Teelt van zoogdiercellen met behulp van een Single-use Pneumatische bioreactorsysteem

Samenvatting

Met behulp van een pneumatische bioreactor demonstreren we de assemblage, werking en prestaties van dit bioreactorsysteem voor eenmalig gebruik voor de groei van zoogdiercellen.

Samenvatting

Recente vooruitgang in de cultivatie en opschaling van zoogdieren, insecten en stamcellen heeft enorme kansen gecreëerd voor nieuwe therapeutische producten en innovaties in gepersonaliseerde geneeskunde. Het vertalen van deze vooruitgang naar therapeutische toepassingen zal echter in vitro systemen vereisen die robuuste, flexibele en kosteneffectieve bioreactorsystemen mogelijk maken. Er zijn momenteel verschillende bioreactorsystemen die in onderzoeks- en commerciële omgevingen worden gebruikt; echter, veel van deze systemen zijn niet optimaal voor het vestigen, uitbreiden en monitoren van de groei van verschillende celtypen. De kweekparameters die het meest uitdagende zijn om te controleren in deze systemen omvatten het minimaliseren van hydrodynamische schuifspanning, het voorkomen van vorming van nutriëntgradiënten, het vestigen van uniforme beluchting van het kweekmedium, het voorkomen van microbiële besmetting en het monitoren en aanpassen van kweekcondities in real-time. Met behulp van een pneumatisch bioreactorsysteem voor eenmalig gebruik, demonstreren we de assemblage en werking van deze nieuwe bioreactor voor zoogdiercellen die op micro-carriers worden gekweekt. Dit bioreactorsysteem elimineert veel van de uitdagingen geassocieerd met momenteel beschikbare systemen door het minimaliseren van hydrodynamische schuifspanning en nutriëntgradiëntvorming, en het mogelijk maken van uniforme beluchting van het kweekmedium. Bovendien maakt de software van de bioreactor het mogelijk om de parameters van de bioreactoropstart op afstand te bewaken en aan te passen in real-time. Dit bioreactorsysteem heeft ook een enorm potentieel voor het opschalen van adherente en suspensie zoogdiercellen voor de productie van een verscheidenheid aan therapeutische eiwitten, monoklonale antilichamen, stamcellen, biosimilars en vaccins.

Inleiding

Zoogdier cellijnen kunnen worden ingedeeld in drie categorieën op basis van hun groei eigenschappen: cellen die in suspensie groeien, cellen die groeien als aggregaat, en cellen die verankerd groeien op een substraat. Hoewel de lucht-wiel bioreactor gedemonstreerd in deze video is in staat om alle drie de soorten cellen te laten groeien, zal deze video gebruik van de bioreactor tot verankering afhankelijke cellen groeien op micro-dragers demonstreren. Ankerplaats afhankelijke zoogdiercellen kunnen worden gekweekt voor het produceren van meer cellen - waarbij de cellen zelf het product. Bijvoorbeeld, menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen nog geteeld met het oog op het oogsten van de cellen en injecteren in ziek weefsel. De pneumatische bioreactor aangetoond in deze video geschikt gebleken voor de productie van dergelijke mesenchymale stamcellen voor deze toepassing (Serra et al., Persoonlijke mededeling, 2013).

Anchorage dependent zoogdiercellen worden meestal geteeld op kleine schaal in 2D cultuur schepen zoals celkweek platen, celkweek kolven, of roller flessen, waar zij zich aan een speciaal behandelde groei oppervlak ^1. Wanneer meer cellen gewenst zijn, kunnen de platen of kolven worden uitgebreid door meer of grotere schepen. Voor meer rendabele teelt van grote hoeveelheden verankering afhankelijke cellen, de oppervlakte, celhechting kan worden bereikt door gebruik solid beads genaamd micro-dragers. Afhankelijk van de bevestiging kenmerken van de cel, verschillende soorten micro-dragers zijn commercieel verkrijgbaar, zoals dextran, peptide of collageen bekleed. Micro-dragers hebben een groot oppervlak tot volume verhouding verschaffen van een groter oppervlak voor celgroei; en micro-dragers worden in suspensie gehouden onder roeren, waardoor de cellen worden gekweekt tot hoge dichtheden in bioreactorsystemen ^2. Momenteel is de soort bioreactors waar hechtende cellen worden gekweekt op micro-dragers omvatten spinnerkolven en geroerde tank systemen, die aspropellers gebruiken om opschorting van de cel gecoate micro-dragers te behouden.

Verschillende factoren zijn belangrijk voor de succesvolle kweek van cellen waaronder zuurstofspanning, schuifspanning, oppervlakte matrix en nutriënten en metaboliet concentraties. Het gebruik van bioreactoren zorgt voor real-time monitoring van de groei-omstandigheden en het potentieel om aanzienlijk lagere productiekosten ^1. Er zijn verschillende gemeenschappelijke bioreactor ontwerpen voor in vitro celkweek inclusief, geroerde suspensie, roterende vaatwand, holle vezel, zak bioreactor op een rocker-platform, en wervelbed systemen ^3. Veel van deze systemen te presenteren unieke problemen voor celkweek en schaal -up, zoals hoge kosten, voedingsstoffen concentratiegradiënten, hydrodynamische shear, cel aggregatie, en moeite met steekproefsgewijs controles en controlerende cell opschaling.

Verschillende hechtende cellijnen worden gebruikt bij de productie van virussen, in de productie van virale vaccins of voor de productie van virale vectoren voor gentherapie toepassingen. In deze video, met behulp van de voor eenmalig gebruik pneumatische (lucht-Wheel) bioreactor systeem, tonen we de cultuur van de menselijke long carcinoom cellen (A549) cellen op micro-dragers voor de productie van een oncolytisch adenovirus. De pneumatische bioreactor gebruikt een verticale agitatie wiel dat wordt aangedreven door het drijfvermogen van gas gesprenkeld in de bodem van de bioreactor. Dit zachtjes roeren methode beperkt hydrodynamische dwarskrachten, maar nog steeds zorgt voor een optimale medium en cel mengen ^4. In vergelijking met de geroerde tank reactor, de pneumatische reactor lage afschuifspanning ook bij hoge volume Air-Wheel bioreactor systemen (figuur 1). In tegenstelling tot geroerde tank bioreactoren, is de verticale schoepenrad is opgebruikt reactor gedraaid een gas stroomt binnenhet vaartuig, die zorgt voor zachte en uniforme menging medium (figuur 2).

Protocol

1 Inloggen

1. De macht van de bioreactor. Klik ergens om de login-pagina te openen. Selecteer uw gebruikersnaam en voer het wachtwoord in en klik op "Login".

2 Kalibratie

1. Kalibreer de pH-sensor (2 punt voorafgaand aan een autoclaaf).
2. Inspecteer de pH-sensor en bevestig de sensor tip is gevuld met elektrolyt oplossing. Bereid twee bekers met pH-kalibratie-oplossingen (elektrolyt) pH 4 en pH 7 en beschikken over een spuitfles met gedestilleerd water.
3. Sluit de pH-kabel aan op de pH-sensor. Navigeer naar de "Acties" tab op de Hello-interface en klik op "kalibreren". Voer buffer temperatuur in de Temp veld Calibration Solution.
4. Plaats de pH-sensor in buffer 1 (pH 4) en geef waarde in het veld "nul". Wachten op de grafiek om te stabiliseren en de klik op de knop "kalibreren 1". Spoel de pH-sensor met gedestilleerd water.
5. Plaats sensor in buffer 2 (pH 7). Voer buffer2 waarde in het veld "overspanning". Wacht op de grafiek om te stabiliseren en klik kalibreren 2 knop.
6. Klik op "Opslaan" en klik op 'Sluiten'.
7. Kalibreren van de sensor voor opgeloste zuurstof (DO).
8. Controleer de DO sensor is gepolariseerd door is verbonden met het systeem gedurende meerdere uren. Navigeer naar de "Acties" tab op de Hello-interface en klik kalibreren. Klik op de "DO A" knop.
9. Koppel de DO-sensor en voer 0 in het veld "nul". Wachten op de grafiek om te stabiliseren en de klik op de "Calibrate 1" te drukken.
10. Sluit de DO-sensor en voer 100 in het veld "Span". Wachten op de grafiek om te stabiliseren en de klik op de "Calibrate 2"-knop.
11. Klik op "Opslaan" en klik op "close".

3 autoclaaf en installeren Sensoren en reagens Vaartuigen

1. Na de kalibratie plaats sensors en thermische goed in autoclave zakken en autoclaaf gedurende 30 minuten bij 121 ° C, 15 psi.
2. Ontsmetten autoclaaf zakjes met 70% isopropylalcohol (IPA) en overdracht zakjes biologische veiligheid kast (BSC). Verwijder de buitenste verpakking van het schip.
3. Ontsmetten binnenverpakking met 70% IPA en overdragen schip naar bioveiligheidskast (BSC). Verwijder de binnenste verpakking en inspecteren van het vaartuig en buisleidingen voor de schade veroorzaakt tijdens het transport.
4. Installeer de pH en DO-sensoren in de twee voorste poorten. Installeer de thermische goed op de linksback-poort. Open de sensor dop.
5. Leid de sensor via de sensor-poort. Rijg de sensor stevig in de poort.
6. Transfer vaartuig van BSC.
7. Hang de DO en de pH-sensor kabels buiten het vat mouw en te controleren of er niets in de mouw. Schuif het schip in de huls, voeten eerst.
8. Past de temperatuursensor in het vat thermisch goed zorgvuldig. Zorg ervoor dat de bodem van het vat rust tegen de kachels.
9. Verwijderde slang zet uit hun zakken. Match kleurcodering op de slang aan op de overeenkomstige aansluitingen en pompen op de bioreactor besturingseenheid.
10. Installeer de belangrijkste gasleiding door op de connector in de gas uitlaat. Installeer de micro gasleiding door het verdraaien van de connector met de klok mee in het gas uitlaat. Installeer de uitlaat filter buis:
11. Open het filter oven. Verzeker uitlaatfilter de U-kanaal zodat de slang gaat door de twee haken aan het filter en uit de oven.
12. Installeer de slang door de condensor zak in de slang houder. Sluit de deur.
13. Route Bovendien lijnen A en B, beide media-lijnen en de oogst lijn achter de DO sensor en naar de bank naast de bioreactor besturingseenheid.
14. Sluit de kabels aan op de DO en pH sensoren.

4 toevoegen Medium en Micro-dragers

1. Ga naar het tabblad "acties" en klik op "Control Pompen" op de computer interface.
2. Vorm een ​​sterile verbinding tussen een niet gebruikte medium aanvulling lijn (1 oranje band) en het medium fles / zak bron bij het lassen van de buizen of met Luer fittingen.
3. Klik op de schuifknop om het inschakelen van de media op de pomp. Klik op de schuifregelaar aan te zetten de media pomp uit na toevoeging gewenste hoeveelheid van het medium.
4. Plaats microdrager kralen in Ca2 ^{+, Mg2 +} vrij PBS gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
5. Was kralen meerdere malen met Ca2 ^{+, Mg2 +} vrij PBS.
6. Autoclaaf gedurende 15 minuten bij 115 ° C, 15 psi.
   OPMERKING: Voeg 3 g / L (drooggewicht) in dit experiment.
7. Pomp in micro-dragers die zijn gehydrateerd, gewassen en geautoclaveerd in de reactor op dezelfde wijze het medium in stap 4.1 werd toegevoegd.

5 Equilibration en Eénpunts DO Calibration

1. Stel de regelaars op Auto en voer de gewenste setpoints. Hier gebruiken agitatie Set Point (SP) = 15 rpm, Temperatuur SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Wacht tot de parameters in evenwicht.
2. Bevestig sensor volledig gepolariseerd. Bevestig DO contante waarde is gestabiliseerd.
3. Ga naar het tabblad "Acties" en klik op "kalibreren". Klik op "DO A", klik op "One-point".
4. Voer "100" in het veld "Span". Klik op de "Calibrate 1"-knop, klik op "Opslaan" en klik op "sluiten":

6 Het starten van een run

1. Ga naar het tabblad Acties. Klik op "Batch". Gebruik het toetsenbord op het scherm of een extern toetsenbord om een ​​naam in te voeren batch 16 tekens of minder.
2. Klik op "verbergen" knop het toetsenbord op het scherm. Klik op de "Start batch" te bevestigen door te klikken op "Start" in de overlay.

7 geënt Cellen

1. Vorm een ​​steriel verband tussen een niet gebruikte medium aanvulling lijn (1 oranje band) en de cel fles / zak bron door lassende slang of met het luer fittings.
2. Installeer het siliconen gedeelte van de slang in de media pomp zodat de pijl wijst in de richting van de slang tussen de pomp en schip.
3. Controleer slangklem is geopend en de vertakte slangklem gesloten. Klik op de schuifknop om de media-pomp in te schakelen en klik op "Uit" na het toevoegen van cellen.
4. Ga naar het tabblad "Acties" en klik op "Control Pompen".

8 Sampling

1. Na inoculeren en zo vaak als gewenst de cultuur controleren opneming van een monster van de kweek op de volgende wijze:
2. Ga naar het tabblad "acties" en klik op "neem monster". Plaats de monstername in de monstername pomp en manipuleren van de bemonstering kraan volgens de instructies op het scherm.
3. Voeren ten minste een dagelijkse microscopische observatie en celgetal op deze monsters.
4. Wanneer de cellen de gewenste dichtheid, in dit c bereiktase 1,2 x 10 ⁶ cellen / ml, infecteren de cellen met de toevoeging van een virus inoculum.
5. Voeg aseptisch entmateriaal tot een injectiespuit 20 ml, en zet de injectiespuit een van de extra toevoeging poorten van de reactor. Breng het inoculum aan de reactor door op de zuiger.
6. Verder bemonstering en analyse van de cultuur voor de adenovirus intracellulaire deeltjesconcentratie.

Resultaten

In figuur 3, worden de parameters voor de aanvang van de bioreactor run weergegeven. Deze figuur toont het scherm voor het instellen van de parameters van temperatuur, opgeloste zuurstof, pH en agitatie. Zodra de parameters zijn ingesteld, zijn de parameters die continu bewaakt en aanpassingen kunnen worden gedaan aan de vereiste voorwaarden te handhaven. De software zorgt voor een continue uitlezing dat zorgt voor gemakkelijke identificatie van problemen. In dit experiment met 2.5 L DMEM dat 10% FBS, 250 ppm SAFC Anti-foam C, 2 mm L-glutamine en 3 g / L van micro-dragers, wordt het systeem gestabiliseerd om het percentage zuurstof is 50%, de temperatuur 37 ° C en de pH 7,2. De reactor wordt geënt met A549 cellen bij een concentratie van 7 x 10 ⁴ cellen / ml (of 10 cellen / micro-drager). Het gekozen voor deze proef parameters resulteerde in de meeste cellen hechten aan de micro-dragers binnen 2 uur (figuur 4). Na 12 uur, de cellen zijn demonentreren tekenen van afvlakking en verspreiding op het oppervlak micro-drager (figuur 5). Door 24 uur, micro-dragers een relatief gelijkmatige cellen, zonder micro-dragers zonder cellen en geen grote massa van cellen op de micro-dragers (figuur 6). Het percentage micro-carrier kolonisatie door A549 cellen 75% bij 24 uur en daarna 90% (figuur 7). De cellen bleef exponentieel groeien tot ~ 1 miljoen cellen / ml na 48 uur (figuur 8). Na infectie met een dosis van oncolytische adenovirus (2 x 10 ⁸ virions / ml) bij 50 uur, de dichtheid werd verhoogd tot 1,2 miljoen cellen / ml en begon toen te dalen als de lytische infectie gevorderd. Er was ~ 10.000-voudige amplificatie van het virale inoculum.

In vorige experimenten hebben we ontdekt dat toezicht en aanpassing gasstroom is cruciaal voor het maximaliseren celgroei (ongepubliceerde gegevens). Snel groeiende cellen kan het systeem van zuurstof met afbrekende het DO niveau daalt naar nul. Terwijl de cellen bleven groeien, was veel langzamer. Het is cruciaal om te monitoren en de zuurstoftoevoer naar de cel eisen tijdens de logaritmische groeifase voldoen. Elke run kan worden geanalyseerd voor een optimale groei door het vergelijken van de pH, DO, en de temperatuur met dagelijkse cel tellingen.

Figuur 1 Vloeistofdynamica van de pneumatische Bioreactor System (PBS) vergeleken met een roerder tank bioreactor meten muur afschuifkrachten op verschillende reactor volumes.

Figuur 2 Pneumatische Air-Wheel reactor waaier.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Figuur 3 Pneumatische Air Wheel software screenshot van parameters om de bioreactor run te starten.

Figuur 4 Micro-carrier kolonisatie met A549 cellen 2 uur na de inenting. (Gemiddelde micro-drager diameter ~ 180 micrometer.) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5 12 uur na de initiatie van de cultuur worden de A549 cellen verbonden, vlakken en verspreiden op de micro-dragers.5highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6 Micro-dragers bekleed met cellen na 24 uur in de cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7 Percentage micro-carrier kolonisatie door A549-cellen na inoculatie.

Figuur 8 Het aantal levensvatbare A549 cellen in kweek vóór en na infectie met adenovirons. Merk op dat de virale infectie stap trad bij 50 uur.

Discussie

Deze single-use bioreactor systeem is relatief eenvoudig te gebruiken en biedt real-time analytics voor reactor monitoring en analyse. Het is zeer goed geschikt voor zoogdieren en insecten celcultuur met cel dichtheden bereiken van meer dan 30 miljoen cellen / ml. Naast beschreven A549-cellen in dit verslag ^11, hebben we SF-9 insectencellen gekweekt in de bioreactor ook. Het voorzichtig mengen door de pneumatische wiel vermindert celbeschadiging. Verschillende stappen zijn van cruciaal belang bij het opzetten van deze reactor. Ten eerste, de juiste kalibratie van de pH en DO sensoren om optimaal controle van de kweek en toevoeging van reagentia om de pH of de zuurstof in het systeem aan te passen. Ten tweede moet het serum en zaad flessen worden gevuld en de luer bijlagen in een steriele omgeving, zoals een BSC. Wanneer het reagens flessen weggeklapt, steriele omgeving, moet de verbindingen met de bioreactor toevoerleidingen voorzichtig worden geïnterpreteerd microbiële contaminatie te voorkomen.

Hoewel dit bioreactorsysteem werkt goed voor zoogdieren en insecten cellijnen is niet bedoeld voor bacteriële kweken. Het systeem kan niet over een snelle menging en zuurstof die nodig is voor bacteriële cellen. Bacteriële groei best verwezenlijkt in een geroerde tank bioreactor. In vergelijking met andere enkel gebruik bioreactoren voor zoogdierlijke of insecten celcultuur dit systeem eenvoudig te gebruiken, voldoende gegevens voor analyse van runs en heeft vergelijkbare of betere celgroei dan de andere voor eenmalig gebruik stelsel we geëvalueerd.

Het eenmalig gebruik pneumatische bioreactorsysteem heeft de potentie om veel onderzoek en klinische toepassingen op het gebied van biologische geneesmiddelen vaccins voldoen, stamcellen en gepersonaliseerde geneeskunde ^4. Bovendien, de flexibiliteit van dit systeem maakt Batch, Fed-batch, Perfusie en transfectie gebaseerde bioreactor toepassingen ^5. Tot slot, voor eenmalig gebruik disposable bioreactor systemen hebben de potentieel aan de behoeften van grootschalige industriële productie te ontmoeten en zich te houden aan de richtsnoeren en aanbevelingen van de nationale en internationale regelgevende instanties ^6-10.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PBS 3	PBS
Single Use Assembly	PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549)	ATCC	CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers	GE	3781
Antifoam C	Sigma	A8011