Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Samenvatting

Dit handschrift illustreert een protocol voor het efficiënt maken van-integratie vrij humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit perifeer bloed met behulp van episomale plasmiden en histondeacetylase (HDAC) -remmers. De voordelen van deze benadering zijn: (1) het gebruik van een minimale hoeveelheid perifeer bloed als grondstof; (2) nonintegrating herprogrammering vectoren; (3) een kosteneffectieve werkwijze voor het genereren vector gratis iPSCs; (4) een enkele transfectie; en (5) het gebruik van kleine moleculen epigenetische herprogrammering vergemakkelijken. Kort, perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) geïsoleerd uit routine flebotomie monsters en vervolgens gekweekt in gedefinieerde groeifactoren een zeer proliferatieve erythrocyten progenitor celpopulatie die opmerkelijk vatbaar herprogrammering leveren. Nonintegrating, nontransmissible episomale plasmiden die OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, en een p53 short hairpin (sh) RNA zijn Inleidiced in de afgeleide erytroblasten via één nucleofection. Cotransfectie van een episoom dat tot expressie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) zorgt voor gemakkelijke identificatie van getransfecteerde cellen. Een aparte replicatie-deficiënte plasmide dat Epstein-Barr nucleair antigeen 1 (EBNA1) wordt ook toegevoegd aan het reactiemengsel verhoogde expressie van episomale eiwitten. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op een laag van bestraalde muis embryonale fibroblasten (iMEFs) voor verdere herprogrammering. Zodra iPSC-achtige kolonies verschijnen ongeveer twaalf dagen na nucleofection zijn HDAC inhibitoren toegevoegd aan het medium epigenetische remodeling vergemakkelijken. We hebben gevonden dat de opname van HDAC inhibitoren routinematig verhoogt de productie van volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies van 2 maal. Zodra iPSC kolonies vertonen typisch menselijke embryonale stamcellen (hESC) morfologie, worden ze voorzichtig overgebracht naar individuele Imef-gecoate weefselkweek platen voor verdere groei en expansie.

Inleiding

iPSCs zijn afgeleid van somatische weefsels via ectopische expressie van een minimale set van pluripotency genen. Deze techniek werd aanvankelijk aangetoond door retrovirale transductie van humane fibroblasten met OCT4, SOX2, KLF4 en cMYC die hoog tot expressie in de pluripotente toestand ^1. Deze tijdelijk tot expressie "herprogrammering factoren" veranderen de doel cel epigenetische landschap en genexpressie profiel analoog aan menselijke embryonale stamcellen ^2. Eens gemaakt, kan iPSCs potentieel worden onderscheiden in elk type weefsel voor verder onderzoek. Zo is zij in het bezit belofte voor gebruik in regeneratieve geneeskunde, ziekte modelleren, en gentherapie toepassingen. Echter, verstoren het genoom met integrerende virussen heeft de potentie om endogene genexpressie beïnvloeden cellulaire fenotype te veranderen, en uiteindelijk vertekenen wetenschappelijke resultaten. Bovendien kunnen willekeurige virale integraties leiden tot schadelijke cellulaire effects, met inbegrip van de mogelijkheid van een maligne transformatie ³ of re-expressie van de oncogene transgenen ^4. Toekomstige klinische toepassingen zullen niet-integrerende iPSC generatie vereisen.

Episomen, die extra chromosomaal circulaire DNA moleculen zijn, bieden een strategie om kosteneffectieve, integratie gratis iPSCs ⁵ genereren. De combinatie van episomale vectoren in tabel 1 geven de herprogrammering factoren OCT4, SOX2, KLF4, MYCL en LIN28A. De pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F plasmide bevat ook een p53 shRNA tijdelijke onderdrukking van TP53 cellulaire herprogrammering ⁶ verbeteren. De replicatie deficiënte pCXWB-EBNA1 vector bevordert amplificatie van herprogrammering factoren en verhoogde efficiëntie herprogrammering door een tijdelijke toename EBNA1 expressie ^7. De pCXLE_EGFP plasmide kan de nucleofectie mengsel worden toegevoegd met het doel van determining de transfectie-efficiëntie of voor celsortering toepassingen. Met uitzondering van p-CXWB EBNA1, het episomale plasmiden die in dit protocol bevat het Epstein-Barr virus oorsprong van virale replicatie en EBNA1 gen dat replicatie en verdeling van de episoom bemiddelen bij deling van de gastheercel ^8. De episomen spontaan verloren opeenvolgende iPSC expansie ^7. Subklonering en karakterisatie van iPSCs met episomale vector verlies, dat kan worden afgeleid uit het verlies van eGFP expressie kan leiden tot integratie volledig vrij iPSCs voor toekomstige klinische toepassingen.

Inherent aan het proces van iPSC generatie onderdrukking van lijnspecifieke genen en reactivering van pluripotentie-geassocieerde genen. Regulatie van genexpressie plaatsvindt op verschillende niveaus binnen de kern, waaronder wijzigingen van DNA en chromatine transcriptiefactoren mogelijk, regulerende DNA-elementen, en RNA polymerase toegang targetengenen. Herinrichting van de epigenetische landschap via wereldwijde chromatine modificaties is een belangrijk onderdeel om opnieuw uitdrukking van de pluripotency genetisch programma. Een specifieke chromatine modificatie dat belangrijk is bij de regulatie van genexpressie acetylering van histonen op bepaalde lysineresten, dat toegang tot genen richten door verminderde spanning van de histon-DNA coil. HDAC remmers zijn kleine moleculen die zijn aangetoond iPSC herprogrammering en hESC zelfvernieuwing ^9,10 verbeteren, waarschijnlijk door het ondersteunen van de geacetyleerde toestand ^11. De hieronder beschreven protocol, aangepast van een voorafgaande publicatie met integratie lentivirussen ^12, wordt stap voor stap methode voor optimale iPSC generatie uit perifeer volbloed met behulp episomen en HDAC inhibitoren. De HDAC inhibitor concentraties die hier gebruikt zijn de helft van die beschreven door Ware et al. ⁹ en routinematig tot een 2-voudige toename in volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies op standaardepisomale herprogrammering protocollen zonder HDAC inhibitoren. Dit niveau van herprogrammering is op gelijke voet met de efficiëntie die we waarnemen met lentivirale methoden. Met dit protocol, hebben we snel gemaakt iPSC van individuen zo oud als 87 jaar.

Protocol

Informed consent, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Boards van het Fred Hutchinson Cancer Research Center en het Children "s Hospital van Philadelphia, werd verkregen van patiënten voor het verzamelen van perifere bloedmonsters. Alle institutionele richtlijnen werden waargenomen. Alle dierlijke experimenten, inclusief MEF generatie en teratoma vorming werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Ficoll Scheiding van PBMC's en uitbreiding van erytroblasten - Dag 0

1. Verdun perifeer bloed 1: 1 met Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). In een 15 ml ronde bodem polystyreen buis, zorgvuldig laag 7 ml verdunde bloed op 3 ml kamertemperatuur Ficoll- Hypaque-.
2. Centrifugeer het monster bij 400 xg gedurende 30 min.
3. De PBMCs zal geregeld tot de interface tussen het plasma en de Ficoll-Hypaque, beschouwd als een troebele witte laag. Met behulp van een steriele transferpipet, het verzamelen van de PBMCs in een 15 ml conische buis. Breng het volume op 10 ml met behulp van DPBS.
4. Met behulp van een hemacytometer, tel de PBMCs.
5. Pipetteer 2 x 10 ⁶ PBMC in een afzonderlijke 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Spin de resterende cellen en bevriezen bij een concentratie van 2 x 10 ⁶ PBMC / ml in 90% foetaal runderserum (FBS) / 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
6. Bereid Uitbreiding Medium: QBSF-60 serumvrij medium (beschermd tegen licht) + penicilline / streptomycine (1%) + ascorbinezuur (50 ng / ml) + stamcelfactor (SCF, 50 ng / ml) + interleukine 3 (IL 3, 10 ng / ml) + erytropoëtine (EPO, 2 U / ml) + insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexamethasone (1 uM; bescherming tegen licht, ontdooien eenzelfde hoeveelheid elke media veranderen).
7. Resuspendeer 2 x 10 ⁶ PBMCs in 2 ml vers medium Expansie en plaats in een putje van een 12 well weefselkweek plaat en incuberen in een 37 ° C bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% _O2, 5% _CO2 en 90% _N2.
8. Op dag 3 en dag 6, vervang media.
   1. Verzamel de cellen en was het goed met 2 ml QBSF-60 om eventuele resterende cellen te verzamelen.
   2. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant.
   3. Resuspendeer de cellen in 2 ml van nieuwe Expansion Medium en hen terug te keren naar dezelfde 12 wells plaat.

2. herprogrammeren cellen door Nucleofection - Dag 9

1. Pipetteer de herprogrammering plasmiden in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis (Tabel 1).
2. Meng de nucleofectie oplossing met Supplement (door de fabrikant meegeleverd) en pipet in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis.
3. Pipetteer 2 ml Uitbreiding Medium in een putje van een 12 putjesplaat en in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% _O2, 5% _CO2 en 90% _N2) evenwichtstoestand voorafgaand aan het toevoegen cellen.
4. Verzamel degekweekte cellen en was het goed met 2 ml QBSF-60 resterende cellen te verzamelen.
5. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant.
6. Was de cellen door resuspenderen in 5 ml DPBS en centrifugeren bij 300 xg gedurende 5 minuten.
7. Zuig de supernatant.
8. Resuspendeer de cel pellet in 100 ul nucleofectie oplossing + Supplement, en zorg ervoor dat het genereren van luchtbellen te vermijden.
9. Pipetteer de celsuspensie in de buis met het herprogrammeren plasmiden, pipet op en neer eenmaal, pipet en het monster in de bodem van de nucleofection cuvette.
10. Plaats de cuvette in de nucleofectie machine en run Programma T-019.
11. Breng 100 pi van het voorverwarmde Expansion Medium (equilibreren van de plaat in stap 2.3) in de nucleofection cuvette.
12. Onmiddellijk verzamel de volledige steekproef en storting in de put van de voorverwarmde Expansion Medium. Vermijd het verzamelen van de witte, drijvende dode cel puin.
13. Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% _O2, 5% _CO2 en 90% _N2) voor groei.

3. Plating Feeder Cellen - Dag 10 of 11

1. Op dag 10, plaat feeder cellen.
   1. Coat een 6 well weefselkweek plaat met gelatine.
      1. Pipetteer 1 m van 0,1% gelatine in Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) in elk putje van de plaat.
      2. Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator gedurende ten minste 5 min.
      3. Vlak voor het gebruik, zuig het gelatine-oplossing van de plaat.
   2. Ontdooien één flacon 2 x 10 ⁶ muis embryonale fibroblasten bestraald 3000 cGy in 10 ml voorverwarmde MEF Media (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicilline / streptomycine (1%)).
   3. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen in 12 ml van MEF Media en pipet 2 ml into elk putje van de gelatine beklede plaat met 6 putjes. Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% _O2, 5% _CO2 en 90% _N2) tot dag 12.

4. Plating Cellen op Voeder Cellen en wijzigen Medium - Dag 12

1. Verzamel de nucleofected cellen in een 15 ml conische buis en laat de resterende cellen door het behandelde goed met 2 ml QBSF-60. Centrifugeer het monster bij 300 xg gedurende 5 minuten.
2. Bereid herprogrammeren Medium: Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) + FBS (10%) + niet-dierlijke L-glutamine (1 mM) + niet-essentiële aminozuren (NEAA, 1%) + penicilline / streptomycine (1%) + β mercaptoethanol (0,1 mM) + basische fibroblast groeifactor (bFGF toegevoegd aan verse voeding, 10 ng / ml) + ascorbinezuur (vers toegevoegd invoersysteem, 50 ug / ml).
3. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 12 ml Medium herprogrammeren. Pipetteer 2 ml per putje van de celsuspensie inde 6 wells plaat van feeder-cellen (zoals bereid in hoofdstuk 3). Centrifugeer de plaat bij 50 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
4. Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% _O2, 5% _CO2 en 90% _N2) voor groei. Verander het herprogrammeren Medium om de andere dag, totdat iPSC kolonies beginnen te zien zijn (1-2 weken).
5. Bereid hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum vervangen (20%) + penicilline / streptomycine (1%) + NEAA (1%) + niet-dierlijke L-glutamine (1 mM) + natriumpyruvaat (1%) + natriumbicarbonaat (0,12%) + β-mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (vers toegevoegd invoersysteem, 10 ng / ml)
6. Bereid HDAC-remmers: natriumbutyraat (verse toegevoegd bij het voeden, 100 uM), suberanilohydroxamic zuur (SAHA, toegevoegd fris bij het voeden, 200 nm). Zodra iPSC kolonies verschijnen beginnen voeden van de cellen met hESC Medium + HDAC remmers veranderen medium elke dag.
   OPMERKING: Natrium butyraat is een klein molecuul dat is geadsorbeerd aan kunststof buizen, therefore opslaan in een borosilicaat glazen buis bij 4 ° C.

5. Isoleren iPSC Clones

1. Zodra iPSC kolonies groot genoeg te isoleren (20-25 cellen), pak ze met een P20 pipet.
2. Bereid HDAC-remmers: natriumbutyraat (verse bij voeding toegevoegd, 100 uM), SAHA (toegevoegd fris bij het voeden, 200 nm)
3. Plaats de geïsoleerde kolonies op iMEFs in individuele 35 mm schalen met hESC Medium + HDAC-remmers + Klonen & Recovery Supplement.
4. De dag na het plukken van de kolonies, verander de middellange tot hESC Medium + HDAC-remmers.
5. Verander het medium elke dag tot iPSC kolonies zijn klaar voor passage.
6. Verwijder HDAC-remmers uit het medium eenmaal kolonies stabiliseren op passage 2-3.

Resultaten

Drie dagen na nucleofection en voor electroplating de nucleofected cellen op iMEFs, de efficiency van de succesvolle nucleofection worden geschat door fluorescentie microscopie eGFP. Figuur 1 toont een typische nucleofection experiment met ongeveer 5-10% van de totale celpopulatie EGFP.

Geherprogrammeerd iPSC kolonies zal beginnen om ongeveer twee weken verschijnen nadat nucleofectie. De kolonies zijn meestal rond met goed gedefinieerde grenzen en kunnen worden geïdentificee...

Discussie

Voor succesvolle iPSC genereren bij gebruik van dit protocol, zijn er verschillende belangrijke uitgangspunten dat moet worden overwogen. Tijdens de erythroblast uitbreidingsfase, moeten de media verandering schema strikt worden gevolgd, als afwijkingen kunnen leiden tot inefficiënte stimulatie van de doelgroep voorlopercellen cel populatie en een lagere efficiëntie van iPSC generatie. Het is belangrijk om nieuwe uitbreiding medium met verse dexamethason met elke media verandering te maken; en de QBSF-60 base medium en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Bewaar bij 4 °C. Verwarm tot kamertemperatuur voor gebruik.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Bewaar bij 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Bewaar bij 4 °C.
foetaal bovien serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Bewaar bij -20 °C tot het nodig is. Ontdooi, verdeel in aliquoten, bewaar bij 4 °C.
dimethyl sulfaat (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Bewaar bij kamertemperatuur.
QBSF-60 serum-vrij medium	Fisher Scientific	50-983-234	Bewaar bij 4 °C.
penicilline/streptomycine	Life Technologies	15140122	Bewaar bij 4 °C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Bewaar bij 4 °C.
2% gelatine-oplossing	Sigma-Aldrich	G1393	Bewaar bij 4 °C, smelt in 37 °C waterbad voor gebruik.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Bewaar bij 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Bewaar bij 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Bewaar bij 4 °C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C.
niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Bewaar bij 4 °C, uit de buurt van licht.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Bewaar bij 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C.
natriumpyruvaat, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Bewaar bij 4 °C.
natriumbicarbonaat, 7,5%	Life Technologies	25080094	Bewaar bij 4 °C.
basische fibroblasten groeifactor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Maak 10 mg/ml stock in DPBS, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
natriumbutyraat	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Maak 2000x stock (400 mM) in DPBS, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Bewaar bij -20 °C tot het nodig is. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
ESC-gekwalificeerde BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Ontdooi een nacht op ijs bij 4 °C, verdeel in aliquoten in voorgekoelde buisjes met behulp van voorgekoelde pipetten. Bewaar bij -20 °C tot het nodig is. Ontdooi bij 4 °C, gebruik onmiddellijk.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C.
ascorbinezuur, poeder	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Maak 5 mg/ml stock in DPBS, sterieel filter, bewaar bij 4 °C.
recombinant humaan stamcelfactor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Maak 100 µg/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
recombinant humaan interleukine 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Maak 100 µg/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
erytropoëtine (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Maak 1000 U/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
recombinant humaan insuline-achtig groeifactor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Maak 100 µg/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Maak 1000x stock (100 mM) in DPBS.
dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Maak 50x stock (50 µM) in DPBS, sterieel filter, bewaar bij 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Maak 2000x stock (400 mM) in DPBS, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.
12 wels tissuecultuurplaat	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml conische buis	Sarstedt	62553002
1,5 ml Eppendorfbuis	Fisher Scientific	05-408-129
6 wels tissuecultuurplaat	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tissucultuurplaten	BD Biosciences	353001
10 ml wegwerp serologische pipetten	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml wegwerp serologische pipetten	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml wegwerp serologische pipetten	Fisher Scientific	13-675-17
20 µl pipettentips, b