoverleving en dus moeten zo kort mogelijk zijn. De beste manier om dit te bereiken is elke transfectie voeren op een tijdstip (stap 2,10-2,15) en niet meerdere transfecties in parallel.

Als knockdown efficiëntie laag, deze meestal niet veroorzaakt door lage transfectie efficiëntie, maar dit kan gemakkelijk worden geverifieerd met flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie en fluorescent gelabelde siRNA of GFP coderende plasmide. Meestal is de oorzaak een inefficiënte siRNA of plasmide DNA. Onder deze omstandigheden moeten worden beschouwd om de hoeveelheid siRNA verhogen (tot 2-3 ug) ofplasmide DNA (tot 1-2 ug) of een verschillende siRNA of expressievector gebruiken indien beschikbaar. Alternatief kunnen bevredigende resultaten worden verkregen door een pool van verschillende siRNAs gericht tegen hetzelfde doel. Bovendien zou tijdsverloop experimenten nodig om de periode van maximale effect wordt meestal bereikt na 24 tot 72 uur na transfectie nauwkeurig bepalen.

Naast transfectie door elektroporatie er meer gevestigde technieken voor transfectie van zoogdiercellen. Veel toegepaste systemen zijn chemische transfectieagentia die complexen met de lading nucleïnezuur kunnen vormen over de transport in de cellen vergemakkelijken. De meest gebruikte reagentia zijn ofwel gebaseerd op verschillende soorten lipiden of kunnen worden gekozen uit een aantal kationische polymeren ^3. Voor beide benaderingen een gevarieerde selectie handel verkrijgbaar. Deze transfectie reagentia bieden het voordeel dat ze meestalmakkelijk te gebruiken, niet veel tijd vergen, en werken met hechtende cellen als goed, waardoor het verwijderen van de noodzaak tot onthechting. Helaas, macrofagen zijn nogal moeilijk te transfecteren met deze methoden niet wezenlijk prolifereren in vitro en bezitten afweermechanismen tegen buitenlandse cytosolische DNA ^13-15. Zo chemische transfectie benaderingen vaak leiden tot een ernstige vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen. Maar zoals getoond in figuur 2 zijn chemische transfectieagentia welke succesvol kunnen overdragen siRNA tot macrofagen, maar flowcytometrische (figuur 2A) en fluorescerende microscopische (figuur 2B) analyses geven ze niet dezelfde homogene verdeling van siRNA binnen de cellen te bereiken verkregen door Nucleofection. In feite is de flowcytometrische gegevens blijkt dat twee verschillende populaties van getransfecteerde cellen voordoen, eerst een populatie met gelijke fluorescentie als de cellen na Nucleofection wordt gedetecteerd en ten tweede is er een populatie met intensere fluorescentie. Definitieve bevestiging nog steeds nodig maar we veronderstellen dat de eerste populatie in de fluorescentiemicroscopie identiek aan die cellen die een homogene verdeling van fluorescent siRNA in het cytosol tonen terwijl de tweede bevolking die overeenkomt met de cellen met zeer heldere agglomeraten. De flowcytometrische uit figuur 2A blijkt dat nucleofection resulteert in minder siRNA per cel dan het alternatief lipofectie benadering. De gegevens in figuur 3 blijkt echter dat zelfs betrekkelijk kleine hoeveelheid siRNA opgenomen Nucleofection al voldoende voor 80 tot 90% knockdown van het doelwitgen. Daarom is het extra bedrag van siRNA opgenomen door de tweede populatie na chemische transfectie is zeer waarschijnlijk een overschot en dus meer kans op ongewenste bijwerkingen dan om verdere toename knockdown efficiëntie leiden. Daarnaastvorming van intracellulaire agglomeraten is al ongewenst op zich omdat deze siRNA moleculen zijn waarschijnlijk niet functioneel of in ieder geval minder efficiënt dan gratis siRNA moleculen en kunnen veroorzaken tussen de palen effecten. Verder is de ware aard van deze agglomeraten is nog niet duidelijk. Het is mogelijk dat deze heldere vlekken geven endosomen te geven dat de siRNA werd geïnternaliseerd door de cellen maar vervolgens los van de endosomen mislukt en siRNA gevangen blijft en derhalve niet effectief. Alternatief kan de spots agglomeraten die intracellulair worden gevormd. Functionele evaluatie van de chemische transfectie hangende derhalve geen definitieve uitspraken over knockdown efficiëntie kan nog worden gemaakt, nog steeds bestaan ​​van twee verschillende populaties is ook ongunstig omdat dit betekent dat alle resultaten beschrijven gemiddelde van beide populaties, dit is derhalve niet overeen met een van de populaties. Daarom Nucleofection is de superieure benadering.

Toch zijn er ook beperkingen aan de transfectie hier beschreven procedure. Aangezien de cellen moeten in suspensie Nucleofection hechtende cellen moeten worden losgemaakt, die een extra stressfactor aan de cellen weer. Verder is de gehele protocol is nogal tijdrovend. Aangezien transfecties niet gelijktijdig worden uitgevoerd, maar moeten snel worden uitgevoerd om celbeschadiging voorkomen, wordt het aantal monsters beperkt tot ongeveer 8 - 10 per experiment. Zo wordt dit protocol niet geschikt voor high throughput screening van projecten. Voor high throughput toepassingen verschillende Nucleofector systemen beschikbaar. Ten eerste is er de 4D-Nucleofector systeem dat een 16 goed strookformaat biedt. Voor nog grotere verwerkingscapaciteit Naast 96 goed Shuttle systeem en 384 en HT Nucleofector systeem. Maar als deze nieuwere systemen werken met geleidende polymeer elektroden in plaats van aluminium en daardoor elektrische voorwaarden, dat wil zeggen programma's en composvulle van Nucleofector oplossing dienovereenkomstig gewijzigd moet worden bepaald of ons protocol worden overgedragen hierin.

Ondanks deze beperkingen het protocol hier gepresenteerde oplevert een betrouwbare en effectieve transfectie van THP-1 cellen die superieur is aan alle andere niet-virale benaderingen. Dit protocol maakt het onderzoek naar de effecten van veranderde genexpressie in THP-1-cellen die in alle andere aspecten onderscheiden en polariseren normaal en vertonen derhalve slechts bijwerkingen van transfectie mogelijk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Amino acids, nonessential	PAA	M11-003
Centrifuge tubes (15 ml)	TPP	TPP91015
Fetal calf serum (FCS gold)	PAA	A15-151
Human Monocyte Nucleofector Kit	Lonza	VPA-1007	Bevat Nucleofector Solution, cuvettes en Pasteur pipettes
Human serum off the clot	Lonza	C11-020
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine	Lonza	12-722F
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Mouse T Cell Nucleofector Medium	Lonza	VZB-1001
Nucleofector 2b	Lonza	AAD-1001
Penicillin / streptomycin / L-glutamine (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plasmid
Sodium pyruvate (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 human leukemia monocytes	CLS	300356
Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²)	TPP	TPP90076/TPP90151
Tissue culture plates (6-well; 12-well)	TPP	TPP92406/TPP92012
Tubes (1.5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer
X-Vivo 20 with gentamycin	Lonza	BE04-448Q
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148