Methodenartikel

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

DOI:

10.3791/51963

⸱

5 oktober 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om te migreren is een kenmerk van verschillende celtypes en speelt een cruciale rol in verscheidene fysiologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, en immuunresponsen. Echter, celmigratie is ook een belangrijk mechanisme bij kanker waarmee dit kankercellen los van de primaire tumor metastatische verspreiding starten. In de afgelopen jaren verschillende celmigratie assays ontwikkeld om het migratiegedrag van verschillende celtypen analyseren. Omdat het motorisch gedrag van cellen sterk verschilt tussen een tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) omgeving kan worden aangenomen dat de analyse van de migratie van cellen die zijn ingebed in een 3D omgeving oplevert in significantere celmigratie data. Het voordeel van de beschreven 3D collageenmatrix migratietestsysteem is dat cellen worden ingebed bij een fysiologische 3D netwerk van collageenvezels die de belangrijkste component van de extracellulaire matrix. Doortime-lapse microscopie video real celmigratie gemeten waarbij het bepalen van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, waaronder lymfocyten / leukocyten, stamcellen en tumorcellen. Evenzo kan ook celgroepen of bolvormige deeltjes worden ingebed in de collageen matrix gelijktijdig met de analyse van de emigratie van enkele cellen uit de cel cluster / spheroid in de collageen rooster. We concluderen dat de 3D collageenmatrix migratie assay is een veelzijdige methode om de migratie van cellen te analyseren in een fysiologisch-achtige 3D-omgeving.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Like celfusie (voor een overzicht zie 1,2) celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een grote verscheidenheid aan fysiologische processen zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing en immuunresponsen (voor review zie 3). Echter, het vermogen om te migreren is een voorwaarde voor tumorcellen uitzaaien (voor review zie 3,4).

Cel migratie een complex, nog volledig begrepen proces dat wordt geleid door de wisselwerking van verschillende signaaltransductieroutes geïnitieerd door verschillende ligand (bijvoorbeeld cytokines, chemokines, groeifactoren, hormonen, extracellulaire matrixcomponenten) receptor (bijvoorbeeld receptor tyrosine kinases, chemokine-receptoren, integrines) interacties 5 uiteindelijk veroorzakend de reorganisatie van het actine cytoskelet gelijktijdig met de- en hermontage van focale adhesie complexen en integrine-gemedieerde signalering 6.

celmigratie verschillende in vitro en in vivo celmigratie testen analyseren ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van de Boyden kamer / transwell assay 7, scratch test / wondgenezende assay 8-10, drie-dimensionale ( 3D) collageenmatrix migratie assay 11 evenals intravitale beeldvorming / microscopie (voor een overzicht zie 12). Elk van deze cel migratie assays heeft voor-en nadelen, bijvoorbeeld met betrekking tot de kosten en de behoefte van de apparatuur, het hanteren of de betrouwbaarheid van de verkregen gegevens.

Zowel de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezende assay gemakkelijk, goedkoop en goed ontwikkelde assays celmigratie gemeten in vitro 7-10. In de Boyden kamer / transwell assay cellen worden bovenop een insert met poriën (ongeveer 8 micrometer in diameter) - de zogenaamde bovenste compartiment 7. Optioneel, kan het inzetstuk worden bekleed met extracellulaire matrix componenten, bijvoorbeeld fibronectine, collageen, etc., om een fysiologische omgeving nabootsen. Evenzo kan endotheelcellen worden gekweekt boven het inzetstuk, waardoor een endotheliale barrière 13 nabootsen. Die cellen die gedurende een bepaalde tijdsinterval in het onderste compartiment herbergen media en supplementen, zoals groeifactoren en chemokinen doorgegeven via de poriën, worden gebruikt als een uitlezing celmigratie (of extravasatie) kwantificeren.

In de scratch test / wondgenezing assay cellen worden gezaaid in platen en zijn uitgegroeid tot samenvloeiing 10. In afhankelijkheid van de experimentele setting platen kunnen vooraf worden bekleed met extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine. Nadat een kras / ontbonden door schrapen celmonolaag enkele cellen van elke kant van de kras / wond kan migreren in de spleet, waardoor het vullen / genezing te 10. De afstand tussen de twee kanten van de kras / wonden wordt bepaaldafhankelijk van de tijd en wordt gebruikt als een uitlezing voor het trekkende activiteit van de cellen 10. Echter, onderscheid maken tussen celproliferatie (die ook kan leiden tot het vullen / genezing van de kras / wond) en celmigratie wordt aanbevolen de assay te combineren met time-lapse microscopie en video cel volgen 10.

Zowel de Boyden kamer / transwell test en scratch test / wondgenezende assay, zijn eerder onvolmaakte over een fysiologische-achtige cellulaire omgeving. In de Boyden kamer / transwell assay cellen migreren door een plastic porie, terwijl in de scratch test / wondgenezende assay cellen worden op een twee-dimensionale pre-gecoate kunststoffen plaat. Zo wordt ook goed ingezien dat het migratiegedrag aanzienlijk verschilt tussen een tweedimensionale en 3D-omgeving 3. Bijvoorbeeld, drie-dimensionale matrix adhesies fibroblasten verschillen van focale adhesies fibrillair kenmerkt tweedimensionale substraten in de inhoud van α5β1 en avß3 integrines, paxillin, andere cytoskelet componenten, en tyrosine fosforylering van focal adhesion kinase 14. Evenzo cellen ingebed in een 3D-omgeving getoond ook een veranderde migratiegedrag 15. Aldus celmigratie analyse nauwkeuriger een migratietestsysteem wordt aanbevolen zodat de migratie van afzonderlijke cellen in een 3D fysiologisch of fysiologisch-achtige omgeving meten.

Intravitaal imaging / microscopie is de gouden standaard voor het meten van celmigratie in een 3D fysiologische context. Dit geldt niet alleen tot extracellulaire matrix-cel interacties, maar ook om de interacties tussen verschillende celtypen zoals tumorcellen en endotheelcellen tijdens extravasatie 16 of lymfocyttransport binnen de lymfeklier 17, die tot op heden mogelijk, als gevolg verbeterde fluorescentie microscopie, zoals 2-photonconfocale laser scanning microscopie, het gebruik van vitale fluorescente kleurstoffen en transgene muizenstammen expressie fluorescerende eiwitten derivaten 12,16,17. Daarnaast kan intravitale beeldvorming / microscopie worden gecombineerd met handmatige en geautomatiseerde cel bijhouden 18. Vanwege de noodzaak van een 2-foton confocale laser scanning microscopie en dieren (en geschikte transgene diermodellen) intravitale beeldvorming / microscopie is een nogal dure techniek.

Om de beperkingen van de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezing assay overwinnen en de migratie van verschillende celtypen te analyseren in een 3D-omgeving 3D collageenmatrix migratie assay ontwikkeld 11,19. Daarbij migreren cellen ingebed in een 3D collageenvezelnetwerk, die meer lijkt op de in vivo situatie. Gezamenlijk, als gevolg van time-lapse video microscopie echte cel migratie wordt gemeten zodat de VASTSTELLInatie van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, zoals lymfocyten en leukocyten 11,20, hematopoëtische stam / progenitorcellen 21-24 en tumorcellen 5,25-29. Naast enkele cellen ook clusters cel of sferoïden kunnen worden ingebed in de collageen matrix samenvalt met de analyse van de emigratie van afzonderlijke cellen van de cel cluster / sferoïde in het collageen rooster 30,31.

Dit protocol geeft een overzicht van een eenvoudige maar krachtige techniek het migrerende gedrag van verschillende celtypes in een 3D-omgeving te analyseren - een in vitro methode die in de resultaten die dicht bij de in vivo situatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Voorbereiding van Migratie Chambers

  1. Bereid een paraffine / petroleum jelly (1: 1) mengsel en verhit tot het mengsel is gesmolten. Met een penseel en teken 2-3 lagen van de paraffine / petroleum jelly (1: 1) meng het midden van het glaasje volgens de figuren 1B-1D.
    LET OP: Wij maken gebruik van gemeenschappelijke glas dia's (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H))
  2. Breng de gesmolten paraffine / vaseline mix snel op het glaasje om stolling te voorkomen tijdens het tekenen. Zorg ervoor dat de paraffine / vaseline laag ongeveer 2-2,5 cm lang en 0,3-0,5 cm in de breedte. De dikte van de paraffine / vaseline laag moet ongeveer 0,1-0,15 cm.
  3. Voeg een dekglaasje aan de gestolde paraffine / vaseline mix en verzegelt het met 2-3 lagen paraffine / vaseline mix (figuren 1E, 1F). Gebruik 4-8 ​​migratie kamers voor een gemeenschappelijke cel migratie experiment. Plaats migratie kamers in rechtop in een rek.

2 Voorbereiding van het Collageen Suspension Cell Mix

  1. De oogst (bijvoorbeeld met 0,25% trypsine / EDTA) en tel cellen van belang. Resuspendeer de cellen in compleet medium bevattende foetaal kalfsserum (FCS), antibiotica en aanbevolen supplementen. Bereid 4-8 1,5 ml reageerbuisjes en 20 ui celsuspensie met 4-6 x 10 4 cellen (het totale aantal cellen afhankelijk van het celtype te analyseren) en vul tot 50 gl met complete media.
    OPMERKING: Aanvullende verbindingen (bijvoorbeeld groeifactoren, chemokinen, inhibitors, etc.) worden toegevoegd aan de celsuspensie. Gebruik geschikte voorraadoplossingen zodanig dat het eindvolume celsuspensie niet meer dan 50 pl.
  2. Bereid een totaal bedrag van 452 ul laatste collageen schorsing voor vier cel migratie-experimenten. Voeg 50 gl 10x MEM (pH 5,1-5,5) en 27 gl 7,5% natriumbicarbonaat (pH 9,0-9,5) Naar een 1,5 ml reageerbuis en meng. Let op de kleur van de oplossing turn van geel-oranje tot intens paarse (pH 9,0-9,5). Voeg collageensuspensie 375 ul vloeistof aan de 10x MEM / natriumbicarbonaat-oplossing en meng. De pH van de uiteindelijke collageen suspensie moet ongeveer 7,5 zijn (aangegeven door een licht paarse kleur).
    OPMERKING: Controleer de pH van de 7,5% oplossing van natriumbicarbonaat. Als de pH ongeveer 7,5 plaats natriumbicarbonaat oplossing met open deksel in een incubator (37 ° C, 5% CO2) om met CO2 verzadigd en verhoog de ​​pH (ongeveer 9,0-9,5). De pH van collageen suspensie celmengsel is cruciaal voor de stabiliteit van het collageen netwerk. Als het te lage collageenrooster stort tijdens de celmigratie experiment.
    LET OP: Voor dit protocol, vloeibare collageen (pH 1,9-2,2) van runderen achterpoten (2,9-3,3 mg / ml collageen; 95% collageen type I, 5% collageen type IV). Voorbeelden van verdere collageenrooster bereiding protocollen gebruiktType I collageen uit andere bronnen, zoals varkens en ratten, zijn in 32,33. Laat het volume van de gebruikte oplossingen niet veranderen omdat dit de ultieme collageen concentratie van 1,67 mg / ml van het rooster zal veranderen. Een hogere of lagere concentratie collageen invloed van de dichtheid van collageenvezels en de gemiddelde afstand tussen gelijktijdig met de cellen migratiegedrag 34.
  3. Voeg 100 ul van de uiteindelijke collageen schorsing tot 50 pi celsuspensie en meng thoroughly.The laatste collageen suspensie (1,67 mg / ml collageen) is licht viskeuze. Om de juiste hoeveelheid (100 pl) overdragen, pipet de laatste collageen oplossing een keer op en neer voordat de overdracht aan de celsuspensie.
    Opmerking: Als de collageensuspensie celmengsel wordt gecombineerd met de 10x MEM / natriumbicarbonaatoplossing en de pH waarde is veranderd naar 7,5 de collageenvezels onmiddellijk beginnen te polymeriseren.
  4. Breng de laatste collageen schorsing cel mix van the reageerbuisjes de migratie kamers. Tik de migratie kamer gelijkelijk verdelen de collageensuspensie celmengsel aan de onderkant van de migratie kamer (Figuur 1H). Plaats de migratie kamers rechtop in een rek en incubeer gedurende ongeveer 30 min (37 ° C, 5% CO2) om polymerisatie van de collageenvezels mogelijk.
  5. Merk op dat de gepolymeriseerde collageenrooster enigszins troebel maar nog steeds licht paarse kleur. Vul de migratie kamers met compleet medium of compleet medium met supplementen van belangstelling en sluit de migratie kamer met paraffine / vaseline mix (figuren 1I, 1J).

3 Registratie en analyse van cel-migratie

Deze paragraaf beschrijft de opname van de cel migratie door time-lapse video microscopie en analyse van de cel migratie door handmatige cell tracking.

  1. Schakel de microscoop en de microscoop podium heater. Breng de temperatuur op 37 ° C. Gebruik een 10X objectief. Plaats migratie kamer onder een microscoop en zich ongeveer 50 cellen of meer in het gezichtsveld.
  2. Record cel migratie in time-lapse-modus met behulp van een multi-camera video surveillance software. Spaar cel migratie films in een geschikt formaat, bijvoorbeeld "* avi" of "* .mov". Koppel de celmigratie filmbestanden een database met ondersteunende informatie zoals celtype en de testomstandigheden.
    OPMERKING: We opneemt lymfocyten en HSPCs tot 2 uur met een time-lapse factor 1:80, waardoor 0,75 sec in time-lapse gelijk aan 1 min in real-time. Tumorcellen zijn traag bewegende cellen en dus genoteerd voor ten minste 16 uur met een time-lapse factor 1: 1800 (0.5 sec in time-lapse gelijk aan 15 min in real-time).
  3. Analyseer cel migratie films met behulp van een geschikte cell tracking software applicatie, zoals ImageJ software plugins(Een overzicht wordt gegeven in 18). Voor een onpartijdige analyse is het van cruciaal belang dat de cellen willekeurig worden geselecteerd zonder de kennis of de cellen zijn trekvogels actief is of niet.
    OPMERKING: We gebruiken een zelf ontwikkelde softwaretoepassing om de paden van ten minste 30 cellen per experiment handmatig volgen door de bewegende cellen nauwkeurig met de muiscursor (die is gepositioneerd om de kern). Wanneer volgen, worden de xy-coördinaten van de bijgehouden cellen automatisch bepaald in overeenstemming met de gebruikte time-lapse mode. Voor lymfocyten / HSPCs xy-coördinaten worden bepaald elke 0,75 sec (gelijk aan 1 min realtime), terwijl voor de tumorcellen van de xy-coördinaten worden bepaald elke 0,5 seconde (gelijk aan 15 min realtime).
  4. Bepaal totaal 60 xy-coördinaten per cel voor een typische celmigratie experiment. Dit is gelijk aan 1 uur real time voor lymfocyten / HSPCs en 15 uur real-time tumorcellen. A "," aan dat een cel niet is overgegaan tussen two tijdstippen, terwijl een "numerieke waarde" geeft de afstand in "pixels" een cel is verhuisd tussen 2 tijdstippen (Figuur 2A).
    OPMERKING: Manual cell tracking vereist ervaring. Bijzonder snel migrerende cellen zijn moeilijk op te sporen en elk celtype vertonen een uitgesproken trekkende gedrag dat zou kunnen worden veroorzaakt door factoren aangevuld. In het geval van de celdeling, terwijl het bijhouden van, willekeurig kiest een dochter cel voor de voortzetting van tracking. Cellen die migreren uit het zicht veld of sterven, terwijl het bijhouden van zijn niet verwaarloosd, maar worden beschouwd voor analyse.

4 Data Analysis

  1. Analyseer cell tracking data met behulp van een geschikte softwaretoepassing, bijvoorbeeld een spreadsheet programma.
    1. Analyseer cell tracking data door het kopiëren van de cel volgen ruwe data (Figuur 2A), in een zelf ontworpen spreadsheet template. Vermenigvuldigen som van de "numerieke waarden", wat neerkomtde totale afstand van een cel is gemigreerd met een correctiefactor om te zetten "pixel" in "micrometer".
    2. Bepaal twee celmigratie parameters: motorische activiteit (wat equivalent is aan migratie percentage) en begintijd van actieve beweging (figuren 2C, 2D).
    3. Identificeer de cellen die minder dan 25 urn (drempelwaarde voor het aantal vals-positieve cellen te verminderen) gemigreerd als niet bewegend cellen. Vervang "numerieke waarden" van deze cellen met ",".
      OPMERKING: De parameter "locomotorische activiteit" (of migratie percentage) is het percentage van cellen van het gevolgde celpopulatie die verplaatst tussen twee tijdstippen (figuur 2D). Een "numerieke waarde" is gedefinieerd als een bewegend cel, terwijl "," gedefinieerd als een niet-bewegende cel. De parameter "tijd van actieve beweging" (tijd gezien) is het percentage van de totale tijd van een cel gemigreerd in rening aan het tijdsbestek van de observatieperiode (figuur 2C). Een "numerieke waarde" geeft aan dat een cel zich verplaatst, terwijl "," aan dat een cel niet is overgegaan. Deze parameter wordt verder gebruikt om het aantal cellen dat niet heeft bewogen bepalen.
  2. Bereken statistische significantie en weergave celmigratie data.
    1. Bereken statistische significantie van de gemiddelde motorische activiteit van de cellen (migratiesnelheid) met de Mann-Whitney U test. Overweeg p-waarde <0,05 als significant.
    2. Toon de gemiddelde motorische activiteit van cellen als xy-diagram, boxplot diagram, of als een staafdiagram. Tonen enkele cel-gebaseerde data, zoals de tijd van de actieve beweging en snelheid, als een staafdiagram diagram of als een histogram.
      OPMERKING: Als de gekozen spreadsheet software applicatie een boxplot grafiek of histogram functie bevat een online zoektocht moet voor het zoeken van geschikte tu worden uitgevoerdtorials.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gebruikte 3D-collageenmatrix migratietestsysteem combinatie met time-lapse video-microscopie en computerondersteunde cell tracking maakt de bepaling van verschillende celmigratie parameters zowel populatie gebaseerde parameter (bijvoorbeeld gemiddelde motorische activiteit) en eencellige gebaseerde parameters (bijvoorbeeld tijd van actieve beweging, snelheid, afstand gemigreerd). Een voorbeeld van de verkregen cell tracking datasets verwerking en presentatie van gegevens zijn aangegeven in f...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om te migreren is een kenmerk van tumorcellen 4. Zonder de mogelijkheid om los te maken van de primaire tumor en migreren door het omringende bindweefsel tumorcellen kunnen geen secundaire laesies, die de belangrijkste doodsoorzaak van bijna alle kankerpatiënten zaad. Vanwege deze relatie veel studies zijn gericht op kankercellen migratie. Het doel van deze studie is de identificatie van nieuwe doelmoleculen en doel wegen die efficiënt blokkeren migratie van tumorcellen, waardoor afbreuk of afrem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Fritz-Bender-Stichting, München, Duitsland

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Leica DM IL inverted microscopeLeica, Wetzlar, Duitsland
Microscope stage heaterDistelkamp Electronic, Kaiserslautern, Duitsland
JVC C1431 video cameraJVC, Bad Vilbel, Duitsland
Axis 241Q video serverAxis communication GmbH, Ismaning, Duitsland
Mac G5 ComputerApple Macintosh
iMacApple Macintosh
FileMaker ProFileMaker GmbH, Unterschleißheim, Duitsland
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)Bensoftware, Londen, VK
Runtime Revolution Media 2.9.0RunRev Ltd., Edinburgh, VK
ParaffinApplichem GmbH, Darmstadt, DuitslandA4264
Petroleum jellylocal drug store
Purecol (liquid collagen)Nutacon BV, Leimuiden, Nederlandbevat 2,9 - 3,3 mg/ml bovien collageen (95% collageen type I, 5% collageen type IV)
10x MEMSigma Aldrich, Taufkirchen, DuitslandM0275
7,5% natriumbicarbonaat oplossingSigma Aldrich, Taufkirchen, DuitslandS8761
EGFSigma Aldrich, Taufkirchen, DuitslandE9644
U73122Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland662035eerst oplossen in CHCl3; net voor gebruik reconstitueren in DMSO

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711(2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Time lapse microscopieceltracking3D omgevingkankercellenleukocytenstamcellenEGF stimulatiestatistische analyse

Gerelateerde artikelen